ES2751393T3

ES2751393T3 - Composiciones y métodos para la terapia cardíaca

Info

Publication number: ES2751393T3
Application number: ES11820625T
Authority: ES
Inventors: Karen Christman; Jennifer Singelyn; Jessica Dequach; Adam Kinsey
Original assignee: University of California; Ventrix Inc
Current assignee: University of California; Ventrix Inc
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: JP2013536246A; CN103260606A; US9789224B2; JP2017095493A; US20200276360A1; CA2808225C; AU2011293386B2; CN106619723A; EP3610861A1; CA2808225A1; AU2011293386A1; US10456501B2; JP2020193202A; US20180071432A1; US20120156250A1; WO2012027514A3; JP2019038833A; CA3028401A1; WO2012027514A2; EP2608777A4

Abstract

Una composición líquida que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardiaco digerida de manera enzimática, en donde la composición líquida se reconstituye a partir de una composición liofilizada que comprende la matriz extracelular descelularizada digerida de manera enzimática; en donde la composición líquida se transforma en un gel a temperatura corporal; y en donde la composición líquida comprende mucopolisacárido en una concentración de entre 15 y 25 μg por mg de la composición liofilizada.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la terapia cardíaca

Antecedentes de la invención

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en Estados Unidos. La causa más común de enfermedad cardiovascular es el infarto de miocardio (IM), que ocurre cuando se ocluye una arteria coronaria. Aproximadamente un 37 % de los pacientes con IM morirán de insuficiencia cardíaca dentro de un año, y de los que sobreviven, dos tercios no se recuperan por completo. El resultado del IM es la muerte de los cardiomiocitos y la degradación de la matriz extracelular (MEC), seguido de la deposición de cicatrices. Eventualmente, se presenta insuficiencia cardíaca y el corazón se dilata, lo que conduce a una disminución de la eficacia de bombeo. Como hay muy pocos progenitores cardíacos en el corazón, el tejido cardíaco no se regenera. Los tratamientos actuales para la insuficiencia cardíaca dependen en gran medida de los procedimientos quirúrgicos invasivos y hacen poco para reparar el tejido cardíaco dañado.

Los esfuerzos actuales para prevenir la insuficiencia cardíaca después del infarto de miocardio (IM) se han centrado en el trasplante celular para reemplazar los cardiomiocitos necróticos, prevenir la remodelación negativa del ventrículo izquierdo (VI) y regenerar o reparar el tejido cardíaco. Sin embargo, sin la matriz adecuada, el crecimiento de cardiomiocitos in vitro y la supervivencia in vivo han sido deficientes. Existe una necesidad de una forma de gel o solución de matriz extracelular cardíaca para la reparación cardíaca, el tratamiento de la arritmia y el cultivo celular.

La solicitud de patente WO 2010/039823 A2 desvela una composición que comprende una matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco, siendo la composición inyectable a través de una aguja 27G o más pequeña. La composición gelifica a una temperatura superior a 25 °C y comprende pepsina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición líquida que comprende una matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco digerida de manera enzimática, en donde la composición líquida se reconstituye a partir de una composición liofilizada que comprende la matriz extracelular descelularizada digerida de manera enzimática; en donde la composición líquida se transforma en un gel a temperatura corporal; y en donde la composición líquida comprende mucopolisacárido en una concentración de entre 15 y 25 |jg por mg de la composición liofilizada.

En el presente documento también se describe una composición que comprende un material con un tamaño de poro de aproximadamente 30 a 40 micras, en donde el material es inyectable a través de un catéter con un diámetro interno de 25 G o menor.

En algunos casos, la composición de la invención comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco; y agua, o una solución salina.

En algunos casos, la composición está en forma de gel dentro de los 30 minutos posteriores a la administración al tejido in vivo. En algunos casos, el material comprende además al menos una enzima digestiva. En algunos casos, la al menos una enzima digestiva escinde la matriz de modo que la composición gelifica a más de 20, 25, 30 o 35 °C. En algunos casos, la al menos una enzima digestiva escinde la matriz de manera que la composición gelifica en menos de 30, 20, 10, 5 o 1 minuto. En algunos casos, la al menos una enzima digestiva es pepsina.

El material puede proceder del tejido ventricular, además el material puede proceder del tejido ventricular izquierdo. En algunos casos, el material comprende además un factor de crecimiento, un polímero sintético, un polímero derivado naturalmente o una combinación de los mismos. En algunos casos, el material comprende además celulosa. En algunos casos, el material comprende pegamento de fibrina.

En algunos casos, el material comprende factores que promueven la supervivencia de los cardiomiocitos endógenos y las células cardíacas, factores que previenen la apoptosis de los cardiomiocitos endógenos y las células cardíacas, factores que promueven la neovascularización, factores que promueven la infiltración celular, factores que alteran la respuesta inmunitaria, factores que alteran la respuesta inflamatoria, o una combinación de los mismos.

También se describe una composición que comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco; alginato; y agua.

En un aspecto, una composición comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco, en donde la matriz comprende material de un peso molecular de menos de 300 kDa, menos de 200 kDa, menos de 100 kDa, menos de 50 kDa o menos de 20 kDa. En un aspecto, una composición comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco, en donde la matriz comprende material no acuoso de un peso molecular de menos de 300 kDa, menos de 200 kDa, menos de 100 kDa, menos de 50 kDa o menos de 20 kDa. En un aspecto, una composición comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco, en donde la matriz comprende material de un peso molecular en un intervalo con un límite superior de 300 kDa, 200 kDa, 100 kDa, 50 kDa, o 20 kDa y un límite inferior de 0,5 kDa, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa o 20 kDa.

También se describe una composición que comprende: una matriz extracelular descelularizada liofilizada procedente de tejido cardíaco; y mucopolisacárido, en donde la composición comprende mucopolisacárido en la cantidad de al menos 5, 10 o 15 |jg por mg de la matriz liofilizada. La composición de acuerdo con la invención comprende mucopolisacárido en una cantidad de entre aproximadamente 15 y 25 jg por mg de la matriz liofilizada.

En otro aspecto más, se desvela un dispositivo de cultivo de tejidos que comprende: una composición que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco; y un sustrato. El sustrato puede ser una placa de cultivo de tejidos. La matriz puede tener la forma de un molde. En algunos casos, la matriz se moldea a la forma del sustrato. Las formas ejemplares pueden ser las de productos biomédicos, tales como endoprótesis vasculares o catéteres. Otras formas pueden incluir aquellas configuradas para dar forma al corazón in vivo. El sustrato puede ser celulosa. En algunos casos, la celulosa está en forma para implantarse en un sujeto. En algunos casos, el dispositivo comprende además un medio de cultivo de tejidos. En algunos casos, la forma es una forma de cultivo de tejido tal como, sin limitación, un plato, un vial, una placa de Petri, una placa, un pocillo y una placa de paredes múltiples.

En un aspecto, se describe en el presente documento un método de fabricación de una composición, comprendiendo el método: (a) descelularizar tejido cardíaco; (b) liofilizar el tejido cardíaco descelularizado; (c) digerir el tejido liofilizado; (d) liofilizar el tejido digerido; (e) almacenar el tejido digerido durante hasta 6 meses a una temperatura de menos de 25 °C, (por ejemplo, menos de 0 °C, menos de -20 °C o menos de -70 °C); y fabricar una composición mediante la incorporación del tejido digerido liofilizado con un líquido que comprende mucopolisacárido en una concentración de 15 a 25 jg por mg del tejido digerido liofilizado.

También se describe un método para reparar tejido cardíaco que consiste en inyectar o implantar en un sujeto una composición que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco. En algunos casos, dicha composición se inyecta o implanta antes de un mes después del infarto de miocardio. En algunos casos, dicha composición se inyecta o implanta antes de dos semanas después del infarto de miocardio. En algunos casos, dicha composición se degrada dentro de los tres meses después de la inyección o implantación. En algunos casos, dicha composición se degrada dentro de un mes después de la inyección o implantación. En algunos casos, la inyección o implantación de dicha composición repara un defecto congénito. En algunos casos, la inyección o implantación de dicha composición repara el daño al tejido cardíaco sufrido por dicho sujeto. El daño puede ser un infarto de miocardio.

Breve descripción de los dibujos

Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan muchos principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

La Figura 1 ilustra un método ejemplar para administrar una composición en el presente documento.

La Figura 2 ilustra varias realizaciones de métodos y composiciones descritos en el presente documento.

La Figura 3 demuestra datos de la inyección de una composición en el presente documento en un corazón de rata.

La Figura 4 ilustra algunos pasos ejemplares de un método de fabricación de una composición como se describe en el presente documento.

Descripción detallada

Los procedimientos recientemente investigados utilizan la inyección de células sanas en la pared del infarto del ventrículo izquierdo (VI) en un intento de regenerar y reparar el miocardio, aunque los estudios han demostrado una pobre supervivencia de las células inyectadas. Las células (incluidas las células madre adultas y embrionarias, las células madre pluripotentes inducidas y las células diferenciadas como los cardiomiocitos) se han cultivado normalmente en superficies o armazones recubiertos con una o algunas proteínas de la matriz extracelular (MEC). No obstante, in vivo, estas células existen en un medio extracelular altamente complejo; y una MEC que imita más estrechamente este entorno natural puede ser beneficioso para la supervivencia y la función/maduración de células cultivadas in vitro e in vivo.

Actualmente se están investigando algunos materiales derivados de forma natural para inyección en el miocardio, incluidos fibrina, colágeno, alginato, matrigel y gelatina. Ninguno de estos proporciona una cantidad significativa de los componentes naturales de la matriz extracelular del corazón. Para el tratamiento de la arritmia, las formas no ablativas actuales incluyen la inyección de alginato, fibrina y células. Las matrices existentes para el cultivo celular in vitro para cardiomiocitos, células madre y otras células cardíacas relevantes incluyen colágeno, laminina, SureCoat (Cellutron, mezcla de colágeno y laminina), Matrigel y gelatina.

Existe una necesidad de desarrollar nuevas terapias para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal. Actualmente, los tratamientos comunes son el trasplante de corazón, los dispositivos de asistencia ventricular izquierda (VI) y/o los regímenes farmacéuticos actuales. Estos tratamientos no previenen adecuadamente la remodelación negativa del VI después del infarto de miocardio (IM). La cardiomioplastia celular, o trasplante de células, se ha explorado para el tratamiento del infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca; sin embargo, más recientemente, los biomateriales acelulares han demostrado ser muy prometedores al proporcionar un beneficio funcional similar sin las complicaciones asociadas con la administración celular. Los productos de biomaterial para la terapia cardíaca se han limitado porque pocos se han fabricado específicamente para el miocardio. Los materiales actualmente bajo investigación para inyección en el miocardio incluyen, sin limitación, fibrina, colágeno, alginato, matrigel y gelatina.

En algunos casos, una composición como se describe en el presente documento comprende sustancialmente todos los constituyentes de la MEC cardíaca. En algunos casos, una composición comprende sustancialmente todos los componentes de la MEC cardíaca en proporciones similares encontradas in vivo. Las proteínas, glucoproteínas y proteoglucanos de la MEC pueden incluir, sin limitación: colágeno de tipo I, III, IV, V y VI, elastina, fibrinógeno, lumicano, perlecano, fibulina y/o laminina. En algunos casos, una composición como se describe en el presente documento comprende un 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 % o más de todos los constituyentes de la MEC cardíaca en proporciones similares encontradas in vivo. En algunos casos, se utiliza un mimético de MEC. Por ejemplo, la MEC artificial se puede producir mediante la combinación de componentes individuales de MEC de origen natural o que se producen de forma artificial de modo que las proporciones de los componentes individuales imiten las proporciones encontradas en la MEC de origen natural.

MEC incluye matriz intersticial y los materiales de membrana basal. En algunos casos, una composición que comprende la MEC se compone de una malla entrelazada de proteínas fibrosas y mucopolisacáridos (GAG). Los GAG son polímeros de carbohidratos y generalmente están unidos a proteínas de la matriz extracelular para formar proteoglucanos. Los ejemplos de fibras de la MEC que pueden incluirse en una composición en el presente documento incluyen, sin limitación, perlecano, agrina y colágeno de todos los tipos, incluidos: fibrilar (Tipo I, II, III, V, XI); facit (Tipo ^{IX, XII, XIV); de cadena corta (Tipo VIII, X), de membrana basal (Tipo IV) y otros (Tipo VI,}V ⁱI, ^XIII).

En el presente documento se describen composiciones que comprenden MEC de corazón para inyección en tejido cardíaco. En algunos casos descritos en el presente documento, se proporciona una forma de gel inyectable de una composición procedente de una matriz extracelular (MEC) natural del corazón. El gel también se puede usar solo para reclutar células en el tejido lesionado o como un vehículo de administración de fármacos. El gel también se puede usar para soportar el tejido lesionado o cambiar las propiedades mecánicas. Otro uso de la invención es como un bloqueo de conducción no destructivo para tratar arritmias. En algunos casos, el material de la MEC cardíaca o del corazón como se describe en el presente documento procede del tejido miocárdico. En algunos casos, una composición procede del tejido ventricular. En algunos casos, una composición procede del tejido ventricular izquierdo. En algunos casos, una composición puede proceder del tejido ventricular izquierdo y ventricular derecho. En algunos casos, una composición puede proceder de tejido pericárdico autólogo, que puede obtenerse de forma no invasiva. En otros casos, el material de la MEC cardíaca o del corazón como se describe en el presente documento procede del tejido pericárdico.

La composición se puede usar para administrar células a la pared del infarto después de un infarto de miocardio.

En algunos casos, una composición en el presente documento imita la matriz extracelular (MEC), por ejemplo, la MEC que puede haber sido dañada por el infarto. La composición puede proporcionar señales complejas de la MEC específicas del miocardio, que promueven la reparación. Las composiciones en el presente documento están configuradas para ser administradas mediante tecnología de catéter.

La MEC natural del corazón puede tener más componentes que los recubrimientos celulares tradicionales y, por lo tanto, puede demostrar una mezcla más compleja de componentes de la MEC en comparación con el colágeno y la laminina. En algunos casos, las composiciones preparadas como una matriz en el presente documento pueden imitar la MEC de corazón natural. Las composiciones preparadas en el presente documento pueden aumentar la tasa de supervivencia o crecimiento de los cardiomiocitos. Las composiciones preparadas en el presente documento pueden usarse para cultivar células en placas, tales como cultivos de cardiomiocitos. En algunos casos, en el presente documento, los cultivos sembrados en las composiciones comienzan a latir. En algunos casos, en el presente documento, las células sembradas en las composiciones continúan latiendo más tiempo que las células cultivadas en colágeno solo. Por ejemplo, en el presente documento, las células sembradas en las composiciones pueden continuar latiendo más de 10, 14, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 70, 80, 90 o 100 días.

En algunos casos, en el presente documento, las células que crecen en las composiciones tienen cantidades incrementadas de actinina, conexina 43 o pan-cadherina. En el presente documento, las células que crecen en las composiciones pueden tener una mayor capacidad de supervivencia en comparación con las células que crecen en colágeno. También, en el presente documento, las células que crecen en las composiciones pueden tener una mayor unión a la composición en comparación con las células que crecen en colágeno a colágeno.

En algunos casos, las composiciones proporcionadas en el presente documento comprenden una variedad de proteínas de la MEC, después de la descelularización. Las proteínas, glucoproteínas y proteoglucanos de la MEC pueden incluir, pero sin limitación: colágeno de tipo I, III, IV, V y VI, elastina, fibrinógeno, lumicano, perlecano, fibulina o laminina. Por lo tanto, la MEC miocárdica descelularizada puede comprender una combinación compleja de proteínas y proteoglucanos.

En algunos casos, en el presente documento, las composiciones se proporcionan en forma inyectable. Un polvo de matriz descelularizada puede digerirse para solubilizar o incorporar de otro modo el producto en un líquido. En algunos casos, el producto incorporado comprende mucopolisacáridos (GAG). Por ejemplo, la composición puede comprender un contenido de mucopolisacáridos (GAG) de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 |jg por mg de matriz liofilizada o superior.

En algunos casos, una composición en el presente documento comprende componentes de la MEC específicos de miocardio. En un caso, la composición es un hidrogel inyectable procedente de la MEC miocárdica natural. En algunos casos, la composición no comprende sustancialmente ningún antígeno celular. En algunos casos, la composición no produce una respuesta inmunológica en un sujeto. En algunos casos, la composición se administra al sujeto antes, simultáneamente o después de la terapia inmunosupresora. En algunos casos, no se usa la terapia inmunosupresora.

En algunos casos, las composiciones descritas en el presente documento están configuradas para proporcionarse para terapia de una manera comercial. En un ejemplo, una composición en el presente documento está en forma sólida seca y puede almacenarse en un estante o en una habitación o unidad, y luego solubilizarse con agua, solución salina u otra solución líquida inmediatamente antes del tratamiento.

En el presente documento se describe una composición que comprende un material específico para el miocardio que se puede administrar a través de un catéter para promover la reparación en el entorno posterior al IM. La composición comprende una mezcla compleja de proteínas, péptidos y polisacáridos de la MEC ventricular. En muchos casos, la composición es líquida a temperatura ambiente y forma un armazón poroso y fibroso tras la inyección en el miocardio. La composición promueve la entrada de células y preserva la geometría del VI y la función cardíaca cuando se administra in vivo a un infarto de miocardio.

En algunos casos, una composición como se describe en el presente documento puede ayudar a regenerar o reparar el miocardio defectuoso o ausente y restaurar la función cardíaca. En el presente documento, una composición de matriz extracelular inyectable puede proceder de una fuente de mamífero o sintética. La composición puede comprender además células. Una composición de matriz extracelular en el presente documento puede comprender además un componente adicional, por ejemplo, sin limitación: una célula, un péptido, polipéptido o proteína, un ácido nucleico tal como un polinucleótido u oligonucleótido, ADN, ARN, un vector que expresa un ADN de una molécula bioactiva, polímero u otro material, reticuladores y otros aditivos como nutrientes o moléculas de fármacos. Se puede incluir un componente adicional en la composición o varios. En algunos casos, el componente adicional es un fármaco. En algunos casos, el fármaco se administra como parte de la composición de matriz extracelular o como un componente de una solución inyectada de MEC; en algunos casos, el fármaco se administra simultáneamente, antes o después de la administración de una composición descrita en el presente documento. Los ejemplos de fármacos incluyen, sin limitación: medicamentos para la presión arterial o la hipertensión (por ejemplo, inhibidores de ACE, agonistas alfa, alfabloqueantes, bloqueantes del receptor de la angiotensina II, diuréticos o bloqueantes de renina); antiarrítmicos (por ejemplo, bloqueadores de los canales de sodio, betabloqueantes, bloqueantes de los canales de potasio, bloqueantes de los canales de calcio); fármacos para reducir el colesterol (por ejemplo, estatinas, colestiramina); diluyentes de la sangre o anticoagulantes (por ejemplo, aspirina, aprotinina, clopidogrel, enoxaparina, heparina, warfarina, etexilato de dabigatrán); medicamentos que controlan la frecuencia cardíaca (por ejemplo, preparaciones de digitalis); y/o vasodilatadores (por ejemplo, nitroglicerina).

En un aspecto, una composición como se describe en el presente documento comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco; y agua. En algunos casos, la composición comprende además solución salina. Una composición en el presente documento puede comprender MEC descelularizada procedente de tejido cardíaco y una solución líquida en la que la MEC descelularizada es miscible.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden comprender una serie de factores o señales in vivo, incluyendo, pero sin limitación: factores que promueven la neovascularización, tales como VEGF y bFGF; factores que promueven la infiltración celular, tales como SDF; factores que alteran la respuesta inmunitaria; factores que alteran la respuesta inflamatoria, tales como la IL-10; factores que promueven la supervivencia de los cardiomiocitos endógenos y las células cardíacas; y factores que previenen la apoptosis de los cardiomiocitos endógenos y las células cardíacas.

En algunos casos, se describen métodos de administración en donde la composición puede ponerse en contacto con el miocardio defectuoso o ausente, lo que da como resultado la regeneración del tejido miocárdico y la restauración de la contractilidad, la conductividad o la función del músculo cardíaco. En algunos casos, en el presente documento, una composición puede reclutar células endógenas y puede coordinar la función de las células recién reclutadas o añadidas, permitiendo también la migración y proliferación celular dentro de la composición. Como se describe en el presente documento, en algunos casos, la composición puede ayudar a la reparación del tejido miocárdico. En algunos casos, dicha reparación implica la restauración del tejido cardíaco y/o características específicas del tejido cardíaco, tales como estrías, túbulos en T o discos intercalados.

Las composiciones que comprenden armazones de matriz extracelular natural se han preparado para su uso en mamíferos en procedimientos de injertos de tejido. Los ejemplos de la matriz MEC incluyen, sin limitación: submucosa del intestino delgado (SID), tales como los armazones descritos en la patente de EE.UU. N.° 5.275.826, submucosa vesical urinaria (SVU), tales como los armazones descritos en la patente de EE.UU. N.° 5.554.389, submucosa estomacal (SE), tales como los armazones descritos en la patente de EE.UU. N.° 6.099.567 y submucosa hepática (SH) o membrana basal hepática (MBH) tales como los armazones descritos en la patente de EE.UU. N.° 6.379.710. Además, el colágeno de fuentes de mamíferos puede recuperarse de tejidos que contienen matriz y usarse para formar una composición de matriz. Las matrices extracelulares también se pueden sintetizar a partir de cultivos celulares. La descelularización del corazón se ha publicado con el fin de volver a crecer un corazón completo (Ott et al, Nature Medicine, 2008). También se ha descrito una forma de gel inyectable de matriz de vejiga porcina (Freytes et al., Biomaterials, 2008).

En el presente documento, se desvela un material biocompatible que comprende una matriz extracelular cardíaca descelularizada procedente directamente del tejido cardíaco natural, y se usa para tratar tejidos u órganos defectuosos, enfermos, dañados o isquémicos en un sujeto, preferentemente, un ser humano, mediante la inyección o implantación del material biocompatible que comprende la matriz extracelular cardíaca descelularizada en el sujeto. En algunos casos, el material se administra a un sujeto animal no humano.

La Figura 1 ilustra un método ejemplar para administrar una composición en el presente documento. La Figura 1 proporciona un flujo de eventos, desde infarto de miocardio, hasta la introducción de una composición descrita en el presente documento, que da como resultado resultados como un aumento de la regeneración, disminución del tamaño del infarto, reducción de la remodelación del VI y mejora de la función cardíaca.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra varias realizaciones de métodos y composiciones proporcionadas en el presente documento. En algunos casos, se recupera un tejido de un animal, 201. El tejido puede ser tejido cardíaco, por ejemplo, tejido miocárdico, pero también puede ser otro tipo de tejido. En el presente documento se describen varias etapas de procesamiento del tejido, 202. Por ejemplo, el tejido puede descelularizarse, liofilizarse, digerirse y solubilizarse en un líquido deseado o procesarse alternativamente a través de cualquier combinación de las etapas descritas en el presente documento. Como resultado, se forma un producto de matriz basado en MEC; en algunas realizaciones, el producto de matriz basado en MEC es inyectable. En diversas realizaciones, el producto de matriz basado en MEC imita la MEC del tejido dañado en el sujeto, por ejemplo, una MEC miocárdica de un paciente con un infarto de miocardio.

En algunas realizaciones, el producto de matriz basado en MEC puede moldearse en una forma particular y luego trasplantarse o introducirse en un sujeto. El producto de matriz basado en MEC puede moldearse en una matriz de soporte de una forma deseada, por ejemplo, en forma de un catéter, una endoprótesis vascular, un injerto, un parche o similar, que puede ser adecuado para trasplante o introducción en un área deseada en un sujeto (por ejemplo, miocardio). Las células (por ejemplo, células de partida) pueden plantarse o cultivarse opcionalmente en el producto de matriz moldeado basado en MEC, 204. Se puede preparar un producto de parche, injerto o gel o una construcción de trasplante similar mediante el método descrito en el presente documento, 205. La construcción de trasplante se puede trasplantar o introducir en un área dañada en un sujeto, 206. En algunas realizaciones, el trasplante (o introducción) promueve el crecimiento celular o la supervivencia en el área o puebla de otro modo el área dañada con células; a menudo, el crecimiento celular o tisular ocurre directamente en la matriz basada en MEC.

Algunas realizaciones se refieren a productos de matriz basados en MEC que imitan la MEC, por ejemplo, la MEC miocárdica, 202, y métodos para reparar el tejido dañado o prevenir el daño en un tejido con el uso del mismo. En muchos casos, el producto de matriz basado en MEC se inyecta, se trasplanta o se introduce de otro modo en un tejido dañado, por ejemplo, un miocardio dañado, un infarto de miocardio, 207. En algunos casos, se permite que se forme un gel antes o después de la inyección. En algunas realizaciones, la formación de gel ocurre después de que la solución entre al sujeto, 208. La formación de gel puede depender de un cambio de temperatura, por ejemplo, un cambio a la temperatura corporal o un cambio a una temperatura de aproximadamente 37 °C. Las células, tales como las células endógenas, pueden poblar el producto de matriz basado en MEC, 211. Opcionalmente, las células se inyectan o se introducen de otro modo en o cerca del sitio de inyección o trasplante del producto de matriz basado en MEC, 209. En diversas realizaciones, el producto de matriz basado en MEC imita la MEC del tejido dañado y, por lo tanto, promueve el crecimiento celular, la diferenciación o el retorno al área dañada, 210. En algunos casos, como resultado, el área dañada está poblada por células, 211 (a menudo el crecimiento celular ocurre directamente en el producto de matriz basado en MEC). En diversas realizaciones, el producto de matriz basado en MEC se degrada después de un tiempo suficiente para poblar el área dañada con células, 212.

La presente divulgación proporciona además composiciones y métodos para hacer crecer cultivos de tejidos en pocillos de cultivo de tejidos, 213. Un producto de matriz basado en MEC generado usando los métodos y composiciones descritos en el presente documento, puede usarse para recubrir un pocillo de cultivo de tejidos. Se pueden cultivar células de diversos tipos en dichos pocillos de cultivo recubiertos. Por ejemplo, los cardiomiocitos pueden cultivarse en pocillos recubiertos con producto de matriz basado en MEC, 215. En algunas realizaciones, las células madre pluripotentes, las células madre multipotentes o las células precursoras de cardiomiocitos se cultivan en los pocilios recubiertos, 214. El producto de matriz basado en MEC puede entonces alentar o permitir que las células cultivadas se diferencien en células de un tejido específico, por ejemplo, el recubrimiento puede generarse usando producto de matriz basado en MEC procedente de tejido miocárdico y puede alentar a las células a diferenciarse en cardiomiocitos, 216.

En aún otras realizaciones, se puede usar un producto de matriz basado en MEC generado a partir de MEC creada artificialmente. En dichos casos, dicho producto de matriz basado en MEC puede usarse para recubrir pocillos de cultivo de tejidos, 213, para inyectarse en el miocardio dañado (u otros tipos de tejido dañado), 207, o moldearse en una matriz de soporte de una forma deseada, 203.

Después del infarto de miocardio, las terapias convencionales actuales, tales como los productos farmacéuticos y los dispositivos médicos (o la falta de terapia) son generalmente ineficaces y, eventualmente, conducen a la muerte de los cardiomiocitos, la remodelación negativa del VI, la dilatación del VI y la insuficiencia cardíaca. En el presente documento se describe un método para administrar una composición inyectable. En algunos casos, administrar una composición en el presente documento a un VI puede proporcionar una mayor regeneración, un tamaño de infarto reducido, una remodelación del VI reducida o una función cardíaca mejorada. La forma de solución, la forma de gel y la forma adsorbida de la matriz del corazón proporcionan muchos de los componentes de la MEC natural en proporciones similares encontradas in vivo.

En algunos casos, la matriz extracelular cardíaca descelularizada procede del tejido cardíaco natural seleccionado del grupo que consiste en corazones humanos, corazones porcinos, corazones bovinos o cualquier otro corazón de mamíferos o animales, incluyendo, pero sin limitación, corazón de cabra, corazón de ratón, corazón de rata, corazón de conejo y corazón de pollo. En algunos casos, la matriz extracelular cardíaca descelularizada procede del tejido natural de fuentes embrionarias o fetales de los tejidos como se describe en el presente documento sin limitaciones adicionales.

En otra realización más, el material biocompatible que comprende la matriz extracelular cardíaca descelularizada está en forma de gel o solución inyectable, y puede usarse para la reparación cardíaca mediante trasplante o administración de células en la pared del infarto después de un infarto de miocardio, o el reclutamiento de células en el tejido cardíaco lesionado. En otros casos, el material biocompatible que comprende una MEC cardíaca descelularizada es, por ejemplo, un parche, una emulsión, un líquido viscoso, un gel, fragmentos, partículas, microperlas o nanoperlas.

En otro aspecto desvelado en el presente documento, una composición comprende un material con un tamaño de poro de aproximadamente 30 a 40 micras, en donde el material es biocompatible con tejido cardíaco, y en donde el material es inyectable a través de un catéter con un diámetro interno de 25 G o menor. En algunos casos, el material comprende matriz extracelular descelularizada procedente del tejido cardíaco. En algunos casos, una composición comprende un material con un tamaño de poro de menos de 50 micras.

En algunos casos, una composición en el presente documento promueve la maduración de células implantadas. Por ejemplo, las células inmaduras implantadas en un miocardio dañado pueden implantarse con o poco después de la administración de una composición de matriz como se describe en el presente documento, en donde la composición de matriz promueve la maduración de las células implantadas. En algunos casos, una composición promueve la diferenciación de células implantadas. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas (iPS, de sus siglas en inglés) pueden implantarse con o poco después de la administración de una composición de matriz; y la composición de matriz actúa para promover la diferenciación de las células iPS. En algunos casos, los factores in vivo también pueden actuar sobre las células iPS para promover la diferenciación, independientemente o junto con la composición de matriz. En otro ejemplo, se implantan células madre embrionarias (ES, de sus siglas en inglés) o células madre adultas junto con, o después de, la administración de una composición de matriz; y las células ES o células madre adultas se diferencian posteriormente en un tipo de célula más maduro. En algunos casos, los factores in vivo también pueden actuar sobre las células ES o las células madre adultas para promover la diferenciación, independientemente o junto con la composición de matriz.

En otro ejemplo más, una composición puede promover la transdiferenciación de células implantadas. Por ejemplo, las células no cardíacas pueden administrarse al sujeto junto con la composición, que promueve la transdiferenciación de las células a un fenotipo cardíaco. En algunos ejemplos, una composición en el presente documento promueve la maduración y/o promueve la diferenciación de las células in vivo. En otro ejemplo, una composición en el presente documento promueve la maduración y/o promueve la diferenciación de células cultivadas in vitro.

En algunos casos, una composición en el presente documento puede comprender además factores de crecimiento que están unidos a polisacáridos en un material de matriz como se describe en el presente documento.

En algunos casos, los materiales biocompatibles (por ejemplo, materiales que no provocan una respuesta inmunitaria en un sujeto) se desvelan para cultivar cardiomiocitos u otras células cardíacas relevantes en laboratorios de investigación, o en un entorno clínico antes del trasplante y para la reparación cardíaca. También se proporcionan métodos para fabricar y recubrir una superficie de placas o pocillos de cultivo de tejidos con matriz extracelular cardíaca descelularizada. Los materiales biocompatibles también son adecuados para la implantación en un paciente.

También se describe en el presente documento un método para producir un material biocompatible que comprende la matriz extracelular cardíaca descelularizada de la invención. Dicho método comprende las etapas de: (a) obtener de un sujeto una muestra de tejido cardíaco que tiene una matriz extracelular y componentes de matriz no extracelular; y (b) procesar la muestra de tejido cardíaco para eliminar el componente de la matriz no extracelular para obtener la matriz extracelular cardíaca descelularizada. En determinadas realizaciones, la muestra de tejido cardíaco se aísla de un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) o un primate (por ejemplo, mono y ser humano), o de una fuente aviar (por ejemplo, pollo, pato, etc.). Los procedimientos de descelularización para la muestra de tejido cardíaco se realizan utilizando una o más técnicas físicas, químicas y/o biológicas.

Para la terapia humana, hay muchas posibles fuentes para el material de matriz extracelular del corazón: corazón humano (incluyendo autólogo, alogénico o cadavérico), corazón porcino, corazón bovino, corazón de cabra, corazón de ratón, corazón de rata, corazón de conejo, corazón de pollo y otras fuentes animales. En algunos casos, la MEC proviene de múltiples animales (por ejemplo, múltiples cerdos) o de múltiples especies de animales (por ejemplo, cerdos más una especie diferente, tal como conejo). A diferencia del trasplante total de corazón, un corazón de un donante podría usarse para tratar a muchas personas. Los animales no humanos serían una fuente de matriz extracelular cardíaca sin la necesidad de donantes humanos. Como reactivo de investigación, se pueden utilizar fuentes animales no humanas (corazón porcino, corazón bovino, corazón de cabra, corazón de ratón, corazón de rata, corazón de conejo, corazón de pollo, etc.). El corazón se descelulariza primero, dejando solo la matriz extracelular y/o proteínas y/o polisacáridos extracelulares.

En una realización, la matriz extracelular del corazón se liofiliza luego, se tritura y se digiere con pepsina a un pH bajo u otras enzimas que degradan la matriz, como las metaloproteinasas de la matriz. En algunos casos, la composición comprende además pepsina. En algunos casos, la composición comprende además una enzima digestiva, por ejemplo, tripsina, quimiotripsina, papaína o una combinación de las mismas. En algunos casos, la composición comprende además una pluralidad de enzimas digestivas como se describe en el presente documento. En el presente documento, se puede seleccionar una enzima o enzimas digestivas para la composición en base a los enlaces peptídicos que escinden la enzima o las enzimas.

En algunos casos, la composición está configurada para gelificar a temperatura corporal (por ejemplo, 37 °C o más). En algunos casos, la composición está configurada para gelificar a más de 20, 25, 30 o 35 °C. En algunos casos, un método de fabricación de una composición como se describe en el presente documento comprende seleccionar una enzima basada en la temperatura deseada de gelificación de la composición. En algunos casos, un método de fabricación de una composición como se describe en el presente documento comprende seleccionar una enzima basada en el tiempo deseado de gelificación de la composición cuando se administra in vivo. En algunos casos, la composición está en forma de gel dentro de los 30, 20, 10, 5, 1 o menos minutos después de la administración al tejido in vivo. En algunos casos, un corazón se descelulariza en un método del presente documento. En algunos casos, dos o más corazones se descelularizan en un método del presente documento. En algunos casos, el tejido cardíaco se obtiene de múltiples animales (por ejemplo, múltiples cerdos) o de múltiples especies animales (por ejemplo, cerdos más una especie diferente, tal como conejo). En un aspecto, se proporciona en el presente documento un método de fabricación de una composición, comprendiendo el método: descelularizar tejido cardíaco; liofilizar el tejido cardíaco descelularizado; digerir el tejido liofilizado con una enzima en un primer líquido; liofilizar el tejido digerido; y fabricar una composición mediante la incorporación del tejido digerido liofilizado con un segundo líquido. En algunos casos, incorporar en un líquido comprende solubilizar. En algunos casos, el método comprende muchas, pero no en todas, de dichas etapas. Por ejemplo, el método puede comprender descelularizar tejido cardíaco, digerir el tejido con una enzima en un primer líquido e incorporar el tejido digerido con un segundo líquido. En algunos casos, el método no comprende la descelularización del tejido cardíaco. En algunos casos, el método no comprende incorporar tejido digerido con un segundo líquido.

En algunos casos, la descelularización se lleva a cabo utilizando una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS, de sus siglas en inglés). En algunos casos, la enzima es una enzima digestiva, por ejemplo, pepsina. En algunos casos, el primer líquido es solución salina tamponada con fosfato (PBS, de sus siglas en inglés), solución salina u otra solución tamponada. En algunos casos, el segundo líquido es agua, por ejemplo, agua estéril y/o agua desionizada, o el segundo líquido puede ser solución salina.

En otro aspecto, una composición comprende: una matriz extracelular descelularizada liofilizada procedente de tejido cardíaco. La matriz liofilizada puede ser miscible en agua, formando así una solución. En algunos casos, la solución es una solución líquida a una temperatura inferior a 25, 20, 15, 10, 5 o 0 °C. En algunos casos, la solución es un gel a una temperatura de más de 20, 30, 35 o 37 °C. En algunos casos, la solución es un líquido cuando el agua se mezcla con la composición y la composición se administra in vivo.

En un caso, una composición en el presente documento demuestra una falta de núcleos, ADN, ARN, cuando se evalúa patológicamente. En otro caso, una composición en el presente documento comprende fracciones de material extracelular cardíaco con bandas de peso molecular por debajo de aproximadamente 20 kDa. En algunos casos, una composición en el presente documento comprende un contenido de mucopolisacáridos de al menos 5, 10 o 15 |jg por mg de la composición liofilizada. En otro caso, una composición en el presente documento comprende un contenido de mucopolisacáridos de entre aproximadamente 15 y 25 |jg por mg de la composición liofilizada.

En algunos casos, un método en el presente documento comprende además liofilizar la composición y almacenar la composición durante hasta 6 meses a una temperatura inferior a 25 °C, inferior a 0 °C, inferior a -20 °C o inferior a -70 °C.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden inyectarse directamente en un sujeto y, por lo tanto, usarse como terapia material. Por ejemplo, la solución que comprende la matriz extracelular del corazón puede neutralizarse y elevarse a la concentración apropiada usando PBS/solución salina u otros tampones. La solución que comprende la matriz extracelular del corazón se puede inyectar a través de una aguja de diámetro pequeño en el miocardio. A temperatura corporal, dicha solución puede formar luego un gel. Las células o fármacos/proteínas también pueden administrarse dentro o con el gel. Por ejemplo, las células no diferenciadas pueden administrarse dentro o con el gel y dichas células pueden diferenciarse posteriormente in vivo. En otros ejemplos, las células diferenciadas parcial o terminalmente se administran dentro o con el gel.

Las composiciones proporcionadas en el presente documento, particularmente, los reactivos de gel, se pueden usar para aplicaciones de cultivo de tejidos. La solución que comprende la matriz extracelular del corazón puede neutralizarse y elevarse a la concentración apropiada usando PBS/solución salina. Dicha solución se puede colocar luego en placas/pocillos de cultivo de tejidos. Una vez colocada en una incubadora a 37 °C o por encima de la temperatura ambiente, la solución forma un gel que puede usarse para el cultivo celular.

En otro aspecto en el presente documento, se proporciona una composición que comprende: matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco, en donde la composición está en forma de un molde. En un ejemplo, la composición es un reactivo in vitro.

En un aspecto, un dispositivo de cultivo de tejidos comprende: una composición que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco. En algunos casos, el dispositivo es una placa de cultivo de tejidos. En algunos casos, la matriz del dispositivo está en la forma de un molde. En algunos casos, el dispositivo comprende además un medio de cultivo de tejidos.

En algunos casos, un método en el presente documento comprende además gelificar la composición en una forma o molde predeterminado. Por ejemplo, la composición puede gelificarse dentro de un plato o placa de cultivo de tejidos, o la composición puede gelificarse para adaptarse a una determinada forma de un molde. Las formas ejemplares pueden ser las de productos biomédicos, tales como endoprótesis vasculares o catéteres. Otras formas pueden incluir aquellas configuradas para dar forma al corazón in vivo. El sustrato puede ser celulosa. En algunos casos, la celulosa está en forma para implantarse en un sujeto. En algunos casos, el dispositivo comprende además un medio de cultivo de tejidos. En algunos casos, la forma es una forma de cultivo de tejido tal como, sin limitación, un plato, un vial, una placa de Petri, una placa, un pocillo y una placa de paredes múltiples.

En otro caso, la composición se gelifica sobre una forma o producto para crear un dispositivo recubierto con la composición. En otro caso, la composición se gelifica en forma o molde y luego se liofiliza. En otro caso, esta forma liofilizada puede implantarse in vivo o usarse como un armazón in vitro, o puede rehidratarse antes de su uso.

En un caso, un método terapéutico para la reparación cardíaca en un sujeto comprende inyectar o implantar en parte o en su totalidad el material biocompatible de la invención. La invención proporciona además un método terapéutico para tratar la arritmia u otro tejido u órgano defectuoso, enfermo, dañado o isquémico en un sujeto que comprende inyectar o implantar el material biocompatible de la invención.

Las composiciones en el presente documento pueden comprender una MEC descelularizada procedente de tejido cardíaco y otro componente o componentes. En algunos casos, la cantidad de MEC en la composición total es mayor que un 90 % o 95 % de la composición en peso. En algunas realizaciones, la MEC en la composición total es mayor que un 1 %, 5 %, 10, %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la composición en peso.

En el presente documento, las matrices extracelulares descelularizadas se preparan de tal manera que gran parte de la bioactividad para la regeneración del tejido miocárdico se conserva. La bioactividad ejemplar de las composiciones en el presente documento incluye, sin limitación: control o iniciación de la adhesión celular, migración celular, diferenciación celular, maduración celular, organización celular, proliferación celular, muerte celular (apoptosis), estimulación de angiogénesis, actividad proteolítica, actividad enzimática, motilidad celular, modulación proteica y celular, activación de eventos transcripcionales, provisión para eventos de traducción, inhibición de algunas bioactividades, por ejemplo, inhibición de la coagulación, atracción de células madre, quimiotaxis y MMP u otra actividad enzimática.

En el presente documento, las composiciones comprenden una matriz que está sustancialmente descelularizada. En algunos casos, una matriz descelularizada no comprende células naturales. En algunos casos, una matriz descelularizada comprende menos de un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % de componentes celulares en peso.

Como se describe en el presente documento, una composición en el presente documento puede comprender una matriz extracelular descelularizada fraccionada procedente del tejido cardíaco. Por ejemplo, una composición en el presente documento comprende un material de matriz con un peso molecular de menos de 300 kDa, menos de 200 kDa, menos de 100 kDa, menos de 50 kDa o menos de 20 kDa. Para otro ejemplo, una composición en el presente documento comprende material de matriz no acuoso con un peso molecular de menos de 300 kDa, menos de 200 kDa, menos de 100 kDa, menos de 50 kDa o menos de 20 kDa. Para otro ejemplo más, una composición en el presente documento comprende material de matriz con un peso molecular en un intervalo con un límite superior de 300 kDa, 200 kDa, 100 kDa, 50 kDa, o 20 kDa y un límite inferior de 0,5 kDa, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa o 20 kDa.

En algunos casos, una composición en el presente documento comprende además un reticulante, tal como glutaraldehído, formaldehído, transglutaminasa o moléculas reactivas con bis-amina.

En algunos casos, una composición en el presente documento comprende un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un polinucleótido, un oligonucleótido, ADN, ARN, aditivos que promueven la supervivencia, proteoglucanos o mucopolisacáridos. En algunos casos, la composición también comprende un agente inmunosupresor. En otros casos, la composición no comprende un agente inmunosupresor.

Como se describe en el presente documento, una composición puede comprender una MEC descelularizada y una MEC descelularizada de tejido diferente o un polímero de origen sintético o natural. Los polímeros ejemplares de una composición en el presente documento incluyen, pero sin limitación: fibra de tereftalato de polietileno (Dacron), politetrafluoroetileno (PTFE), pericardio reticulado con glutaraldehído, polilactato (PLA), poliglicol (PGA), ácido hialurónico, polietilenglicol (PEG), polietileno, nitinol y colágeno de origen animal y no animal (como colágenos vegetales o sintéticos). En algunos casos, un polímero de la composición es biocompatible y biodegradable y/o bioabsorbible. Los ejemplos de polímeros biodegradables o bioabsorbibles incluyen, pero sin limitación: polilactidas, poliglicólidos, policarprolactona, polidioxano y sus copolímeros aleatorios y de bloque. Un polímero biodegradable y/o bioabsorbible puede contener un monómero seleccionado del grupo que consiste en un glicólido, lactida, dioxanona, caprolactona, carbonato de trimetileno, etilenglicol y lisina. El material puede ser un copolímero aleatorio, un copolímero de bloque o una mezcla de monómeros, homopolímeros, copolímeros y/o heteropolímeros que contienen estos monómeros. Los polímeros biodegradables y/o bioabsorbibles pueden contener poliésteres alifáticos lineales bioabsorbibles y biodegradables tales como poliglicólido (PGA) y su copolímero aleatorio poli(glicólido-co-lactida) (PGA-co-PLA). Otros ejemplos de polímeros biocompatibles adecuados son los metacrilatos de polihidroxialquilo que incluyen metacrilato de etilo e hidrogeles tales como polivinilpirrolidona y poliacrilamidas. Otros materiales bioabsorbibles adecuados son los biopolímeros que incluyen colágeno, gelatina, ácido algínico, quitina, quitosano, fibrina, ácido hialurónico, dextrano, poliaminoácidos, polilisina y copolímeros de estos materiales. Cualquier combinación, copolímero, polímero o mezcla de los mismos de los ejemplos anteriores se contempla para su uso de acuerdo con la invención. Dichos materiales bioabsorbibles pueden prepararse por métodos conocidos.

En algunos casos, una composición en el presente documento comprende un polímero y una MEC derivados naturalmente. Los ejemplos de polímeros derivados naturalmente para su uso en el presente documento incluyen, pero sin limitación: alginato, pegamento de fibrina y polisacáridos tales como ácido hialurónico.

En un caso, una composición en el presente documento comprende una matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco y además comprende un metal biocompatible. Un ejemplo de metal biocompatible incluye, pero sin limitación a, titanio. En un ejemplo, una composición en el presente documento comprende fibras de diámetro pequeño o partículas de diámetro pequeño de un metal biocompatible. El metal dentro de la composición puede proporcionar soporte a la estructura del material. Además, cuando la MEC descelularizada se degrada in vivo, las porciones metálicas de la composición pueden dejarse atrás para proporcionar una estructura de soporte para el tejido circundante.

En algunos casos, una composición en el presente documento comprende además celulosa. La celulosa se puede utilizar para formar el material en una forma deseada tanto in vivo como in vitro. Por ejemplo, cuando se usa como reactivo de cultivo de tejidos, una composición como se describe en el presente documento puede comprender celulosa y establecerse en una forma particular. En otro aspecto en el presente documento, se proporciona un dispositivo, en donde la celulosa proporciona un sustrato sobre el que se deposita una composición como se describe en el presente documento. El dispositivo puede ser entregado luego en una forma particular para la reparación de tejidos.

Las preparaciones de MEC disponibles comercialmente también se pueden combinar en los métodos, dispositivos y composiciones descritos en el presente documento. En una realización, la MEC procede de la submucosa del intestino delgado o SID. Las preparaciones disponibles comercialmente incluyen, pero sin limitación a, Surgisis™, Surgisis-ES™, Stratasis™ y Stratasis-ES™ (Cook Urological Inc.; Indianapolis, Ind.) y GraftPatch™ (Organogenesis Inc.; Canton Mass.). En otra realización, la MEC procede de la dermis. Las preparaciones disponibles comercialmente incluyen, pero sin limitación a, Pelvicol™ (vendido como Permacol™ en Europa; Bard, Covington, Ga.), Repliform™ (Microvasive; Boston, Mass.) y Alloderm™ (LifeCell; Branchburg, N.J.).

En el presente documento se describen métodos para preparar una composición inyectable que comprende MEC descelularizada procedente de tejido. También se describen composiciones, dispositivos y métodos de uso relacionados. La viscosidad de la composición puede aumentar cuando se calienta por encima de la temperatura ambiente, incluidas temperaturas fisiológicas que se aproximan a aproximadamente 37 °C. De acuerdo con una realización no limitante, la composición procedente de m Ec es una solución inyectable a temperatura ambiente y otras temperaturas inferiores a 35 °C. En otra realización no limitante, el gel se puede inyectar a una temperatura corporal de 37 °C o cerca de la temperatura corporal, pero se gelifica más rápidamente a temperaturas crecientes. En algunos casos, se forma un gel en menos de 5 minutos a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 10 minutos a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 15 minutos a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 30 minutos a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 45 minutos a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 1 hora a una temperatura fisiológica de 37 °C. En algunos casos, se forma un gel en menos de 5 minutos in vivo. En algunos casos, se forma un gel en menos de 10 minutos in vivo. En algunos casos, se forma un gel en menos de 15 minutos in vivo. En algunos casos, se forma un gel en menos de 30 minutos in vivo. En algunos casos, se forma un gel en menos de 45 minutos in vivo. En algunos casos, se forma un gel en menos de 1 hora in vivo.

En una realización, el corazón se descelulariza primero, dejando solo la matriz extracelular. La matriz se liofiliza luego, se tritura o pulveriza en un polvo fino y se solubiliza con pepsina u otras enzimas. Los ejemplos de enzimas incluyen, pero sin limitación: metaloproteinasa de matriz, colagenasas y tripsina.

En un aspecto, un método para administrar un material para reparación cardíaca comprende: proporcionar una composición liofilizada que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco; esterilizar la matriz liofilizada; solubilizar la matriz liofilizada con una solución líquida, formando así un material; y administrar el material al tejido cardíaco. En algunos casos, la matriz se esteriliza con óxido de etileno o mediante radiación. En algunos casos, la solución líquida es agua, solución salina o una solución tampón. En algunos casos, la administración es percutánea, por ejemplo, donde la composición se administra mediante un catéter transendocárdico o transcoronario. En algunos casos, la etapa de administrar la composición ocurre aproximadamente de 1 a 30 días después de un infarto de miocardio. En algunos casos, la etapa de administrar la composición ocurre al menos 1 mes o al menos 1 año después de un infarto de miocardio. La etapa de administrar la composición ocurre aproximadamente de 1 a 24 horas después de un infarto de miocardio. En algunos casos, la composición se administra a un infarto de miocardio, una zona de borde de un infarto de miocardio, o dentro de 2 cm o menos de un infarto de miocardio. Por ejemplo, la etapa de administrar la composición puede alterar la remodelación ventricular.

En un ejemplo para la terapia con gel, la solución se neutraliza y se lleva a la concentración apropiada usando PBS o solución salina. En una realización, la solución se puede inyectar a través de una aguja en el miocardio (por ejemplo, a través de un catéter, a través de las costillas o durante un procedimiento de tórax abierto). El tamaño de la aguja puede ser, sin limitación, 22 g, 23 g, 24 g, 25 g, 26 g, 27 g, 28 g, 29 g, 30 g o más pequeño. En una realización, el tamaño de la aguja a través del cual se inyecta el gel es de 27 g. La administración también puede ocurrir a través de un catéter de infusión con balón u otro catéter sin aguja. A temperatura corporal, la solución puede formar un gel.

En otro aspecto más en el presente documento, un método para reparar tejido cardíaco comprende inyectar o implantar en un sujeto una composición que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardíaco. En algunos casos, la composición se inyecta o implanta antes de un mes después del infarto de miocardio o la composición se inyecta o implanta antes de dos semanas después del infarto de miocardio. En algunos casos, la composición se inyecta o implanta antes de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 20 días, 45 días, dos meses, tres meses, cuatro meses, 6 meses o 1 año después del infarto de miocardio. En algunos casos, la composición se degrada dentro de los tres meses o dentro de un mes después de la inyección o implantación. En algunos casos, la composición se degrada dentro de las 6 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses o 1 año después de la inyección o implantación. En algunos casos, la inyección o implantación de dicha composición repara un defecto congénito.

En otros casos, la inyección o implantación de dicha composición previene o repara el daño al tejido cardíaco sufrido por dicho sujeto. El daño puede ser un infarto de miocardio. En algunos casos, dicha reparación comprende al menos un 20 % menos de cambio en el volumen ventricular 3 meses después de dicho infarto de miocardio en comparación con un sujeto con daño en el tejido cardíaco y sin inyección o implantación de dicha composición. En algunos casos, dicha reparación comprende al menos un 5, 10, 15, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % menos de cambio en el volumen ventricular 3 meses después de dicho infarto de miocardio en comparación con un sujeto con daño en el tejido cardíaco y sin inyección o implantación de dicha composición. El daño puede ser un infarto de miocardio. En algunos casos, dicha reparación comprende al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % menos de cambio en el volumen ventricular 3 meses después de dicha inyección o implantación en comparación con un sujeto con daño en el tejido cardíaco y sin inyección o implantación de dicha composición. En algunos casos, la reparación comprende un aumento del 20 % en la fracción de eyección 3 meses después de dicho infarto de miocardio en comparación con un sujeto con daño en el tejido cardíaco y sin inyección o implantación de dicha composición. (Una fracción de eyección es una medida de la función cardíaca que mide la eficacia de la salida de los ventrículos). En algunos casos, la reparación comprende un aumento de más del 20, 30, 50, 75, 100 o 200 % en la fracción de eyección 3 meses después de dicho infarto de miocardio en comparación con un sujeto con daño en el tejido cardíaco y sin inyección o implantación de dicha composición.

En otra realización más, se puede inyectar un gel en el área del infarto, la zona límite o el miocardio solo o en combinación con los componentes descritos anteriormente para el crecimiento, la angiogénesis y la regeneración de células endógenas. En otra realización más, un gel también se puede usar solo o en combinación con los componentes descritos anteriormente como una matriz para cambiar las propiedades mecánicas del corazón y/o prevenir la remodelación negativa ventricular izquierda. En otra realización más, el gel puede administrarse con células solas o en combinación con los componentes descritos anteriormente para regenerar el miocardio. En otra realización más, se puede usar un gel solo o en combinación con los componentes descritos anteriormente para crear un bloque de conducción para tratar las arritmias.

En un método ejemplar, se puede inyectar una composición usando administración transendocárdica. En este ejemplo, se puede usar un catéter Myostar guiado por NOGA para crear un mapa endocárdico tridimensional de la función electromecánica. Usando el mapa tridimensional, las inyecciones transendocárdicas de la composición se pueden realizar en o cerca del sitio de administración, o el sitio de un infarto de miocardio.

En otro método ejemplar descrito en el presente documento, una composición en el presente documento puede inyectarse usando administración transcoronaria similar a la inyección intracoronaria de células de médula ósea. En este ejemplo, se puede inflar un globo de angioplastia sobre el cable en el sitio de oclusión, y la composición se puede infundir a través de la luz del cable guía.

Para el reactivo soluble, la solución se lleva a una solución de pH bajo que incluye, pero no se limita a, ácido acético 0,5 M, 0,1 M o 0,01 M o HCl 0,1 M a la concentración deseada y luego se coloca en placas/pocillos de cultivo de tejidos, cubreobjetos, u otro sustrato de superficie/3D para cultivo de tejidos. Después de colocar en una incubadora a 37 °C durante 1 hora, o durante la noche a temperatura ambiente o a 4 °C, la solución se puede eliminar. Después de enjuagar las placas/pocillos con PBS, las células pueden cultivarse en la matriz adsorbida. La solución se puede combinar con péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, ADN, ARN, fármacos, nutrientes, aditivos que promueven la supervivencia, proteoglucanos y/o mucopolisacáridos antes, durante o después de la inyección/implantación.

Un reactivo, en el presente documento, proporciona fijación celular y supervivencia tanto en el gel como en las formas adsorbidas de la matriz extracelular del corazón in vitro. En el presente documento, se ha demostrado que la forma de reactivo soluble de la matriz extracelular cardíaca induce una propagación más rápida, una maduración más rápida y una supervivencia mejorada para los cardiomiocitos neonatales en comparación con los recubrimientos de placa convencionales.

En algunos casos, una composición como se proporciona en el presente documento puede comprender una matriz y comprender células. Las células pueden ser cualquier variedad de células. En algunos casos, las células son una variedad de células cardíacas o cardiovasculares que incluyen, pero sin limitación: células madre, progenitoras, cardiomiocitos, células vasculares y fibroblastos procedentes de fuentes autólogas o alogénicas.

Una composición en el presente documento que comprende MEC y células puede prepararse mediante el cultivo de las células en la MEC. Además, cuando se añaden proteínas, tales como factores de crecimiento, a la matriz extracelular, las proteínas se pueden añadir a la composición, o las moléculas de proteína se pueden unir covalentemente o no covalentemente a una molécula en la matriz. El enlace covalente de la proteína a las moléculas de la matriz se puede lograr mediante procedimientos de enlace de proteínas covalentes convencionales conocidos en la materia. La proteína puede estar unida covalentemente a una o más moléculas de la matriz.

En una realización, cuando se administra una composición que comprende células, las células pueden provenir de fuentes celulares para tratar el miocardio que incluyen fuentes autólogas, no autólogas, HLA coincidentes, alogénicas, xenogénicas o autogénicas. En consecuencia, las células madre embrionarias humanas (hESC, de sus siglas en inglés), los cardiomiocitos neonatales, los miofibroblastos, las células mesenquimatosas, los cardiomiocitos expandidos autotransplantados y los adipocitos pueden administrarse mediante una composición del presente documento. En algunos casos, las células, en el presente documento, pueden cultivarse ex vivo y, en el entorno de la placa de cultivo, diferenciarse directamente a las células del músculo cardíaco o a las células de la médula ósea que pueden convertirse en células del músculo cardíaco. Las células cultivadas se pueden trasplantar luego a un mamífero, ya sea con la composición o en contacto con el armazón y otros componentes. Los mioblastos son otro tipo de células que se prestan a un trasplante en miocardio, sin embargo, no siempre se desarrollan en cardiomiocitos in vivo. Las células madre adultas son otra especie de células que pueden formar parte de una composición en el presente documento. Se cree que las células madre adultas funcionan mediante la generación de otras células madre (por ejemplo, las apropiadas para el miocardio) en un nuevo sitio, o se diferencian directamente en un cardiomiocito in vivo. También pueden diferenciarse en otros linajes después de la introducción a los órganos, tales como el corazón. En otro caso, las células madre mesenquimatosas se administran con citocinas activadoras. Se ha demostrado que las subpoblaciones de células mesenquimatosas se diferencian hacia líneas celulares miogénicas cuando se exponen a citocinas in vitro.

La siguiente lista incluye algunas de las células que pueden usarse como componentes celulares de la composición de la invención: una célula madre embrionaria humana, un cardiomiocito fetal, un miofibroblasto, una células madre mesenquimatosa, un cardiomiocito expandido autotrasplantado, un adipocito, una célula totipotente, una célula pluripotente, una célula pluripotente inducida, una células madre sanguínea, un mioblasto, una célula madre adulta, una célula de médula ósea, una célula mesenquimatosa, una célula madre embrionaria, una célula parenquimal, una célula epitelial, una célula endotelial, una célula mesotelial, un fibroblasto, un miofibroblasto, un osteoblasto, un condrocito, una célula exógena, una célula endógena, una célula madre, una células madre hematopoyética, una célula madre pluripotente, una célula progenitora procedente de la médula ósea, una célula progenitora, una célula miocárdica, una célula esquelética, una célula fetal, una célula embrionaria, una célula indiferenciada, una célula progenitora multipotente, una célula progenitora unipotente, un monocito, un cardiomiocito, un mioblasto cardíaco, un mioblasto esquelético, un macrófago, una célula endotelial capilar, una célula xenogénica, una célula alogénica, una célula madre adulta, una célula madre postnatal y un cardiomiocito generado por transdiferenciación. Como se observa en el presente documento, las células diferenciadas pueden usarse como componentes celulares de las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los ejemplos de células diferenciadas incluyen cardiomiocitos, mioblastos cardíacos y otras células cardíacas descritas en el presente documento o conocidas en la materia. Dichas células pueden obtenerse mediante el aislamiento de las células de un órgano (por ejemplo, el corazón) de un animal o persona. Dichas células también pueden obtenerse mediante la diferenciación de células ES, células iPS, células madre adultas u otras células progenitoras (por ejemplo, células progenitoras de cardiomiocitos). Los métodos de diferenciación son conocidos en la materia. Dichas células también pueden obtenerse mediante la transdiferenciación de células de un tipo celular completamente diferente (por ejemplo, células de médula ósea).

En el presente documento, los cardiomiocitos procedentes de células madre embrionarias humanas se pueden cultivar en una composición que comprende una matriz cardíaca. En algunos casos, en el presente documento, los cardiomiocitos procedentes de hESC cultivados en presencia de una composición proporcionan una morfología más in vivo. En algunos casos, en el presente documento, los cardiomiocitos procedentes de hESC cultivados en presencia de una composición proporcionan marcadores aumentados de maduración.

La invención también se dirige a un sistema de administración de fármacos que comprende una matriz extracelular cardíaca descelularizada para administrar células, fármacos, moléculas o proteínas a un sujeto para tratar tejidos u órganos defectuosos, enfermos, dañados o isquémicos. En una realización, el material biocompatible que comprende la matriz extracelular cardíaca descelularizada sola o en combinación con otros componentes se usa como un bloque de conducción no destructivo para el tratamiento de las arritmias. El material biocompatible también puede usarse para trasplantar células, o inyectarse solo para reclutar células naturales o actuar como un vehículo de administración de fármacos. El sistema de administración de fármacos en el presente documento comprende además células, fármacos, proteínas u otro material biológico seleccionado del grupo que consiste en, pero no se limita a, eritropoyetina, factor de células madre (SCF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento del cartílago (CGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento esquelético (SGF), factor de crecimiento procedente de osteoblastos (PDGF), factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento de citocinas (CGF), factor de células madre (SCF), factor de crecimiento procedente de plaquetas (PDGF), suplemento de crecimiento de células endoteliales (EGGS), factor estimulante de colonias (CSF), factor de diferenciación de crecimiento (GDF), factor modulador de la integrina (IMF), calmodulina (CaM), timidina cinasa (TK), factor de necrosis tumoral (TNF), hormona de crecimiento (GH), proteína morfogénica ósea (BMP), metaloproteinasa de la matriz (MMP), metaloproteinasa de matriz inhibidora de tejido (TIMP), interferón, interleucinas, citocinas, integrina, colágeno, elastina, fibrilinas, fibronectina, laminina, mucopolisacáridos, hemonectina, trombospondina, heparán sulfato, dermantan, sulfato de condroitina (CS), ácido hialurónico (HA), vitronectina, proteoglucanos, transferrina, citotactina, tenascina y linfocinas.

Las placas de cultivo de tejidos pueden recubrirse con una forma de gel de la matriz extracelular de la invención, o una forma adsorbida de la matriz extracelular de la invención para cultivar cardiomiocitos u otros tipos de células relevantes para la reparación cardíaca. Esto puede usarse como un reactivo de investigación para el crecimiento de estas células o como un reactivo clínico para cultivar las células antes de la implantación. El reactivo de matriz extracelular se puede aplicar a otras matrices de tejidos y células.

Para el reactivo de gel, el pH de la solución puede llevarse a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. En algunos casos, el pH se lleva a un pH fisiológico de aproximadamente 7,4. Luego, el gel se lleva a la concentración apropiada usando PBS/solución salina u otro tampón, y luego se coloca en placas y/o pocillos de cultivo de tejidos. Una vez colocada en una incubadora a 37 °C, la solución puede formar un gel que puede usarse para cualquier sustrato de cultivo 2D o 3D para cultivo celular. En una realización, el gel se puede reticular con glutaraldehído, formaldehído, moléculas de bis-NHS u otros reticuladores, o se puede combinar con células, péptidos, proteínas, ADN, fármacos, nutrientes, aditivos promotores de la supervivencia, proteoglucanos y/o mucopolisacáridos, o combinarse y/o reticularse con un polímero sintético para su uso posterior.

También se describe en el presente documento un método para cultivar células en una matriz adsorbida que comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución que comprende el material biocompatible de la invención en una solución de pH bajo que incluye, pero no se limita a, ácido acético 0,5 M o 0,01 M o HCl 0,1 M a una concentración deseada, (b) colocar dicha solución en placas o pocillos de cultivo de tejidos, (c) incubar dichas placas o pocillos de cultivo de tejidos, tal como a 37 °C durante 1 hora, o durante la noche a temperatura ambiente o a 4 °C, (d) eliminar dicha solución, (e) enjuagar dichas placas o pocillos de cultivo de tejidos con PBS, y (f) cultivar células en la matriz adsorbida. Las células que pueden cultivarse en la matriz adsorbida que comprende la matriz extracelular cardíaca de la invención son cardiomiocitos u otros tipos de células relevantes para la reparación cardíaca.

También se describe una composición que comprende reticuladores que incluyen, pero sin limitación: reticuladores de colágeno comunes, reticuladores de HA u otros reticuladores de proteínas con degradación alterada y propiedades mecánicas.

En el presente documento también se describe un método para preparar la composición que comprende electrohilado. En el presente documento también se describe un método configurado para controlar el tamaño, la forma o el grosor de nanofibras.

En el presente documento también se describe una composición que puede contener microperlas. Las microperlas pueden ser parte de la composición o administrarse por la composición. Las microperlas ejemplares pueden ser cualquier variedad de materiales, por ejemplo, naturales o sintéticos. En algunos casos, las microperlas pueden tener propiedades de degradación variadas o comprender, por ejemplo, inhibidores de MMP, factores de crecimiento o moléculas pequeñas.

También se describe en el presente documento una composición que puede comprender un grupo biológico que puede actuar como un adhesivo o anclaje donde se administra la composición.

También se describe en el presente documento una composición que puede ser un bioadhesivo, por ejemplo, para la reparación de heridas. También se describe en el presente documento una composición que puede configurarse como una célula adherente. Por ejemplo, la composición descrita en el presente documento puede recubrirse o mezclarse con un dispositivo médico o un producto biológico que comprende o no células. Por ejemplo, una composición descrita en el presente documento puede ser un recubrimiento para un injerto vascular de polímero sintético. También se describe en el presente documento una composición que es antibacteriana o en la que podrían incluirse agentes antibacterianos.

También se describe en el presente documento un método que comprende administrar una composición como un dispositivo de reparación de heridas. Por ejemplo, después de la ablación cardíaca, se puede administrar una composición para mejorar la curación.

También se describe una composición que comprende una perla de alginato que está recubierta con una composición de MEC como se describe en el presente documento.

En algunos casos, una composición es inyectable. Una composición inyectable puede ser, sin limitación, un polvo, líquido, partículas, fragmentos, gel o emulsión. La composición inyectable puede inyectarse en un corazón o, en muchos casos, inyectarse en el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho, aurícula izquierda, aurícula derecha o las válvulas de un corazón. Las composiciones de la presente invención pueden reclutar, por ejemplo, sin limitación, endotelio, músculo liso, progenitores cardiacos, miofibroblastos, células madre y cardiomiocitos.

En el presente documento, los métodos para preparar las composiciones pueden incluir descelularizar tejido de cualquier edad, animal o ser humano.

En el presente documento, los métodos incluyen la administración de una composición que comprende una MEC. Los métodos ejemplares incluyen, pero sin limitación: inyección directa durante la cirugía; inyección directa a través de la pared torácica; administración a través del catéter al miocardio a través del endocardio; administración a través de vasos coronarios; y administración a través de un catéter con balón de infusión.

En algunos casos, en el presente documento, una composición es un recubrimiento. Se puede usar un recubrimiento para aplicaciones de cultivo de tejidos, tanto para investigación como clínica. El recubrimiento puede usarse para recubrir, por ejemplo, sin limitación, armazones/materiales sintéticos o de otros productos biológicos, o implantes. En algunos casos, un revestimiento se texturiza o modela. En algunos casos, un método para hacer un recubrimiento incluye adsorción o enlace químico. Se puede formar un gel delgado o un revestimiento adsorbido usando una forma de solución de la composición.

La divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como limitaciones al alcance de la misma. Es evidente para los artesanos expertos que son posibles diversas modificaciones y cambios y están contemplados dentro del alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1

El objetivo de este estudio es examinar el uso de un gel como plataforma de cultivo para la adhesión celular, el crecimiento, la maduración y la administración in vivo. Se proporciona un gel compuesto de tejido de matriz extracelular de corazón natural que puede ayudar en la regeneración de tejido cardíaco al promover la supervivencia celular.

Se sacrificaron ratas hembra Sprague Dawley y sus corazones se descelularizaron. Los corazones descelularizados se liofilizaron, rehidrataron, pulverizaron y liofilizaron nuevamente para formar un polvo seco. Los corazones congelados se rehidrataron con agua y luego se sumergieron en nitrógeno líquido. Una vez congelados, los corazones fueron aplastados sistemáticamente dentro de un aparato de bola y copa a 70 psi durante 10 segundos. Las partículas de corazón pulverizadas se liofilizaron. Una vez seco, el tejido cardíaco liofilizado se combinó con pepsina al 1 % y se amalgamó con HCl 0,01 M a una concentración de 10 mg/ml. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas para permitir la solubilización del tejido de la matriz extracelular. Después de 48 horas, la solución de HCl se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf en hielo y se neutralizó con NaOH 0,1 N a pH 7,4.

A través de los métodos descritos anteriormente, se ha formado un gel de MEC cardíaca de rata natural. La gelificación exitosa de geles de 2,5-8 mg/ml ocurrió en 15 minutos, como lo confirma el aumento de la naturaleza viscosa del material. Se observó una mayor rigidez con geles de mayor densidad. La solución con pH ajustado se diluyó a concentración con 1 x PBS, se colocó en una placa de 96 pocillos a 50 pl por pocillo y luego se transfirió a una incubadora a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de que se había formado el gel, se pipetearon 100 pl de células de cardiomiocitos neonatales 2d aisladas sobre la parte superior del gel a 60.000 células por pocillo. Después de unos días, se examinó la adherencia de las células a los geles.

La colocación de cardiomiocitos en los geles de MEC cardíaca a 1x104 mostró una adhesión y supervivencia exitosas de las células a la MEC. Las células se cultivaron en la MEC durante hasta cuatro días.

Se inyectaron cien ml de solución de MEC cardíaca (7 mg/ml) a través de una aguja 30 G en la pared libre del VI de una rata anestesiada. En resumen, el estudio muestra que la matriz extracelular del corazón natural puede aislarse, solubilizarse y autoensamblarse en un gel cuando se lleva a pH y temperatura fisiológicos.

EJEMPLO 2

En este caso, se ha investigado el uso del recubrimiento celular para la matriz extracelular del corazón natural de ventrículos adultos que se han descelularizado y solubilizado. Las ventajas son que la MEC de corazón natural puede tener más componentes que los recubrimientos celulares tradicionales, y estar más fácilmente disponibles para su uso que el tratamiento previo con otros tipos de células.

Se extrajeron corazones de ratas Sprague-Dawley y se descelularizaron. Los corazones descelularizados se liofilizaron, rehidrataron y pulverizaron después de congelarlos en nitrógeno líquido. La MEC se digirió luego en pepsina en HCl 0,1M. Después de 48 horas de digestión, se añadió ácido acético 0,01 M para diluir a la concentración final de 1 mg/ml.

La digestión con pepsina de la MEC cardíaca natural se realizó en electroforesis en gel vertical en condiciones reductoras usando ditiotreirol (DTT) y se comparó con laminina (BD Biosciences) y colágeno de piel de ternera (Sigma). Los geles se tiñeron con Imperial Protein Stain (Pierce). La MEC del corazón natural puede demostrar una mezcla más compleja de componentes de MEC en comparación con el colágeno y la laminina.

Los miocitos cardíacos se cosecharon de los ventrículos de ratas Sprague-Dawley de 1 a 2 días de edad usando un kit de aislamiento (Cellutron, Highland Park, NJ). El sobrenadante inicial se descartó, pero las digestiones posteriores de 20 minutos se filtraron y suspendieron en DMEM complementado con M199 al 17 %, suero de caballo al 10 %, suero fetal bovino al 5 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Después del aislamiento, el sobrenadante se sembró previamente en placas de poliestireno de cultivo de tejidos para aumentar la pureza de los cardiomiocitos mediante la adhesión selectiva de fibroblastos.

Se absorbió 1 mg/ml de MEC cardíaca natural o colágeno I (Sigma, St. Louis, MO) en placas de 48 pocillos de cultivo de tejidos durante 1 hora a 37 °C. Los cardiomiocitos neonatales aislados se colocaron en placas a una densidad de 200.000/cm2 y los medios se cambiaron a medios de bajo mantenimiento de suero después de 24 horas (DMEM, M199 al 18,5 %, HS al 5 %, FBS al 1 % y penicilina/estreptomicina al 1 %). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C y dióxido de carbono al 5 %, se controlaron diariamente y se les añadió medio fresco cada 2-3 días. Los cultivos se fijaron en el día 2, día 4 y día 7 y se tiñeron para alfa actinina, conexina 43, pancadherina, actina y núcleos. Los cardiomiocitos comenzaron a latir espontáneamente en cultivo en el día 2. Las células cultivadas en colágeno comenzaron a separarse de la placa en el día 8. Un conjunto de células cultivadas en MEC de corazón natural continuó latiendo hasta el día 45. Todas las células cultivadas en colágeno dejaron de latir en el día 14.

Este estudio demostró que la MEC cardíaca natural contiene componentes más complejos en comparación con otros recubrimientos de cultivo celular convencionales. Los cardiomiocitos de rata neonatal unidos a la MEC cardíaca natural como recubrimiento para el cultivo celular, comenzaron a latir espontáneamente. Los cardiomiocitos cultivados en MEC cardíaca natural demostraron un aumento de la tinción de actinina, conexina 43 y pan-cadherina con el tiempo. También, los cardiomiocitos neonatales tenían mayor capacidad de supervivencia y fijación en la MEC cardíaca natural en comparación con el colágeno.

EJEMPLO 3

El infarto de miocardio se indujo en ratas usando un modelo de isquemia-reperfusión de 25 minutos, a través de la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda. A la semana, se calculó la función de referencia posterior al IM a partir de imágenes de MRI. La MEC miocárdica porcina se descelularizó en piezas pequeñas, en SDS al 1 % durante varios días, seguido de un enjuague DI durante la noche, liofilización y molienda para crear un polvo. La digestión se realizó en HCl 0,1 M con pepsina para crear una forma solubilizada del material.

La MEC solubilizada se llevó a pH 7,4 usando NaOH 1 M y se diluyó con PBS hasta 6 mg/ml antes de la inyección. Después de la cirugía de IM, los animales se aleatorizaron en dos grupos y se inyectó MEC o solución salina en la pared libre del VI de ratas Sprague Dawley hembras a través de una aguja 30 G, dos semanas después de la cirugía de infarto.

4 semanas después de la cirugía de inyección (6 semanas después del IM), la función cardíaca se evaluó nuevamente usando MRI.

Los animales inyectados con MEC mostraron una función conservada (evaluada según la fracción de eyección) a las 6 semanas, mientras que los animales inyectados con solución salina no mantuvieron la función cardíaca. El volumen diastólico final y el volumen sistólico final también se conservaron en animales inyectados con MEC.

EJEMPLO 4

Actualmente, las células madre y otros tipos de células están en ensayos clínicos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca mediante la administración a través de un catéter de 27 G en la pared del miocardio. El tejido ventricular porcino se descelularizó utilizando detergentes SDS, y se procesó para formar una forma solubilizada de la matriz, y se neutralizó a pH fisiológico y se diluyó a 6 mg/ml para inyección.

Dos cerdos Yorkshire recibieron un infarto de miocardio inducido por una bobina y se les inyectó matriz de miocardio sola o con células a los dos meses después del infarto.

Se marcaron previamente derivados de explantes cardíacos fetales con un colorante fluorescente, yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), que es una tinción citoplasmática, para identificación histológica. Se usó un cóctel pro-supervivencia, que se demostró que mejora la supervivencia de hESC en un modelo de roedor. Se inyectó la matriz sola o con células a una velocidad clínicamente relevante de 0,2 ml por 30 segundos a través de un catéter, según lo guiado mediante mapeo de NOGA. Se hicieron 5 inyecciones de 0,1 ml cada una de matriz sola o con células en regiones de la zona límite del infarto.

La matriz sola y la matriz con células pudieron inyectarse con éxito en el corazón porcino, de forma mínimamente invasiva, sin obstruir el catéter estrecho.

EJEMPLO 5

El miocardio ventricular porcino se descelulariza y la eliminación de células se confirma mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de tejido descelularizado congelado fresco. Después de este procedimiento de descelularización, la MEC se liofiliza y luego se muele en una partícula fina. El polvo de MEC miocárdica se caracterizó usando espectrometría de masa de cromatografía líquida (LC-MS/MS), que permite la identificación de proteínas y proteoglucanos. La LC-MS/MS reveló una variedad de proteínas de la MEC, lo que indica el contenido de proteínas retenidas después de la descelularización. Las proteínas, glucoproteínas y proteoglucanos de la MEC identificados incluyen: colágeno de tipo I, III, IV, V y VI, elastina, fibrinógeno, lumicano, perlecano, fibulina y laminina. La identificación de estos componentes dentro de la MEC miocárdica descelularizada indica una combinación compleja retenida de proteínas y proteoglucanos.

Para generar la forma inyectable de la composición, el polvo de matriz descelularizada se solubiliza a través de la digestión enzimática. Se permite que la matriz se digiera durante 48 h con agitación constante. Se determinó que el contenido de mucopolisacáridos (GAG) del producto solubilizado era 23,2 ± 4,63 |jg por mg de matriz.

EJEMPLO 6

La composición líquida se lleva a pH fisiológico mediante la adición de NaOH y 10X PBS, y se diluye hasta su concentración final con IX PBS. En este punto, el producto puede usarse inmediatamente, o puede liofilizarse, almacenarse congelado y rehidratarse con agua estéril antes de su uso.

La composición se autoensambla en un hidrogel tras la inyección transendocárdica in vivo en 25 sitios de inyección (0,2 ml cada sitio) a lo largo de la pared septal y la pared libre del VI. La detección de la matriz dentro de la pared libre del VI y la pared septal confirmó la administración exitosa al miocardio, así como la gelificación de la matriz in vivo. No se observó material en los órganos satélite.

EJEMPLO 7

En el presente ejemplo se usó una composición preparada de acuerdo con los Ejemplos 5 y 6 (denominada en este ejemplo "Composición"). La composición (n = 6) o solución salina (n = 6) se inyectó en la pared libre del VI de ratas Sprague Dawley hembra dos semanas después del infarto. La resonancia magnética (MRI, de sus siglas en inglés) se usó para evaluar la función cardíaca y la geometría del VI una semana después del IM, como valor de referencia previo al tratamiento, y seis semanas después del IM. Tanto el volumen del VI como la fracción de eyección a las cuatro semanas después de la inyección permanecieron estadísticamente equivalentes a las mediciones de referencia en los animales inyectados con la composición, mientras que ambos empeoraron en los animales de control de solución salina como se demuestra en la Tabla 1. El volumen del VI y la fracción de eyección a las cuatro semanas después de la inyección permanecieron estadísticamente equivalentes a las mediciones de referencia en los animales inyectados, mientras que ambos empeoraron en los animales de control con solución salina (Figura 3). La Figura 3 muestra la inyección previa y posterior de solución salina (a, b) y la composición (c, d) (*P < 0,05 en comparación con los valores de referencia; §P = 0,054). También hubo tendencias de mejora en el porcentaje de cambio en el FE y los volúmenes.

EJEMPLO 8

El miocardio ventricular porcino se descelulariza (Figura 4A), y la eliminación de células se confirma mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de tejido descelularizado congelado fresco, tinción con Hoechst 33342 y a través de un kit DNEasy. Después de este procedimiento de descelularización, la MEC se liofiliza y luego se muele en una partícula fina (Figura 4b ). El polvo de MEC miocárdica se caracterizó usando espectrometría de masa de cromatografía líquida (LC-MS/MS), que permite la identificación de proteínas y proteoglucanos. La LC-MS/MS reveló una variedad de proteínas de la m Ec , lo que indica el contenido de proteínas retenidas después de la descelularización. Las proteínas, glucoproteínas y proteoglucanos de la MEC identificados incluyen, sin limitación: colágeno de tipo I, III, IV, V y VI, elastina, fibrinógeno, lumicano, perlecano, fibulina y laminina. La identificación de estos componentes indica una combinación compleja retenida de proteínas y proteoglucanos.

Para generar la forma inyectable, el polvo de matriz descelularizada se procesa en un líquido a través de la digestión enzimática. Se permite que la matriz se digiera durante 48 h con agitación constante, produciendo líquido. La digestión completa se confirma por la falta de partículas visibles en la solución (Figura 4C), así como por la presencia de especies de bajo peso molecular con electroforesis en gel. En algunos casos, en el presente documento, una composición carece de núcleos/ADN, tiene bandas de peso molecular por debajo de 20 kDa, tiene un contenido de GAG entre 15-25 pg/mg de matriz y falta de partículas visibles después de 48 horas de digestión. El líquido se lleva a pH fisiológico mediante la adición de NaOH y 10X PBS, y se diluye a su concentración final (6 mg/ml, que ya se ha optimizado para las características de gelificación apropiadas) con IX PBS. En este punto, el producto puede usarse inmediatamente, o puede liofilizarse, almacenarse congelado y rehidratarse con agua estéril antes de su uso. Para inducir la gelificación in vitro, la solución se lleva a 37 °C, lo que forma un armazón poroso y fibroso similar en escala y estructura a la MEC natural (Figura 4D). O el material también se puede inyectar in vivo donde se autoensambla en un hidrogel. Aunque las realizaciones preferidas de la invención se han mostrado y descrito en el presente documento, será obvio para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición líquida que comprende matriz extracelular descelularizada procedente de tejido cardiaco digerida de manera enzimática, en donde la composición líquida se reconstituye a partir de una composición liofilizada que comprende la matriz extracelular descelularizada digerida de manera enzimática; en donde la composición líquida se transforma en un gel a temperatura corporal; y en donde la composición líquida comprende mucopolisacárido en una concentración de entre 15 y 25 |jg por mg de la composición liofilizada.

2. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la composición líquida comprende además al menos una enzima digestiva.

3. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la composición líquida se transforma en un gel en menos de 30 minutos.

4. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la composición líquida comprende además un polímero de origen sintético o natural.

5. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la composición líquida se transforma en un gel dentro de los 30 minutos posteriores a la administración al tejido in vivo.

6. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la matriz extracelular descelularizada digerida comprende un componente que tiene un peso molecular inferior a 20 kDa.

7. Un método para preparar una composición líquida que comprende:

a. descelularizar tejido cardíaco;

b. liofilizar el tejido cardíaco descelularizado;

c. digerir el tejido liofilizado con una enzima;

d. liofilizar el tejido digerido;

e. almacenar el tejido digerido durante hasta 6 meses a una temperatura de menos de 25 °C; y

f. fabricar la composición líquida mediante la incorporación del tejido digerido liofilizado con un líquido, en donde la composición líquida comprende mucopolisacárido en una concentración de 15 a 25 jg por mg del tejido digerido liofilizado.

8. La composición líquida de la reivindicación 1, en donde la composición líquida es para su uso en la reparación de tejido cardíaco cuando se inyecta o implanta en un sujeto.

9. La composición líquida de la reivindicación 8, en donde la composición líquida se inyecta o implanta antes de un mes después del infarto de miocardio.

10. La composición líquida de la reivindicación 8, en donde la composición líquida se degrada dentro de los tres meses posteriores a la inyección o implantación.

11. La composición líquida de la reivindicación 8, en donde la inyección o implantación de dicha composición es para la reparación de un defecto congénito o infarto de miocardio.