CN103491898B

CN103491898B - 用于工业规模分散的生物基质支架

Info

Publication number: CN103491898B
Application number: CN201180042690.1A
Authority: CN
Inventors: M·L·罗亚奇; R·H·马拉瓦卡; Y·王; L·C·M·里德
Original assignee: Ji Peculiar Single Liability Co That Jumps A Queue; University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: Ji Peculiar Single Liability Co That Jumps A Queue; University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-07-01
Also published as: EP3603622A1; US20130137176A1; ES2626145T3; US9944896B2; EP2588027A1; CN105713868A; ES2624742T3; HK1243928A1; WO2012003463A1; EP3216444B1; US20160024463A1; EP3192862B1; PT2588027T; EP2588083B1; ES2791312T3; EP3192862A1; PL2588083T3; US10640747B2; WO2012003450A3; US10246678B2

Abstract

本发明提供了用于工业规模分散的生物基质支架。

Description

用于工业规模分散的生物基质支架

优先权声明

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列号为61/360,939的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持声明

本发明的各方面在国立卫生研究院(NIH)资助号AA014243和IP30-DK065933、国立糖尿病、消化系统和肾病研究院(NIDDK)资助号DK34987、国立癌症研究院(NCI)资助号CA016086和国立牙科和颅面研究所资助号DE019569的政府支持下做出。美国政府对本发明具有一定的权利。

技术领域

本发明涉及生物基质支架和产生生物基质支架的方法，以及它们作为完整支架或作为以各种方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的实验和临床用途的支架在不同应用中的用途。

发明背景

先体内后体外(exvivo)或临床项目如细胞疗法中使用分化细胞的能力取决于维持具有成体表型并具有完全功能的细胞或能够谱系限制干细胞或祖细胞(“干/祖细胞”)以实现该成体表型的能力。干细胞研究中正在进行的革命已经使得干/祖细胞群体包括来自胚胎、胎儿和出生后组织的那些的鉴定和分离成为可能¹。针对所有成体细胞类型鉴定和分离干/祖细胞的能力以及使它们扩增和分化的能力极大地增加了利用它们用于制药学及其他工业研究项目、用于学术研究以及用于临床项目诸如基于细胞的疗法和组织工程的潜能²。

目前用于先体内后体外维持分化细胞或将干细胞谱系限制为成体命运的方法是部分成功的，并且涉及将细胞铺板在或嵌入一种或多种细胞外基质成分的基质并嵌入对于所需成体表型定制的由特定激素、生长因子、和营养物组成的培养液中。对于非常原始的干细胞诸如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPS)，或出生后衍生的可以转变为多种成体命运的干细胞，诸如间充质干细胞(MSC)或羊水来源干细胞(AFSC)，这些干细胞经受可溶性信号和/或细胞外基质成分的混合物，并必须经数周时间以多组这样的信号进行处理。典型地，所实现的成体表型随着每次制备是不同的，并具有某些成体特异基因的过表达或低表达和/或一种或多种成体组织特异性基因的异常调节。

细胞外基质由细胞分泌，在一个或多个细胞表面上与它们邻近，并且已经长期被理解为是对于细胞的结构支持物⁷。它是由多种生物活性分子组成的极其复杂的支架，所述生物活性分子被高度调节，并且对于决定附着细胞的形态、生长和分化是关键的⁸。培养细胞的组织特异性基因表达通过在基质提取物或纯化的基质成分上培养细胞来改善⁹。然而，个别基质成分，单独的或组合的，不能够概括组织的复杂基质化学和结构。这与下列事实相关：基质成分处于与自然组织区域以及与组织学结构诸如血管相关的梯度中。组织基质的这种复杂性更加容易通过对组织脱细胞化并留下基质作为残留物的提取法来实现^10、11。然而，当前的脱细胞化方案由于使用溶解基质成分的基质降解酶或缓冲液而导致一些基质成分的大量流失。

本发明提供了生物基质支架以及制备和使用这样的生物基质支架的方法。本发明的方法导致产生富含组织的大部分胶原并具有结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子的组织特异性提取物，所述胶原、结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子对成熟细胞和干/祖细胞群体的谱系限制共同地产生重复性更高且更有效的分化效果。

发明内容

本发明提供了由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于分散(例如，利用所述量，例如实施例2中所述的方案中所述的量的工业规模分散)至培养装置上的方法，其包括：a)以包含约3.5MNaCl至约4.5MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注生物组织或使生物组织均质化；b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，以及所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后

c)用处于中性pH且包含约2.0MNaCl至约5.0MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持生物组织中鉴定的胶原不溶；然后

d)在缓冲液中用核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后

e)用处于中性pH、无血清、且具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或步骤(d)的匀浆，进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物基质支架包含生物组织的至少95％的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和细胞因子；

f)在基础培养液中稀释所述生物基质支架；

g)在约-80℃冷冻(f)的生物基质支架；

h)通过低温研磨将(g)的生物基质支架粉碎为约1μm至约100μm大小范围的生物基质颗粒；

i)在基础培养液中悬浮解冻(h)的生物基质颗粒；以及

j)将步骤(i)的生物基质颗粒分散至培养装置上，进而从生物组织产生生物基质支架，所述生物基质支架用于分散(例如，如本文所述的工业规模分散)至培养装置上。

本发明还提供了通过本发明方法产生的生物基质支架。

本发明的前述和其他方面现在将关于本文描述的其他实施方案来进行更加详细描述。应该理解的是，本发明可以以不同形式体现，并且不应该解释为限于本文所述的实施方案。还有，提供这些实施方案，使得本公开将彻底且完整，并且将本发明的范围充分地传达给本领域技术人员。

附图简要说明

图1A-E1：大鼠肝脏生物基质支架制备。(A)四步脱细胞化过程，包括灌注清洗、以PLA2和SDC脱脂、高盐量清洗、以及核酸酶处理用于核酸去除。(B-D)在大鼠生物基质支架制备中的四个阶段。(B)在用基础培养液灌注清洗10分钟后，肝脏变得苍白；(C)在脱脂期间，肝脏在GC下变得部分透明；(D)最终的完整支架在40分钟灌注后看起来透明；(E)以低放大倍数显示的生物基质支架。(E1)用若丹明标记的葡聚糖颗粒灌注的支架可视化表明了沿通道从大血管至细血管分支的渐增流量，且没有泄露，表明支架中的专有脉管。在不同阶段的生物基质支架的相应苏木精和伊红(H&E)染色表明，封装实质细胞的组织学结构如血管和网格状基质被保留，而细胞被去除。正常的大鼠肝门三联管结构由门静脉(PV)、肝动脉(HA)、和胆管(BD)组成(B1)；在脱细胞化过程期间，基质纤维随着细胞被逐渐去除而变得透明(C1)；对比(B1)和(D1)，脱细胞化肝门三联管区；D2和D3显示所有细胞从基质支架去除，但网状结构被保留，诸如血管、GC、及围绕实质细胞壁的网格状基质。

图2A-H：大鼠肝脏生物基质支架的TEM(A-C)和SEM(D-H)图像。(A)具有厚壁(W)的血管(BV)的低放大倍数。I型胶原(大箭头)是众多的并且包含不摄取重金属染料的纤维的横截面(白点、小箭头)。(B)血管壁的更高放大倍数显示了基膜(大箭头)、无定形弹性蛋白(*)和相关弹性纤维、少量的膜囊泡残留物(小箭头)、I型胶原带状纤维(箭头)和小纤维(小箭头)。小纤维可能是原纤蛋白(VI型胶原)，其与I型胶原密切关联且帮助组织I型胶原。(C)具有64nm带型模式的I型胶原的高放大倍数(箭头)。(D)具有薄壁(BV)的血管和更大血管(W)的壁的低放大倍数。(E)在更高放大倍数，大血管壁(W)是圆齿状的，与门三联管的肝动脉一致，参见(A)。在壁下是众多的I型胶原束(大箭头)，其由长分支型薄的、网状的(III型)胶原纤维(小箭头)连接。(F)大束的I型胶原具有特征性的平行纤维(大箭头)，其与各种较小纤维(箭头)和结节或珠状纤维(箭头)关联。(G)在平面中互连的大/小纤维的3D网络，其将边界形成例如为肝血窦。(H)网络的更高放大倍数显示了各种纤维(箭头)：III型胶原(更大直径直线)、弹性纤维或VI型胶原。

图3A-B：生物基质支架中胶原的化学分析和细胞外基质(ECM)成分的表达。(A)所有在胶原中发现的三种氨基酸的含量：羟脯氨酸(Hyp)、羟赖氨酸(Hyl)及甘氨酸(Gly)。数字表示每种氨基酸/1000氨基酸的残留。该数据显示脱细胞化过程中胶原含量显著增加，其从肝脏中＜0.2％至生物基质支架中的大于15％。(B)生物基质支架中基质分子的免疫组织化学染色，显示了肝脏生物基质支架中层粘连蛋白(LAM)、硫酸肝素(HS)、III型胶原(COL3)和纤连蛋白(FN)以及与血管壁残留物相关的典型的基膜蛋白的分布。在更高放大倍数，本领域技术人员可以观察基膜的主要成员，包括IV型胶原(COL4)、巢蛋白(Ent，也称为内功素)、层粘连蛋白(LAM)和基底膜聚糖(Per)，其是靠近门三联管的支架部分中HS-PG的形式。

图4A-D：生物基质支架中从门三联管至中央静脉的ECM成分的模式。正常肝脏(A)与肝脏生物基质支架(B)的从门三联管(1区)至中央静脉(3区)的组织学比较；两者都是苏木精/伊红染色切片。(C)该模型示意肝脏中干细胞和成熟谱系系统，其具有显示形成与肝分区相关的模式的代表性基质成分。成分以免疫组织化学的发现中的丰度的顺序列出。人肝脏中已知的谱系阶段在1区门静脉周围(门三联管周围)开始并且进行成熟，在3区中以凋亡细胞结束。在肝脏干细胞龛中鉴定的已知基质化学物包括透明质酸、III型胶原、与α6β4整联蛋白结合的形式的层粘连蛋白、以及弱硫酸化形式的CS-PG^43、44。只是在干细胞龛外侧发现IV型胶原、通常硫酸化的CS-PG和HS-PG、以及与αβ1整联蛋白结合形式的层粘连蛋白。HP-PG已经证实独特地位于中心周围^45、46。(D)肝脏中基质成分和它们的位置与生物基质支架中基质成分及其位置的比较的研究，从免疫组织化学发现中总结的数据(N/D＝未测试。*由其他人员发现的仅仅靠近中央静脉)。细胞骨架的多数成分在清洗期间丢失，存在细胞骨架蛋白的一些残留物但非全部。支架缺乏可检测量的微管蛋白、肌间线蛋白和肌动蛋白(鬼笔环肽测定)。然而，存在在支架中随机分散着的痕量细胞角蛋白；在门三联管的血管残留物周围痕量的α平滑肌肌动蛋白；以及遍布的低水平的波形蛋白。

图5E-I：肝脏生物基质支架上与I型胶原上比较的hHpSC的表征。相差图像(A-D)显示了源自相同肝脏并在无血清Kubota′培养液中和在组织培养塑料(A)上和在I型胶原上(B)上培养的hHpSC集落的形态变化，所述组织培养塑料是一种用于自我复制的条件，其与对于肝脏的无血清分化培养液中的分化条件对比，所述I型胶原与在牛肝脏生物基质支架上(C-E)对比。有功能的和完全存活的培养物在I型胶原上存活不超过～2周。通过对比，在肝脏生物基质支架上的细胞是存活且健康的，且具有功能的所有组成成分，且持续至少一个月。培养物通过7-12天转换为具有增加的细胞质/细胞核比率和标记的糖原表达的细胞(C)，并且然后转换为具有通过清楚胆小管散布的典型多边形细胞形态的细胞(D)，所述培养形态在其后持续，如第24天的代表性培养物所显示的(E)。RT-PCR测定显示了第7天在培养塑料上(F)与在大鼠肝脏生物基质支架上(G)相比较、在自我复制条件下hHpSC的基因表达变化。我们对比以下表达，hHpSC标记，包括CXCR4和EpCAM；早期肝细胞基因，包括CK19(KRT19)、HNF6、FOXA2、AFP和低水平的白蛋白；成熟肝细胞标记，包括高水平的白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TF)、CYP450-3A4、酪氨酸转氨酶(TAT)、和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)，以及胆管上皮细胞基因，包括CFTR、伽马谷氨酰转肽酶(GGT1)、阳离子交换2(AE2)和顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)。生化测定测量I型胶原上与大鼠肝脏生物基质支架上的培养物中合成的尿素(H)，以及测量I型胶原上与由大鼠或牛肝脏制备的生物基质支架上的培养物中CYP450-3A4活性(I)。表7提供了定量测量的总结，其比较了在针对自我复制的培养条件下(III型胶原)、或在针对I型胶原与肝脏生物基质支架上相比的分化的条件下新鲜分离的hHpSC的附着、存活力、生长、培养生命周期、以及组织特异性基因表达。

图6A-D：在生物基质支架上由hHpSC谱系限制的细胞的免疫荧光染色。(A)以肝特异性标记白蛋白(Alb，浅灰色)染色和以肝干细胞表面标记EpCAM(白色)染色。注意的是铺板在生物基质支架上的细胞不表达EpCAM。比例尺＝200μm。(B)以早期肝标记甲胎蛋白(AFP，浅灰色)和针对人胆管上皮细胞标记细胞角蛋白19(CK19，白色)的抗体染色，所述标记在该表达水平显示成熟胆管上皮细胞。针对CK19的抗体测定是人特异性的，并且不染色没有细胞接种的支架中大鼠CK19处的残留物。AFP表达是低的但在第7天仍是明显的。比例尺＝200μm。(C)以Alb(浅灰色)和肝星形细胞标记、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA，白色)染色。白蛋白和ASMA的表达强烈显示正在成熟的肝细胞和星形细胞都存在。比例尺＝100μm。(D)以功能肝蛋白CYP450-3A4(浅灰色)和胆管上皮细胞特异性标记分泌素受体(SR，白色)染色，所述标记显示正在成熟的肝细胞和胆管上皮细胞是功能性的并且表达针对这两种细胞类型的典型标记。比例尺＝200μm。

图7A-D：生物基质支架上的完全功能性的、成熟人肝细胞的稳定性。成体肝细胞铺板在分化培养液中，以及铺板在I型胶原(A、B)上与牛肝脏生物基质支架(C)上对比，它们是低温粉碎的、分散在培养液中并允许沉积在板上。I型胶原上的细胞是完全存活的并且在第7-12天(A显示第7天)处于它们的分化峰值；它们在～2周后开始恶化，并通过20天(B)它们死亡、正在死亡和无功能。通过对比，铺板在肝脏生物基质支架上的那些细胞(C)持续至少8周是有功能的(还没有评估更长时间)；这里显示的21天后在粉碎的肝脏生物基质支架上的培养物中。对于铺板在生物基质支架上与I型胶原上相比的冷冻成体肝脏细胞的两种独立制备物的培养的CYP450-3A4测定，并且在第12天测定(D)。样本ZHep-007代表在解冻后具有良好附着的低温保存样本；样本ZL-013代表在解冻后具有差附着或无附着的那些批次。因此，即使这些更差质量的样本能够附着至生物基质支架并长期维持存活。在所测定的两种样本中，P450s水平在肝脏生物基质支架上培养时更高。随着在生物基质支架上的时间推移，更差质量的冷冻保存的批次将得到改进。

图8：通过脱氧胆酸钠激活磷脂酶A2来产生溶血卵磷脂。该方案的原理：由脱氧胆酸钠激活的磷脂酶A2(PLA2)将使位于细胞质膜和线粒体膜上的磷酸甘油酯降解为溶血卵磷脂，所述溶血卵磷脂是强力表面活性剂，其诱导细胞坏死。

图9：大鼠肝脏与大鼠肝脏生物基质支架相比的胶原组成分析。生物基质(黑色)和整个肝脏(浅灰色)的氨基酸成分以玫瑰图形式呈现。对于分析的每种氨基酸使用三字母缩写。没有分析色氨酸和半胱氨酸。数字显示氨基酸残基/1000。

图10A-C：大鼠肝脏生物基质支架的核酸分析。肝脏生物基质载玻片的相差图(A)和荧光DAPI染色(B)，以及来自大鼠新鲜肝脏组织与生物基质支架(C)相比的总DNA及RNA的定量测定。

图11A-C：在将hHpSC铺板至生物基质支架上以后的生物基质支架的染色。活体(钙黄绿素-AM，白色)/死亡(溴化乙锭或EtD-Br₁，浅灰色)测定显示hHpSC集落在生物基质支架切片上是存活的，但在集落中部(A、B)在前几天没有摄取染料，这是由于干细胞中的已知泵(例如MDR1)消除了活体染料。在(B)中，荧光图像与相位图像合并以显示集落中间含有细胞。通过7天，整个集落的细胞已经分化并在几乎整个集落的所有细胞中摄取活体染料(C)。

图12A-F：在I型胶原上培养的大鼠肝细胞与在大鼠肝脏生物基质支架上培养的大鼠肝细胞的对比。第3天(A、C)和第10天(B、D)在I型胶原上和生物基质支架上培养的成体大鼠肝细胞。它们在几分钟内附着在肝脏生物基质支架上并存活与测试一样长的时间，持续大于8周(C、D)；没有测试更长时间。培养物在生物基质支架上是非常三维的。在第1、3、5、7、10、14、21和28天的尿素合成(E)和细胞存活力测定(F)，n＝3。

图13A-D：人胰腺与人胰腺生物基质支架的对比。嵌入石蜡中、切片并以苏木精和伊红(H&E)染色的人胰腺(A)与人胰腺生物基质支架(B-D)的对比。胰岛结构已经在B中描绘出。胰腺生物基质支架的腺泡区在C和D中显示。

图14：在人胰腺组织中与大鼠胰腺生物基质支架中相比发现的代表性基质成分和一种细胞骨架成分波形蛋白。没有发现可检测量的其他细胞骨架成分(肌间线蛋白、微管蛋白、肌动蛋白)或发现痕量的细胞骨架成分(细胞角蛋白)。虚线环绕胰岛，注意的是多配体聚糖1和VI型胶原在胰腺组织和生物基质支架的胰岛中都是强阳性的。多配体聚糖1仅在胰岛中(虚线)发现而没有在腺泡细胞中(箭头)发现；III型胶原在腺泡细胞中和血管周围(箭头)更富集，但在胰岛中没有。

图15A-C：人十二指肠生物基质支架的组织学和免疫组织化学染色。(A)人十二指肠生物基质支架的外侧和腔侧。在H&E染色切片中对比正常组织(B)和生物基质支架(C)之间的多层结构，并且结果显示支架保留黏膜层和黏膜下层中的绒毛和血管。下图显示，人十二指肠生物基质支架的免疫组织化学染色显示保留在支架中可变数量的细胞外基质蛋白。

图16A-D：人胆囊组织与人胆囊生物基质支架的对比。人胆囊组织(A、B)与由其制备的生物基质支架(C、D)的对比。组织和生物基质支架嵌入在石蜡中、切片并以苏木精和伊红染色。

图17：以1∶24稀释的生物基质溶液的制备实例。30mlx3＝90ml。30ml生物基质+90ml溶液5＝120ml以1∶24稀释的生物基质溶液。

发明详细描述

现将在下文中更加全面地描述本发明。然而本发明可以以不同形式体现并不应该被解释为限于本文所述的实施方案。还有，提供这些实施方案以使得本公开将彻底且完整，并且将本发明的范围充分地传达给本领域技术人员。

本文中本发明说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在对本发明的限定。如本发明说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该”(the)还旨在包括复数形式，除非上下文中另有清楚的显示。

除非另有限定，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还将理解的是，术语诸如在通常使用的词典中定义的那些，应该解释为具有与在本申请上下文和相关领域中的它们的含义相一致的含义，且不应该解释为理想化的或过于正式的含义，除非本文明确这样限定。本发明说明书中所使用的术语在本文中仅是用于描述特定实施方案的目的并且不旨在对本发明的限定。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用并入本文。

而且，如本文中所使用的，“和/或”是指并包括相关列出项中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及在解释为可替代的(“或”)时没有组合。

除非上下文另有显示，特别期望的是，本文中所描述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还考虑在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征组合。为了示意，如果说明书声明复合物包括成分A、B和C，特别期望的是，可以单独或以任何组合省略或放弃A、B或C中的任一个、或其组合。

如本文中所使用的，过渡词“基本由…组成”(以及语法变体)应该解释为包括所述的材料或步骤，“以及那些非本质上影响要求保护的发明的一个或多个基本和新的特征”的材料或步骤。参见InreHerz，537F.2d549，551-52，190U.S.P.Q.461，463(CCPA1976)(原文中强调)；还参见MPEP§2111.03。因此，本文中所使用的术语“基本由…组成”不应该解释为等同于“包括”。

如本文中所使用的术语“约”在是指可测量值如量或浓度(例如，生物基质支架中总蛋白中胶原的百分比)等时，旨在包括所指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变化。

本发明涉及生物基质支架的发现和开发，所述生物基质支架比现在已知的脱细胞化的组织支架具有意外的改进和优势，改进和优势的一些实例是使用本发明的生物基质支架有效维持成熟细胞和/或谱系限制和/或使干细胞分化为成熟命运和/或维持该成熟细胞在长期的一段时期有功能。作为进一步实例，使用本发明的生物基质支架将产生成熟命运的细胞的时间从约3-6周或更多降低至约1-2周。本发明的生物基质支架使用特定方案来产生，其针对给定组织利用盐浓度和离子强度(不同胶原具有不同溶解度常数(23))的适当平衡，以使得保留以不溶形式存在于该组织中的天然胶原，导致生物基质支架保留了高百分比的天然胶原，所述天然胶原提供信号以驱动谱系限制和分化。作为对比，根据已知方案产生的脱细胞化支架没有利用使得保留高百分比的这些天然胶原的这样的盐浓度和离子强度的平衡，而大部分这些天然胶原在使用这些已知方案时丢失。此外，本发明的生物基质支架允许产生谱系依赖(例如，分化依赖的)病毒和/或病原体，其数量足以用于实验和/或治疗用途(例如，用于疫苗生产)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了从生物组织产生生物基质支架的方法，其包括如下步骤：a)用第一培养液灌注生物组织或使该生物组织均质化，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，以及所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后b)在所述第一培养液中用包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆；然后c)用处于中性pH且包含约2.0MNaCl至约5.0M的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持生物组织中鉴定的胶原不溶；然后d)在缓冲液中用核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后e)用处于中性pH、无血清、且具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg重量摩尔渗透压浓度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或匀浆，进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物组织支架包含未处理生物组织的至少95％(例如，80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％)的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和细胞因子。本文还提供了通过本发明的任何方法产生的生物基质支架。

如本文中所使用的“生物基质支架”是指细胞外基质中富集的分离的组织提取物，如本文所述，其保留了生物组织中天然存在的许多或大部分胶原和胶原结合因子。在一些实施方案中，基本所有的胶原和胶原结合因子被保留，以及在其他实施方案中，生物基质支架包含所有已知在该组织中的所有胶原。生物基质支架可以包含天然生物组织中发现的任何组合的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的胶原、胶原结合基质成分、和/或基质结合生长因子、激素和/或细胞因子。在一些实施方案中，生物基质支架包含生物组织中至少95％的胶原和大部分胶原结合基质成分和基质结合生长因子、激素和/或细胞因子。如本文中所述的，“生物组织的大部分胶原结合基质成分和基质结合生长因子、激素和/或细胞因子”是指生物基质支架保留天然(例如，未处理)生物组织中发现的约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的胶原结合基质成分和基质结合生长因子、激素和/或细胞因子。

示例性胶原包括所有类型的胶原，诸如但不限于I型至XXIX型胶原。生物基质支架可包含天然生物组织中发现的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更多的一种或多种胶原，和/或可具有一种或多种胶原，所述胶原以天然生物组织中发现的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更大的浓度存在。在生物基质支架中胶原的量可以通过本领域已知的以及如本文所述的各种方法来确定，诸如但不限于确定羟脯氨酸含量。

示例性胶原结合基质成分包括但不限于，粘附分子；粘附蛋白；L-和P-选择蛋白；肝素结合生长相关分子(HB-GAM)；血小板反应蛋白I型重复序列(TSR)；淀粉样蛋白P(AP)；层粘连蛋白；内功素/巢蛋白；纤连蛋白；弹性蛋白；波形蛋白；蛋白聚糖(PG)；硫酸软骨素-PG(CS-PG)；硫酸皮肤素-PG(DS-PG)；富含小亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)家族成员，如双糖链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖；肝素-PG(HP-PG)；硫酸肝素-PG(HS-PG)，诸如磷脂酰肌醇聚糖、多配体聚糖、和基底膜聚糖；以及葡萄糖胺聚糖(GAG)，诸如透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、和肝素。在一些实施方案中，生物基质支架包含(以任何组合)结合至各种基质成分的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、内功素/巢蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、生长因子、激素、以及细胞因子，由其组成，或基本由其组成(以任何组合)。生物基质支架可包含天然生物组织中发现的至少约50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更多的一种或多种胶原结合基质成分、激素和/或细胞因子，和/或可具有一种或多种这些成分，所述成分以在天然生物组织中发现的至少约50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或更大的浓度存在。在一些实施方案中，生物基质支架包含已知在组织中的所有或大部分的胶原结合基质成分、激素和/或细胞因子。在其他实施方案中，生物基质支架包含一种或多种胶原结合基质成分、激素和/或细胞因子，基本由其组成，或由其组成，其浓度处于接近于那些在天然原始生物组织中发现的浓度(例如天然组织所发现浓度的约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％)。

示例性生长因子包括但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF结合蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、以及血管内皮生长因子(VEGF)。示例性细胞因子包括但不限于白细胞介素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。生物基质支架可包含天然生物组织中发现的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、100％或更多(以任何组合)的一种或多种基质结合生长因子和/或细胞因子，和/或可具有一种或多种这些生长因子和/或细胞因子(以任何组合)，其以天然生物组织中发现的浓度的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、100％或更大的浓度存在。在一些实施方案中，生物基质支架包含生理水平或接近生理水平的已知在天然组织中和/或在组织中检测的许多或大部分基质结合生长因子、激素和/或细胞因子，以及在其他实施方案中，生物基质支架包含一种或多种基质结合生长因子、激素和/或细胞因子，其浓度接近于天然生物组织中发现的那些生理浓度(例如，对比差异不超过约30％、25％、20％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％)。在生物基质支架中存在的生长因子或细胞因子的量或浓度可以通过本领域已知的和如本文中所述的各种方法来确定，诸如但不限于各种抗体测定和生长因子测定。

如本文中所使用的“生物组织”是指活体或死亡生物体的任何组织或源自活体或死亡生物体的任何组织。如本文中所使用的术语“天然生物组织”及其变化是指当其以其天然或未修饰状态存在于生物体中的生物组织。本发明的生物基质支架可以由任何生物组织制备。生物组织可包括任何单一组织(例如，可以被互连的细胞的集合)或组成生物体的器官或部分或区域的一群组织。组织可包括均质细胞材料或者它可以是复合结构诸如在包括胸部的身体的区域中发现的复合结构，其例如可以包括肺组织、骨骼组织、和/或肌肉组织。

本发明的示例性生物组织包括但不限于肝脏、肺脏、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾脏、大脑、胆系、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏和肠，包括它们的任何组合。生物组织相关或来源的生物体(即，受试者)可以是任何动物，包括哺乳动物和非哺乳动物如无脊椎动物。

示例性受试者包括但不限于哺乳动物，例如但不限于：人、小鼠、大鼠、白鼬、仓鼠、兔、豚鼠、猪(pigs)、猪(porcine)、狗、猫、马、牛、绵羊、猴、和黑猩猩，以及非哺乳动物，例如但不限于：鸟类、爬行动物、和无脊椎动物。受试者可以是任何年龄和/或大小。生物组织可以是健康的、病变的、和/或具有基因突变。在一些实施方案中，本发明的生物基质支架在其化学和功能性方面是组织特异的，即所述生物基质支架在它们的化学和功能性方面是代表产生它们的生物组织，或与之相当。

在一些实施方案中，天然组织和专有脉管(patentvasculatures)保留在生物基质支架中。这可以包括生物组织的主要组织实体的可识别残留物，例如但不限于针对任何组织的血管和其他脉管；肝脏的胆管和格利森氏囊(GC)；胰腺管，胰腺的胰岛和腺泡；肺的支气管、气管和肺泡，等。在其他实施方案中，生物基质支架的化学物与组织学匹配(例如，血管周围的基质不同于肝细胞周围的基质)。在一些实施方案中，生物基质支架的化学物处于与组织学相关的梯度中。例如，在生物组织是肝脏时，生物基质支架可以保留基质化学的梯度，所述基质化学的梯度与从门三联管至中央静脉的肝腺泡区1-3相关以及与组织学实体诸如血管通道及格利森氏囊(GC)相关。其他实例包括但不限于，血管，其中血管周围基质的化学物充满高水平的网络胶原(例如，IV型和VI型)、弹性蛋白、各种形式的HS-PG；门静脉周围区域(区1)的肝细胞周围，其中层粘连蛋白连同CS-PG及HS-PG的混合物具有高浓度，而在中心周围区(区3)周围，是由HS-PG及HP-PG的混合物围绕的肝细胞；与胆管相关的，其中存在高水平的I型胶原、纤连蛋白、以及各种形式的CS-PG及DS-PG。在每种组织中存在基质化学的平行梯度。

存在多种冲洗培养液，诸如第一和第二培养液，以及可用于本发明中的缓冲液。特别的，可以使用以不溶状态维持胶原和结合因子(例如，基质成分、生长因子、以及细胞因子)的任何冲洗培养液或缓冲液。在选择培养液或缓冲液时，盐浓度、pH、及离子强度应该适于以不溶状态维持胶原和/或大部分或许多胶原结合基质成分以及其他因子(例如，依靠它们与胶原直接或间接的化学连接)。表1提供了针对各种类型胶原的氯化钠的摩尔浓度范围以帮助本领域普通技术人员提供确保胶原、胶原结合基质成分、及基质结合生长因子和细胞因子维持不溶的培养液或缓冲液。Deyl等人(″Preparativeproceduresandpurityassessmentofcollagenproteins″JournalofChromatographyB790(2003)245-275)另外提供了关于胶原化学物的信息，其可以促进鉴定用于维持不溶状态的胶原和结合因子的最佳条件，并且其全部内容通过引用并入本文。

表1表明pH是与盐浓度一起作用来限定溶解度的变量。通过具有高盐浓度，pH可以是中性的。在本发明的一些实施方案中，所选择的盐浓度是维持不溶状态的所有组织胶原的浓度，而不是仅维持不溶状态的一种组织胶原的浓度。例如，胎儿肝脏中已知的胶原在约4.5MNaCl的盐浓度中是不溶的，而成体肝脏组织中的那些胶原在约3.4M-3.5MNaCl的盐浓度中是不溶的。

冲洗培养液和/或缓冲液中任何的重量摩尔渗透压浓度可以例如是200mOsm/kg至约400mOsm/kg、约250mOsm/kg至约350mOsm/kg、约275mOsm/kg至约325mOsm/kg、或约300mOsm/kg至约325mOsm/kg，包括但不限于这些范围内非明确陈述的任何值。蒸馏水和稀释缓冲液(例如，具有重量摩尔渗透压浓度＜100mOsm/kg)将导致大量胶原、胶原结合基质成分和基质结合生长因子及细胞因子的损失。因此，在本发明的方法的一些实施方案中，不包括蒸馏水和稀释缓冲液。

如本领域普通技术人员应该意识到的，重量摩尔渗透压浓度是每质量溶质渗透浓度的表达，而摩尔渗透压浓度是每体积的溶质。因此，从摩尔渗透压浓度至重量摩尔渗透压浓度的转化可以通过乘以质量密度得到。重量摩尔渗透压浓度可以使用测量依数性质的渗压计测量，所述依数性质诸如凝固点下降、蒸汽压、及沸点升高。

摩尔渗透压浓度是溶质浓度的量度，定义为每升(L)溶液中溶质的渗透压摩尔(Osm)数(osmol/L或Osm/L)。溶液的摩尔渗透压浓度通常表示为Osm/L。而摩尔浓度测量每单位体积溶液中溶质的摩尔数，摩尔渗透压浓度测量每单位体积溶液中溶质颗粒的渗透压摩尔数。重量摩尔渗透压浓度是每千克溶剂中溶质的渗透压摩尔(osmol/kg或Osm/kg)的量度。

摩尔浓度和摩尔渗透压浓度由于它们是温度依赖的而在渗透压测定中是不常用的。这是因为水随着温度改变其体积。然而，如果溶质浓度非常低，摩尔渗透压浓度和重量摩尔渗透压浓度则认为是相等的。

溶液的摩尔渗透压浓度可以由下面表达来计算：

其中是渗透系数，其解释溶液的非理想性程度；n是分子解离的颗粒(例如，离子)数；C是溶质的摩尔浓度；以及系数i表示特定溶质的身份。在最简单情况下，是溶质的解离度。然后，介于0和1之间，其中1表示100％解离。然而，还可以大于1(例如，对于蔗糖)。对于盐，静电效应导致即使在发生100％解离时也小于1。

用任何培养液或缓冲液对生物组织的灌注可通过迫使培养液或缓冲液通过过生物组织的相关脉管来完成。例如，如果生物组织是肝脏，则培养液或缓冲液可以灌注通过过肝脏的门静脉。可替代的，培养液或缓冲液可以倾注在生物组织上和/或允许扩散通过生物组织。例如，生物组织可以在培养液或缓冲液中淹没和/或透析，以允许培养液或缓冲液扩散通过生物组织。在培养液或缓冲液中淹没和/或透析的同时可以摇动诸如在摇杆上和/或搅拌溶液和生物组织。在一些实施方案中，培养液和缓冲液灌注通过生物组织的相关脉管。

可替代的，可以在初始的培养液和缓冲液以及然后用于匀浆提取的培养液中将组织均质化。生物基质支架的均质化形式由大器官(例如，来自牛或猪组织)制备，然后在液氮温度下粉碎成粉末，并将该粉末用在皿上用于培养研究。

在一些实施方案中，第一培养液和/或第二培养液是基础培养液，诸如但不限于RPMI1640、DME/F12、DME、F12、BME、DMEM、Waymouth培养液、或William培养液。其他示例性基础培养液是本领域已知的且是市售的。第一培养液和/或第二培养液可以包含如本文所述的(例如，通过重量摩尔渗透压浓度和离子强度的特定组合并且没有血清)被组合以保持大部分胶原不溶并作为天然分子的成分，基本由其组成，或由其组成。第一培养液和/或第二培养液可以包含存在或类似于或模拟存在于组织液中的那些组分的组分，由其组成，或基本由其组成，所述组分诸如但不限于：水；盐，诸如但不限于无机盐；维生素；矿物质；氨基酸，诸如但不限于甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、和/或谷氨酰胺；糖；脂肪酸；辅酶；激素；以及神经递质。在某些实施方案中，其中第一培养液和/或第二培养液包括存在或类似于或模拟存在于组织液中的那些组分的组分，这些组分可以产生约等于市售基础培养液的重量摩尔渗透压浓度的重量摩尔渗透压浓度，或产生约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，第一培养液和/或第二培养液包括无血清、包含存在于组织液中的组分、和/或具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的培养液。该培养液还可以是处于中性pH。第一培养液和/或第二培养液的具体成分在特定实施方案中通过用于制备生物基质支架的生物组织胶原的不溶性常数来确定，这对于本领域普通技术人员来说是已知的。

本发明的脱脂缓冲液应该是有效且还是温和的。脱脂缓冲液可以包含去污剂或表面活性剂、基础培养液、盐、和/或脂肪酶，由其组成，或基本由其组成。在选择用于脱脂缓冲液的成分时，应该避免强力去污剂(例如，十二烷基硫酸钠；TritonX-100)以使基质成分的损失最小化。本发明的示例性去污剂包括但不限于阴离子去污剂，诸如脱氧胆酸盐、1-庚烷磺酸、N-月桂酰肌氨酸、月桂烷硫酸盐、1-辛烷磺酸和牛磺胆酸的盐；阳离子去污剂，诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基吡啶、氯化甲基苄甲乙氧铵、以及十烃溴铵；两性离子去污剂，诸如烷基甜菜碱、烷基酰胺烷基甜菜碱、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸盐、以及磷脂酰胆碱；以及非离子去污剂，诸如正癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基β-D-麦芽吡喃糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、山梨聚糖酯、正十四烷基β-D-麦芽糖苷、曲拉通、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、以及任何去污剂吐温组；月桂基硫酸钠；以及脱氧胆酸钠。在一些实施方案中，脱脂缓冲液包括脱氧胆酸钠。

示例性脂肪酶包括但不限于：磷脂酶如磷脂酶A2、人胰脂肪酶、鞘磷脂酶、溶酶体脂肪酶、内皮脂肪酶、以及肝脂肪酶。在一些实施方案中，脱脂缓冲液包括磷脂酶A2。在其他实施方案中，脱脂缓冲液包括脱氧胆酸钠和磷脂酶A2。在一些实施方案中，该组合可以包含约20至约50单位/L的磷脂酶A2和约1％的脱氧胆酸钠，其在中性pH和无血清的基础培养液中制备，其可以是例如第一培养液。脱氧胆酸钠和磷脂酶A2的组合将位于细胞质膜和线粒体膜上的磷酸甘油酯快速降解为溶血卵磷脂，其是一种强力的表面活性剂，可诱导坏死和细胞裂解。如本领域普通技术人员可以意识到的，脂肪酶和/或去污剂的量和类型可取决于生物组织。

在一些实施方案中，进行用脱脂缓冲液灌注生物组织的步骤，直至组织变得透明。在其他实施方案中，进行用脱脂缓冲液灌注生物组织的步骤，直至渗出液变得澄清。在一些实施方案中，进行脱脂步骤，直至组织变得透明并且渗出液变得澄清。

在一些实施方案中，避免生物基质支架延长暴露于来自破裂细胞的酶，因为它可以极大减少弹性蛋白含量和葡萄糖胺聚糖诸如硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、及肝素的含量，它们是细胞因子和生长因子结合的位点。例如在脱脂和/或脱脂后的随后的清洗期间可以避免暴露于来自破裂细胞的酶。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂的使用和/或pH、温度、和/或时间的小心控制可以用于限制来自破裂细胞的蛋白酶和/或其他酶的活性。

示例性蛋白酶抑制剂包括但不限于：丝氨酸蛋白酶抑制剂，诸如但不限于抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性酶抑制剂、苯甲磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽以及大豆胰蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶，诸如但不限于IAA(吲哚乙酸)和E-64；天冬氨酸蛋白酶抑制剂，诸如但不限于胃酶抑素和VdLPFFVdL；金属蛋白酶，诸如但不限于EDTA、1，10-邻二氮杂菲和磷酸阿米酮(phosphoramodon)；外肽酶，诸如但不限于氨肽酶抑制剂、苯丁抑制素、抑二肽素A和抑二肽素B；巯基蛋白酶；α-2-巨球蛋白、大豆或利马豆胰蛋白酶抑制剂；胰蛋白酶抑制剂；蛋清卵固蛋白；蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂；以及蛋白酶抑制剂的组合，通常被该抑制剂供应商称为“蛋白酶抑制剂混合物”。

生物基质支架、缓冲液、和/或培养液的pH可以维持在约6.0至约9.0、约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、或约7.5至约8.0。在一些实施方案中，生物基质支架、缓冲液、和/或培养液的pH维持在约7.5至约8.0或维持在约7.3至约7.5，包括但不限于包括在这些范围内但本文未明确陈述的任何值。在其他实施方案中，生物基质支架、缓冲液、和/或培养液维持中性pH。生物基质支架(例如，在制备期间和/或制备后)、缓冲液、和/或培养液的温度可以是约0℃至约30℃、约5℃至约25℃、或约10℃至约20℃，包括但不限于包括在这些范围内但本文未明确陈述的任何值。在一些实施方案中，温度维持在约20℃。用于以任何培养液或缓冲液灌注生物组织的时间可以是约5小时或更少、约3小时或更少、约1小时或更少、约30分钟或更少、或约15分钟或更少。在一些实施方案中，以脱脂缓冲液灌注生物组织的步骤为约30分钟或更少。在其中使用酸性pH的一些实施方案中，用于维持胶原和胶原结合成分不溶的盐浓度可以是不同的；该浓度可以通过现有关于胶原化学的文献通过选择维持胶原不溶性的盐浓度来确定。

示例性缓冲液包括但不限于氯化钠、乳酸钠、醋酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸盐缓冲液、bis\tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸钾、柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠、氯化铵、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸、三(羟甲基)甲胺、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、以及3-(N-吗啉基)丙磺酸。

在一些实施方案中，本发明的缓冲液(例如，用于本文描述步骤中的缓冲液)可以包含约2.0M或更高浓度的盐。例如，在一些实施方案中，盐浓度可以是约2.0M至约5.0M、约2.5M至约5.0M、约3.0M至约4.5M、或约3.0M至约4.0M，包括但不限于包括在这些范围内但本文未明确陈述的任何值。例如，在一些实施方案中，用于本发明方法中的缓冲液可以包含盐诸如氯化钠，其浓度为约2.0MNaCl至约4.5MNaCl。在其他实施方案中，诸如对于成体肝脏的那些，所用的缓冲液可包含约3.4M至约3.5MNaCl。在实施方案诸如对于胎儿肝脏的实施方案中，所用缓冲液可包含盐诸如氯化钠，其浓度为约4.0M至约4.50M。在一些实施方案中，进行用盐清洗液灌注生物组织，诸如本文所描述的示例性方法中步骤c)中的，直至灌注液(即，用于灌注的液体，诸如已经迫使通过脉管的液体)通过280nm光密度(OD)对于蛋白是阴性的。

本发明的任何培养液和/或缓冲液可包含蛋白酶抑制剂。示例性蛋白酶抑制剂如上所述。在一些实施方案中，缓冲液，诸如本文所描述的示例性方法的步骤c)中的缓冲液，包含蛋白酶抑制剂，诸如大豆胰蛋白酶抑制剂。在其他实施方案中，步骤d)的缓冲液包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如大豆胰蛋白酶抑制剂。

本发明的培养液和/或缓冲液可以包含一种或多种核酸酶，其在一些实施方案中可在这些酶的供应商所推荐的标准缓冲液中制备。例如，在一些实施方案中，步骤d)的缓冲液包含一种或多种核酸酶，诸如但不限于RNase和DNase。以核酸酶灌注消除了核酸的残留。在其他实施方案中，步骤d)的缓冲液包含RNase、DNase，以及一种或多种蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，以一种或多种核酸酶进行生物组织的灌注，直至灌注液(即，用于灌注的液体，诸如已经迫使通过脉管的液体)通过260nm光密度(OD)对于核酸是阴性的。在一些实施方案中，核酸酶消除了生物组织中75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的核酸。

第二培养液(例如，最后的冲洗培养液)可以是如上述的确保胶原和结合因子(例如，基质成分、生长因子、和细胞因子)将保持不溶的任何培养液。示例性最终冲洗培养液是如上述关于第一培养液所描述的，并且是无血清的、处于中性pH、且具有250-350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。例如，在一些实施方案中，第二培养液包括基础培养液。在一些实施方案中，第二培养液是无血清基础培养液。在其他实施方案中，第二培养液是无血清的、激素限定培养液(HDM)，其包含激素、生长因子、脂质、及血清白蛋白，并且其根据待培养细胞的需求来定制。示例性第二培养液是Kubota′s培养液(Kubota和Reid，PNAS97：12132-12137，2000)，其设计用于肝干细胞、肝母细胞和其他祖细胞。在某些实施方案中，第二培养液可包含或不包含血清或源自血清的因子的补充，诸如但不限于人血清白蛋白。在一些实施方案中，以第二培养液冲洗组织消除了脱脂缓冲液和核酸的残留。在其他实施方案中，用第二培养液和/或任何后续缓冲液或培养液的清洗使得用培养液或缓冲液平衡生物基质支架。在一些实施方案中，第一培养液和第二培养液可以是相同的，而在一些实施方案中，第一培养液和第二培养液可以是不同的，进而产生来自生物组织的生物基质支架。

在一些实施方案中，用于生物基质支架制备中的一种或多种培养液和/或缓冲液中没有(即，不包含可检测量的)使细胞外基质成分降解的一种或多种酶。在其他实施方案中，用于生物基质支架制备中的所有培养液和缓冲液没有(即，不包含可检测量的)使细胞外基质成分降解的一种或多种酶。示例性酶包括但不限于胶原酶；蛋白酶；糖苷酶，诸如肝素酶、乙酰肝素酶、软骨素酶、及透明质酸酶；以及弹性蛋白酶。

本发明的生物组织、匀浆和/或生物基质支架的消毒可以通过本领域已知的任何方法来完成，其中需要告诫的是应该避免使用可结合生物基质支架的因子(例如，环氧乙烷)的方法。示例性消毒方法包括但不限于伽马辐射、射频辉光放电(RFGD)等离子体消毒、电子束消毒、以及超临界二氧化碳消毒。在一些实施方案中，组织、匀浆和/或生物基质支架的消毒使用约5,000rads的伽马辐射来完成。如果支架立刻用于再细胞化，以及如果在脱细胞化过程中(特别是在高盐提取后)使用无菌程序，则可以无需消毒。

生物基质支架的保存可以通过本领域已知的方法来完成。在一些实施方案中(例如，在支架将完整使用时)，生物基质支架可以在约4℃下保存，以及在其他实施方案中(例如，在支架将分散为片时)，生物基质支架在例如约-80℃下冷冻。

在一些实施方案中，生物基质支架包含胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、内功素/巢蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖及其任何组合，由其组成，或基本由其组成，它们所有都是生物基质支架的部分(例如结合至生物基质支架)。在一些实施方案中，生物基质支架缺乏可检测量的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、内功素/巢蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖及其任何组合。

本发明的生物基质支架已经证实是细胞的有力分化基，并且可用于许多细胞类型，诸如但不限于任何成熟细胞或用于各种干细胞群体。这些包括，例如胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、胚层干细胞(例如，确定的内胚层干细胞)、决定干细胞(例如，肝、肺、胰或肠干细胞)、人肝干细胞(hHpSC)、围产期干细胞(例如，羊水来源干细胞(AFSC))、间充质干细胞(MSC)诸如来自骨髓或来自脂肪组织的、定向祖细胞、任何类型的成体细胞、病态细胞、肿瘤细胞、成熟细胞、实质细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、胆系细胞诸如不是胆管上皮细胞的那些、肝细胞、肾细胞、尿道上皮细胞、间充质细胞、平滑肌或骨骼肌细胞、肌细胞(肌肉干细胞)、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、纤维成肌细胞(fibromyoblasts)、内皮细胞、外胚层细胞包括韧性和皮肤细胞、神经细胞、胰岛细胞、存在于肠内的细胞、成骨细胞、形成骨或软骨的其他细胞、以及它们的任何组合。这些细胞可以是正常的或病态的。

在一些实施方案中，生物基质支架用于细胞的生物学、药学、遗传学、分子学、和/或病毒学研究，不论是新鲜分离自组织或分离自谱系限定干细胞。在其他实施方案中，生物基质支架用于可植入的、血管化的工程改造的器官，诸如但不限于肝脏。针对生物基质支架的其他示例性用途包括但不限于蛋白制造、药物毒理学测试、药物开发、抗体筛选、和/或病毒生产以用于病毒的疫苗制备。谱系依赖性病毒(例如，乳头瘤病毒和丙型肝炎)的病毒生产可以如下实现，即通过将干细胞群体铺板在组织特异性生物基质支架上，然后在培养液中培养，所述培养液与生物基质支架组合作用以完全诱导细胞的分化。这些成熟病毒体将在细胞完全成熟时产生。只要病毒自身没有影响细胞存活性，被病毒感染的成熟细胞可以维持至少八周，从而提供了用稳定培养系统来产生大量病毒的方法。

生物基质支架可以完整的使用，诸如但不限于用于细胞的2-D和/或3-D培养。在一些实施方案中，生物基质支架可以组合特定培养液使用以用于细胞系的2-D和/或3-D培养中的分化，诸如但不限于，来自于任何成熟谱系阶段的从干细胞至后期细胞的正常或病态细胞。

可替代的，生物基质支架可以冷冻。可以制备这些冷冻切片并用作基质。生物基质支架可以在干冰上快速冷冻，并且冷冻切片用低温恒温器制备、置于培养装置上(例如，皿、烧瓶、织物、转移孔等)，消毒和在培养液中再水化，然后接种细胞。在一些实施方案中，可以将本发明的冷冻生物基质支架切片。

在一些实施方案中，产生细胞培养物，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触步骤(a)的生物基质支架；以及c)用细胞接种步骤(b)的生物基质支架，进而产生细胞培养物。

在一些实施方案中，产生细胞培养物，其包括：a)产生本发明的生物基质支架；b)冷冻步骤(a)的生物基质支架；c)从来自步骤(b)的生物基质支架制备冷冻切片作为细胞培养基；d)在培养装置中用细胞培养的培养液接触步骤(c)的细胞培养基；以及e)用细胞接种步骤(d)的细胞培养基，进而产生细胞培养物。

在其他实施方案中，生物基质支架可以研磨为粉末。将生物基质支架研磨为粉末的一种方法包括在液氮温度或接近液氮温度的温度下在冷冻研磨机中将生物基质支架研磨为粉末。其他用于在液氮或等效温度下研磨(例如，用干冰冷冻)的装置是本领域已知的。粉末可以被带到室温，在室温下其获得涂料的稠度，可以使用无菌涂料刷或等效装置将所述涂料包被在培养装置上。所述粉末或板可以是消毒的。

因此，在一些实施方案中，产生细胞培养物，其包括：a)产生本发明的生物基质支架；b)将步骤(a)的生物基质支架研磨为粉末；c)用步骤(b)的粉末包被培养装置以产生细胞培养基；d)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(c)的细胞培养基；以及e)用细胞接种(d)的细胞培养基，进而产生细胞培养物。在该方法的一些实施方案中，在液氮温度或接近液氮温度下在冷冻研磨机(例如，低温研磨)中进行生物基质的研磨。

在一些实施方案中，在为了细胞培养而接种细胞之前，添加部分培养液至培养装置中，因为细胞可以在数秒内附着。在一些实施方案中，对正常成体细胞而言，细胞在数秒至数分钟内附着，而对各种类型的干细胞而言，细胞在数分钟至几个小时内附着。在一些实施方案中，细胞的附着可以取决于生物基质支架如何分散用于培养中使用。细胞培养液可以是适于产生细胞培养物的任何培养液。在一些实施方案中，细胞培养的培养液包含组织液中存在的至少一种组分，其中所述培养液的重量摩尔渗透压浓度为约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，其中所述培养液是无血清的且其中pH是中性的。在其他实施方案中，细胞培养的培养液可以是基础培养液，诸如但不限于RPMI-1640、DME/F12、Ham培养液、Kubota培养液，等。

在一些实施方案中，用生物基质支架产生的细胞培养物包含与用于制备生物基质支架的生物组织细胞相同类型的细胞，基本由其组成，或由其组成。本发明细胞的非限制性实例包括：胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、决定干细胞、围产期干细胞、羊水来源干细胞(AFSC)、来自任何来源的间充质干细胞(MSC)、任何组织类型的定向祖细胞或成体细胞、成熟细胞、正常细胞、病态细胞、肿瘤细胞及其任何组合。另外的非限制性实例包括肝脏细胞、实质细胞、星状细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、不是胆管上皮细胞的胆系细胞以及胰脏细胞。

在一些实施方案中，原始干细胞(不论是ES、iPS、MSC或AFSC)将，至少部分地，将细胞谱系限制为用于制备生物基质支架的组织类型。在支架由源自给定胚层的组织制备时，该胚层的决定干细胞将谱系限制为用于制备生物基质支架的组织类型，并且如果在源自不同胚层的组织的支架上，则可部分地分化为成体命运。因此，成体细胞完全分化的能力可由生物基质支架的组织类型确定。平行的，干细胞的命运可部分或完全由生物基质支架的组织类型确定，或干细胞的命运可完全由生物基质支架的组织类型确定。在一些实施方案中，细胞培养的细胞与用于制备生物基质支架的生物组织的细胞是不同类型的。如上所详细描述的，可以用于产生细胞培养物的示例性细胞类型包括但不限于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、羊水来源干细胞、决定干细胞、成熟细胞、正常细胞、病态细胞、肿瘤细胞及其任何组合。这些细胞可以来自本文所述的任何生物组织。

在一些实施方案中，生物基质支架诱导与正常细胞分化有关的缓慢生长或生长停滞，不论是干细胞或成熟细胞。在一些实施方案中，成熟细胞在数小时内完全分化，并且其后保持稳定分化持续至少八周。在一些实施方案中，成体细胞(即，完全成熟细胞)在数分钟内附着至支架，并且其后保持它们的完全分化持续超过八周。在一些实施方案中，干细胞经历几次分裂并且随后进入生长停滞并完全分化。干细胞在生长停滞中保持稳定，存活且完全分化，持续至少8周。在一些实施方案中，接种在生物基质支架上的干细胞进入生长停滞或缓慢生长，在大约一周内失去干细胞标记并分化为成熟、功能细胞，在、持续至少八周或更长内保持稳定表型和存活力(例如，持续延长时间期间(例如，至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周、至少16周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少11个月、至少一年，等)的40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的存活力)。

在其他实施方案中，生物基质支架用于将胚胎干(ES)细胞和/或诱导多能干(IPS)细胞分化为特定命运。例如，在一些实施方案中，组织特异性生物基质支架用于促进胚胎干细胞或诱导多能干细胞向特定命运分化。

在本发明的某些实施方案中，生物基质支架用于将羊水来源干细胞(AFSC)、或者来自骨髓或来自脂肪组织或来自任何胎儿或出生后组织的间充质干细胞(MSC)、或者任何决定干细胞(例如，肺、肠、胆系、肾、皮肤、心脏，等)向特定成体命运分化。在一些实施方案中，本发明的生物基质支架通过产生细胞培养物用于增强并加速干细胞分化为成熟细胞。在其他实施方案中，本发明提供了增强和/或加速干细胞和/或祖细胞分化为成熟细胞的方法，其包括根据本发明的方法产生细胞培养物，其中所述细胞是干细胞，以及细胞培养的培养液针对成熟细胞配制，从而增强和/或加速干细胞和/或祖细胞分化为成熟细胞。细胞培养的培养液可以是针对成熟细胞配制的任何培养液。培养液中的组分对每种细胞类型是不同的。分化意味着这些条件引起细胞成熟为产生成体特异性基因产物的成体细胞类型。用于这些方法中的细胞可以是任何类型的成体细胞或干细胞或祖细胞，其非限制性的实例包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胚层干细胞、决定干细胞、围产期干细胞、羊水来源干细胞、间充质干细胞、短暂扩增细胞、或任何组织类型的定向祖细胞。

可以将接种在生物基质支架(例如，完整生物基质支架、支架切片或混合在其他可植入材料中/上的粉末状生物基质支架)上的细胞移植进动物或人作为体内移植细胞的方法。在一些实施方案中，提供了将细胞递送至受试者的方法，其包括用本发明的生物基质支架接触所述受试者，其中所述生物基质支架包含细胞。在其他实施方案中，提供了将细胞递送至受试者的方法，其包括用细胞接种本发明的生物基质支架，并且然后将所述用细胞接种的生物基质支架移植进受试者。在一些实施方案中，可以将没有用任何细胞接种的生物基质支架移植进受试者。

在一些实施方案中，生物基质支架可以用作移植物，所述移植物可用于在受试者中再生组织或器官。

本发明的生物基质支架可用于建立生物人工器官，其在分析和/或临床项目中是有用的。生物基质支架还可用于鉴定特定基因产物或疾病状态的方面。在一些实施方案中，生物基质支架由突变动物的组织制备，并且随后用于定义与一种或多种突变相关的一种或多种相关因子。在其他实施方案中，生物基质支架由病态组织制备，并用于定义与疾病相关的基质中的变化。

使用本发明的生物基质支架的其他非限制性实例包括：1)使用该支架用于培养恶性细胞，以定义转移潜能(肿瘤细胞在给定类型的生物基质支架上形成细胞生长集落的能力预示细胞转移至用于制备该支架的组织的能力)；2)将组织移植物置于支架上，其用于移植进受试者；3)产生通过支架的再细胞化形成的类器官，其用作辅助装置，诸如，例如肝脏类器官，所述肝脏类器官然后连接至具有肝脏衰竭的受试者；4)使用支架用于蛋白制备(支架上的细胞产生可以从培养液和/或从细胞分离并且然后纯化的因子)；以及5)使用支架用于产生谱系依赖性病毒；例如用于产生需要分化细胞以产生足够颗粒用作疫苗的病毒。

因此，本发明提供了鉴定组织类型中肿瘤细胞的转移潜能的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(a)的生物基质支架；c)用肿瘤细胞接种(b)的生物基质支架；d)在培养条件下维持(c)的生物基质支架；以及e)监控(d)的生物基质支架上肿瘤细胞的生长，其中生物基质支架上肿瘤细胞的生长鉴定该肿瘤细胞可以在体内在产生所述生物基质支架的组织类型中形成集落，进而鉴定该肿瘤细胞在所述组织类型中的转移潜能。

本文中还提供了鉴定肿瘤细胞对于抗肿瘤治疗的响应的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(a)的生物基质支架；c)用肿瘤细胞接种(b)的生物基质支架；d)在培养条件下维持(c)的生物基质支架；e)将抗肿瘤治疗施加至生物基质支架上的肿瘤细胞；以及f)监控(e)的生物基质支架上肿瘤细胞的生长，其中(e)的生物基质支架上肿瘤细胞没有生长和/或肿瘤细胞的死亡鉴定该肿瘤细胞对于抗肿瘤治疗的响应。抗肿瘤治疗的非限制性实例包括：化疗剂、抗体、辐射治疗、免疫治疗、激素治疗等，这在本领域是公知的。在一些实施方案中，可以将来自受试者的肿瘤细胞接种到本发明的不同生物基质支架上，并暴露于各自的抗肿瘤治疗。根据这些不同抗肿瘤治疗的各自分析的结果，可以选择针对受试者肿瘤细胞有效的抗肿瘤治疗，并且可以将该抗肿瘤治疗施用于该受试者以治疗该受试者的肿瘤。

在其他实施方案中，本发明还提供了产生用于移植到宿主动物中的肿瘤移植物的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触步骤(a)的生物基质支架；c)用肿瘤细胞接种(b)的生物基质支架；d)在培养条件下维持(c)的生物基质支架；以及e)在(d)的生物基质支架上建立肿瘤细胞的群体，进而产生用于移植到宿主动物中的肿瘤移植物。在一些实施方案中，本方法还可以进一步包括将肿瘤移植物移植到宿主动物中的步骤。在各种实施方案中，肿瘤移植物针对宿主动物来说可以是同源的、同种异型的、或异种的。

本文还提供了产生谱系依赖性病毒的病毒颗粒的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(a)的生物基质支架；c)用可以被所述谱系依赖性病毒感染的类型和谱系阶段的细胞接种(b)的生物基质支架；d)用谱系依赖性病毒感染(c)的细胞；e)在培养条件下维持生物基质支架上的感染细胞；以及f)收集感染细胞中所产生的病毒颗粒，进而产生谱系依赖性病毒的病毒颗粒。

本发明的谱系依赖性病毒的非限制性实例包括丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、诺洛病毒、人乳头瘤病毒、以及现在已知或后来鉴定为谱系依赖性的任何其他病毒。谱系依赖意味着其中存在病毒的细胞必须在病毒在细胞内可以成功复制并产生病毒颗粒前成熟或分化至特定阶段，这是本领域已知的。

此外，本发明提供了产生通过生物组织支架的再细胞化形成的类器官的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(a)的生物基质支架；c)用与用于制备生物基质支架的生物组织相同组织类型的细胞接种(b)的生物基质支架；以及d)在培养条件下维持生物基质支架上的细胞，由此由所述细胞形成类器官，进而产生通过生物组织支架的再细胞化形成的类器官。该方法还可以包括使步骤(a)至(d)产生的类器官与受试者接触的步骤，其用作辅助装置，这是本领域所已知的。可以用于产生本发明的生物基质支架的任何细胞类型都可以用于本方法中。在一些实施方案中，细胞是肝脏细胞。

本发明另外提供了在生物基质支架上培养的细胞中产生目的蛋白的方法，其包括：a)根据本发明的方法产生生物基质支架；b)在培养装置中用细胞培养的培养液接触(a)的生物基质支架；c)用产生目的蛋白的细胞接种(b)的生物基质支架；d)在培养条件下在生物基质支架上维持(c)的细胞；以及e)收集由(d)的细胞产生的目的蛋白，进而在生物基质支架上培养的细胞中产生目的蛋白。该方法可以包括纯化步骤(f)中收集的目的蛋白的进一步的步骤。本发明的目的蛋白可以是由细胞以可以从培养的细胞和/或培养的培养液收集的量产生的任何蛋白，所述蛋白由内源基因和/或作为重组蛋白产生。这样的目的蛋白的很多实例在本领域是已知的。

本发明将在下面非限制实施例中进行更详细的解释。

实施例

实施例1：通过组织特异性生物基质支架有效地将人肝干细胞谱系限制为成熟命运

摘要：当前对于干细胞分化的方案使用可溶性信号和/或基质因子的多种处理，并通常通过成体组织特异性基因的低表达或过表达导致部分分化为成熟细胞。在本发明中，开发了用于干细胞的快速和有效分化的策略，其使用生物基质支架的基质、在细胞外基质中富集的组织特异性提取物、以及相关生长因子和细胞因子，结合对于目的成体细胞类型定制的无血清、激素限定培养液(HDM)。本文中所述的研究表明了本发明的生物基质支架在将人肝干细胞(hHpSC)分化为成熟命运以及持续长时间期间维持成熟实质细胞具有完全功能中的效力。通过新的四步灌注脱细胞化方案使用设计以保持所有胶原类型不溶的条件制备生物组织支架。所述支架保持了天然组织学、专有脉管以及约1％的组织蛋白但＞95％的其胶原、大部分的组织胶原结合基质成分、以及生理水平的基质结合生长因子和细胞因子。胶原从几乎不可检测的水平增加至＞15％的具有残留物的支架蛋白，其包括以与组织学相关的模式的层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、内功素/巢蛋白、蛋白聚糖、和基质结合细胞因子和生长因子。人肝干细胞(hHpSC)，接种在肝生物基质支架上和对于人成体肝脏细胞定制的HAM中，在大约一周内损失干细胞标记并分化为成熟、功能性实质细胞，其保持存活并具有稳定成熟细胞表型持续超过八周。因此，本发明的生物基质支架可以用于谱系限制干细胞的生物和药物研究、用于成熟细胞的保持、以及用于可植入的、血管化工程改造的组织或器官。

用于脱细胞化的程序：在以氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉后，打开大鼠腹腔并将具有插管的套筒插入门静脉中以灌注整个肝脏。(1)以RPMI1640进行灌注10分钟；然后(2)以脂肪酶(例如，20-50单位的磷脂酶A2-PLA2)结合温和的去污剂如1％脱氧胆酸钠(SDC)脱脂约30-60分钟，直至组织变得透明并且渗出液变得澄清；(3)以高盐清洗液(对于胎儿肝脏：4.5MNaCl，以及对于成体肝脏：3.4M-3.5MNaCl)进行灌注，直至灌注液在280nm处的光密度(OD)对于蛋白是阴性的；(4)在RPMI1640中以核酸酶(DNase、RNase)灌注，直至灌注液在OD260下对于核酸是阴性的；以及(5)用RPMI1640最后冲洗2小时或更长时间。

生物基质支架在干冰上快速冷冻并以低温恒温器制备冷冻切片，置于24孔细胞培养板上，通过伽马辐射(5000rads)消毒以及在培养液(KM)中再水化30分钟，然后接种细胞。生物基质支架切片覆盖24孔板中～95％的孔表面。

用于将生物基质支架分布在培养皿上的可替代方法包括使用填充有液氮的冷冻研磨机将生物基质支架粉碎为粉末。所粉碎的粉末，在带到室温下时，获得涂料的稠度，并可以包被在任何表面诸如皿、载玻片、织物、滤膜上或用于附着细胞和/或细胞培养的其他表面上。粉碎支架消除了基质成分和信号的梯度，但是存在的成分混合物仍然引起有效的分化效果。在制备用于体内移植或用于3-D培养的工程改造器官中，支架还可以完整使用以及用细胞再接种。

开发了可替代方法用于与猪和牛肝脏使用。猪和牛肝脏从USDA认证的肉类加工厂(CT)获得。对于代表性方案的概要，参见实施例3。每份肝脏都是USDA检查的并在出厂前接受USDA盖戳。肝脏在ESP-Gro培养液(Gigacyte，Branford，CT；目录号1101-250)中运输。实验室接收到的肝脏称重、拍照记录并准备用于灌注。在研磨后，混合物解冻并稀释到1∶48的培养液：生物基质比率。该生物基质浆然后用于包被板。在干燥后，生物基质清洗三次并然后施加细胞。成体肝脏细胞在10分钟内附着至板。干细胞/祖细胞可以使用更长时间(几小时)。然而，对于干细胞/祖细胞和成体肝脏细胞，基本100％的活细胞附着。

培养液和溶液：所有培养液是无菌过滤的(0.22-μm过滤器)并在使用前保持在4℃的黑暗中。为了在生物基质中保持胶原稳定，用于生物基质支架制备的灌注培养液的pH保持在7.5-8.0。使用RPMI-1640(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)作为基础培养液，其用于生物基质支架的制备和用于肝细胞或肝干细胞培养。所有试剂除了提到的那些以外都从Sigma(St.Louis，MO)获得。

用于生物基质支架制备的灌注培养液：

(1)、灌注清洗和灌注冲洗：无血清基础培养液(例如，RPMI-1640)；

(2)、以去污剂灌注：36单位/LPLA2加上1％SDC；

(3)、以高盐灌注：3.4MNaCl，其具有0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂；

(4)、以核酸酶灌注：5mg/100mlRNase、1mg/100mlDNase和0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(例如，在RPMI1640中制备)。

Kubota培养液：KM最初设计用于肝母细胞⁴⁷并且现在已经发现对于人肝祖细胞⁴⁸和对于其他内胚层祖细胞，包括来自胆系(Wang等人″Multipotentstem/progenitorcellsinhumanbiliarytreegiverisetohepatocytes，cholangiocytesandpancreaticislets″Hepatology，2011，出版中)和胰腺(Wang，Y和ReidL，未公开数据)的细胞是有效的。它由任何基础培养液(这里是RPMI1640)组成，所述基础培养液没有铜、具有低钙(0.3mM)、10^-9M硒、0.1％BSA、4.5mM烟酰胺、0.1nM七水合硫酸锌(来自Specpure，JohnsonMatthewChemicals，Royston，英格兰)、10^-8M氢化可的松、5μg/ml转铁蛋白/Fe、5μg/ml胰岛素、10μg/ml高密度脂蛋白、以及添加了结合至纯化的人血清白蛋白的游离脂肪酸的混合物。

为了将细胞分化至成体命运，可以使用对于所需成体细胞类型定制的无血清、激素限定培养基(HDM)。例如，我们使用HDM用于成体肝脏命运，所述HDM由KM组成，所述KM进一步补充钙以达到0.6mM浓度、10^-12M铜、1nM三碘化甲状腺氨酸(T3)、7ng/ml胰高血糖素、20ng/mlFGF、2g/L半乳糖、10ng/ml制瘤素M(OSM)、10ng/ml表皮生长因子(EGF)、20ng/ml肝细胞生长因子(HGF)、以及10^-8M氢化可的松。

如果铺板在支架上，将细胞接种在该无血清HDM中；在使用酶来处理细胞或组织的情况下，然后我们用5％FBS(HyClone，Waltham，MA)补充HDM持续几个小时，然后其后转到无血清HDM。在平行对照实验中，培养物始终保持在具有5％FBS的HDM中，但是我们发现血清的存在引起细胞随着时间失去分化功能。鉴于如此多因子结合至生物基质支架，与对于在其他给定基质上培养的通常情况相比需要更少的可溶性因子。鉴于如此多因子结合至生物基质支架，与对于在其他给定基质上培养的通常情况相比需要更少的可溶性因子。

肝脏生物基质支架中完整血管系(vasculartrees)的表征：大鼠肝脏生物基质支架中脉管包括毛细血管网络的分支(branching)和网状(ramifying)基质残留物分别通过光显微镜和荧光显微镜可视化。将若丹明标记的250kDa葡聚糖颗粒通过门静脉的残留物注射到肝脏生物基质支架中，以检查生物基质支架中脉管系统的基质残留物的完整性。使用LeicaMZ16FA荧光解剖显微镜(机动化)准备影片。

人胎儿肝脏处理：由认证机构(AdvancedBiologicalResources，SanFrancisco，CA)从通过选择妊娠终止获得的16-20周胎龄的胎儿提供胎儿肝脏组织。该研究方案由北卡罗来纳查佩尔山大学的针对人研究的机构审查委员会审查和批准。人胎儿肝脏细胞的悬浮液如先前描述地进行制备^48、49。简要的说，在补充0.1％牛血清白蛋白、1nM硒和抗生素的RPMI1640中进行处理。酶处理缓冲液含有300U/mlIV型胶原酶和0.3mg/ml脱氧核糖核酸酶，其在32℃频繁搅拌15-20分钟。将富集的缓冲液挤压通过75规格网，并以1200RPM旋转5分钟，然后再悬浮。通过台盼蓝排除法评估的细胞存活力通常高于95％。

hHpSC的富集和在生物基质支架上的培养：我们使用两种方法用于hHpSC的纯化或富集：

1)培养选择：将大约3×10⁵细胞铺板在10cm组织培养皿和KM中。每三天更换培养液。5-7天内形成集落并观察最长达3个月。我们在14-18天后使用倒置显微镜(1X-FLAIII；Olympus，Japan和Melville，NY)手动挑选集落。

2)使用MiltenyiBiotechMACS系统(BergischGladbach，德国)遵照厂商说明书通过使用磁珠免疫选择技术选择针对上皮细胞粘附分子(EpCAM和CD326)为阳性的细胞而实现专能肝祖细胞亚群(multipotenthepaticprogenitorsubpopulations，hHpSC和hHB)的磁性免疫选择⁵⁰。简要的说，在4℃，将解离的细胞与结合至磁性微珠的EpCAM抗体孵育30分钟，并使用来自Miltenyi的磁柱分离系统遵照厂商推荐程序进行分离。

用250hHpSC集落、或5×10⁵富集的hHpSC或2.5×10⁵的原代成体肝细胞接种培养物。每日更换培养液，并且所收集的培养液在-20℃下保存用于进一步分析。在包被I型胶原的24孔培养板上培养的细胞作为对照。

成体大鼠肝细胞分离：大鼠肝细胞的新鲜分离悬浮液从3个月大、重200-250g的成体雄性Lewis大鼠(CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)获得。使用如先前所述的改进两步灌注法⁴⁹用于大鼠肝细胞分离和纯化。用含有EGTA的无钙缓冲液灌注肝脏10-15分钟，然后在含有胶原酶的含钙缓冲液中灌注10-15分钟。然后通过挤压消化的肝脏穿过纱布并随后继续将细胞悬浮液通过狭窄网格尺寸的筛网来机械地解离肝脏。细胞清洗两次并然后在50g离心。通过在台盼蓝染色后计数细胞来定义存活力。通常，每只大鼠分离200-300百万细胞，存活力为89-96％，纯度为＞99％。

成体肝细胞分离和培养：从CellzDirect(现在是Invitrogen，RTP，NC的部分)获得新鲜的人肝脏细胞悬浮液。每种CellzDirect方法处理悬浮液，然后在HeptoMAIN培养液中(目录号1103-250；GigaCyte，Branford，CT)再悬浮，以1.88×10⁵细胞/cm²铺板在用肝脏生物基质支架包被的多孔培养板中或I型胶原上(1μg/ml、Meridian目录号A33704H)。

胶原化学分析：生物基质支架中的胶原量基于羟脯氨酸(hyp)含量来评估。粉碎、清洗并冻干整个肝脏的样本以及生物基质支架的样本。然后水解等分试样并进行氨基酸分析⁵¹，以及基于300残基/胶原的hyp值来评估每种总蛋白中的胶原量。

DNA和RNA含量的定量分析：为了评估保留在脱细胞化肝脏生物基质中的总DNA，称重新鲜大鼠肝脏组织和脱细胞化的生物基质，切割并用蛋白酶K消化，以及分离总的细胞DNA⁵²。为了评估保留在脱细胞化的肝脏生物基质中的总RNA，称重新鲜大鼠肝脏组织和脱细胞化的大鼠肝脏生物基质，然后在TRIzol溶液(Invitrogen)中均质化，以及分离总的细胞RNA。

生长因子测定：将大鼠肝脏、大鼠肝脏生物基质支架、人胆管组织和人胆管生物基质支架的样本(每种两个样本)送到RayBiotech，Inc(Norcross，Georgia)用于生长因子的分析。将这些样本均质化，制备为裂解物，并且然后用1mg/ml蛋白进行测定，产生荧光，所述荧光以荧光强度单位(FIU)定义。使用HumanGrowthFactorArrays，GSeries1进行半定量生长因子测定。FIU减去来自关于非特异性结合的阴性对照的FIU，并标准化为蛋白浓度。将来自一式两份的数据取平均值。使用四组阵列来实现针对～40种生长因子的测量。虽然该测定开发用于人生长因子，但是其在与大鼠生长因子的交叉反应中具有足够重叠以使得可以用于大鼠和人样本。

透射电子显微镜和扫描电子显微镜检查(TEM和SEM)：对于TEM，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗生物基质支架，并在pH7.4的3％戊二醛/0.1二甲胂酸钠中固定过夜。在以二甲肿酸钠缓冲液冲洗三次后，生物基质支架在1％四氧化锇/0.1二甲胂酸钠中后固定1小时。在去离子水中冲洗后，将其脱水并嵌入Polybed812环氧树脂(Polysciences，Niles，IL)中。使用金刚石刀垂直于基底以70nm切片生物基质支架。超薄切片收集在200网孔铜网上，并用4％水性醋酸双氧铀染色15分钟，然后用Reynolds′柠檬酸铅染色7分钟。使用以80kV操作的LEOEM910透射电子显微镜(LEOElectronMicroscopy，Oberkochen，Germany)观察样本。使用GatanOriusSC1000CCD数码相机和DigitalMicrograph3.11.0(Gatan，Pleasanton，CA)采集数字图像。

对于SEM，在固定和冲洗后，将生物基质支架脱水并在100％乙醇中转移至BalzersCPD-020临界点干燥机(Bal-TecAG，Balzers，Switzerland)，使用二氧化碳作为过渡溶剂干燥。该基质利用碳胶标签安装在铝质试样支持物上，并使用HummerX喷涂机(Anatech，WorcesterMA)用10nm厚的金钯合金(60∶40合金)包被。在5kV加速电压时使用ZeissSupra55FESEM检查样本并使用ZeissSmartSEM软件(CarlZeissSMT，Germany和Thornwood，NY)采集数字图像。

免疫细胞化学和免疫组织学：对于生物基质支架上培养的细胞的荧光染色，细胞在室温下以4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟，以HBSS冲洗，在HBSS中以10％山羊血清封闭2小时，并冲洗。固定细胞在4℃下用第一抗体孵育过夜，清洗，用标记的同种型特异性第二抗体孵育1小时，清洗，用4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)复染以用于细胞核的可视化，并使用LeicaDMIRB倒置显微镜(Leica，Houston，TX)观察。

对于免疫组织化学，生物基质支架在4％PFA中固定过夜并在70％乙醇中保存。它们嵌入石蜡中并切割为～5μm切片。对切片脱蜡，以及修复抗原。内源性过氧化物酶通过在0.3％H₂O₂溶液中孵育30分钟而封闭。在以10％马血清封闭后，在4℃施加第一抗体过夜；使用RTUVectastain试剂盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)进行第二抗体和ABC染色。VectorNovaRED用作底物。将切片脱水，固定并嵌入Eukitt封固培养液中(ElectronMicroscopySciences，Hatfield，PA)，并使用倒置显微镜分析。用于肝脏切片和用于培养的抗体列于表4中。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析：hHpSC在细胞培养板上培养，并且该集落转移到生物基质支架上。在进一步培养7天后，该集落裂解用于RT-PCR。使用RNeasyPlusMini试剂盒(QiagenGmbH，ValenciaCA)根据厂商说明书提取总RNA。使用SuperscriptFirst-StrandSynthesis系统进行逆转录用于RT-PCR(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用HotStarTaqMasterMix试剂盒(Qiagen)用于PCR。PCR引物列于表5中。

活体/死亡试验和细胞存活试验：活体/死亡存活力测定试剂盒(MolecularProbes/Invitrogen，Carlsbad，CA)用于粘附和增殖测定。hHpSC或肝细胞与两种探针钙黄绿素-AM(活体，浅灰色)和溴乙非啶同型二聚体-1(EtdD-1，死亡)孵育，分别用于细胞内酯酶活性和质膜完整性。在荧光OlympusSZX12立体显微镜(OLYMPUS，Japan和Melville，NY)下观察样本。遵循厂商手册使用刃天青细胞存活力测定试剂盒(Biotium，Hayward，CA)。简要的说，10％刃天青溶液添加至培养的培养液中并在37℃下孵育过夜。使用BiotekSynergyHT多检测酶标仪(Winooski，VT)获得OD₅₇₀-OD₆₀₀吸光度，并绘制存活力曲线。所有实验在每个实验条件下使用最少3份样本进行三次。

肝特异性功能测定：使用P450-Glo^TM筛选系统(Promega，Madison，WI)检测CYP4503A4活性。简要的说，在37℃下，培养的细胞与含有发光的CYP3A4底物(对于CYP为荧光素PPXE)的培养液孵育4小时。使用WallaceVictor2MultilabelCounter(现在是Waltham，MA的Perkins/Elmer的部分)根据厂商说明书进行荧光素检测和分析。使用人白蛋白ELISA定量试剂盒(BethylLaboratories，Montgomery，TX)进行定量白蛋白分泌。针对尿素合成分析，细胞与2mM铵孵育24小时，收集上清液并使用Quantichrom尿素测定试剂盒(BioassaySystems，Hayward，CA)测定。对来自针对每个培养条件的一个样本的上清液一式三份进行测定，并且该实验重复3次。

统计分析：针对每个条件使用一式两份或一式三份样本重复实验至少2-3次。呈现了来自代表性实验的数据，而在多次实验中观察到类似的趋势。所有误差条代表了S.E.M。

使用新的四步方案制备生物基质支架：使用包括脱脂而后高盐提取的方案并使用灌注方法(图1)制备生物基质支架。该方法中给出了方案的详细介绍。这通过新的四步方案来实现：1)温和脱脂；2)用具有约2.0M至约5.0M(例如2.0M-2.5M、2.6M-3.0M；3.1M-3.5M、3.6M-4.0M、4.1M-4.5M；4.6M-5.0M)盐浓度的缓冲液清洗，所述盐浓度已知维持胶原处于不溶状态²³(缓冲液的精确浓度和pH由组织中的胶原类型确定)，所述浓度已知维持胶原处于不溶状态²³；3)核酸酶处理以消除残留的核酸；以及4)用基础培养液冲洗以消除去污剂、盐和核酸酶残留物，以及用培养液平衡基质成分(图1A)。

针对核酸酶的冲洗培养液或缓冲液的选择可以是多种选择中的任一种，只要盐浓度和离子强度得以维持基质成分处于不溶状态。脱脂方法的选择对于有效且温和是关键的。我们选择脱氧胆酸钠(SDC)和磷酯酶A2(PLA2)的组合来将位于质膜和线粒体膜上的磷酸甘油酯快速降解为溶血卵磷脂，其是一种强力表面活性剂，其可以诱导坏死和细胞裂解。图8显示了反应式。我们避免强力去污剂，诸如十二烷基硫酸钠(SDS)或Triton-X100，其可以裂解一些基质成分，诸如葡萄糖胺聚糖(参见Gilbert等人的综述″Decellularizationoftissuesandorgans″，Biomaterials27：3675-3683(2006))。

我们避免支架在脱脂和高盐清洗期间长期暴露在来自破裂细胞的酶，因为它们可以极大的降低弹性蛋白的含量和葡萄糖胺聚糖(GAG)的含量，所述葡萄糖胺聚糖诸如硫酸肝素(HS)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)和肝素(HP)，它们是细胞因子和生长因子结合的部位²⁴。我们使用大豆胰蛋白酶抑制剂并小心控制pH(7.5-8.0)、温度(20℃)、和时间(30-60分钟)以限制源自破裂细胞的蛋白酶的活性。

我们通过相关脉管(例如，肝脏中的门静脉)灌注整个组织，这使得我们快速分离(几个小时内)生物基质支架而使基质成分的损失最小化。分离的快速是由于用去污剂的初始步骤在大约30-60分钟(而不是像其他使用的方案中的数小时或数天)内使组织脱脂。产生的生物基质支架是透明或白色的(图1)。此外，使用该灌注方法，我们维持了初始的脉管通道、门静脉和肝静脉以及肝脏中的大部分血管分支，这增加了脱细胞化效率。通过生物基质支架灌注的荧光罗丹明标记的葡聚糖颗粒保持在脉管残留物内，这表明它们是显著的(图1E)。存在染料从大血管沿通道逐渐流入细血管分支而没有泄露。该事实在支架的血管再形成中将是有帮助的，所述血管再形成作为制备工程改造的组织用于三维培养和/或用于体外植入的方法。

在切片时，支架保持了初始组织的组织学结构，包括主要组织学实体中的可识别残留物，诸如血管、胆管、以及格利森氏囊(GC)(图1)。对比图1B1和1D1，其中肝脏组织的切片与生物基质支架的切片对比。实质细胞壁的基质残留物由网格状网络组成(图1D2-1D3)。

胶原、胶原结合蛋白和结合细胞因子保持在生物基质支架中：生物基质支架中的胶原量通过前面所使用的方法通过氨基酸分析来评估²⁵。因为羟脯氨酸(Hyp)对于胶原和胶原蛋白是独特的，相对于总蛋白的胶原组成表示为每1000个氨基酸中的Hyp残留。该结果表明胶原含量从几乎不可检测的水平，即肝脏中小于0.2残留的羟脯氨酸(Hyp)/1000，增加至生物基质支架中～13残留的Hyp/1000。这表明如上所述的脱脂和高盐清洗没有去除胶原，在生物基质支架中留下几乎所有的胶原。检测到生物基质支架中显著水平的另一种胶原相关氨基酸—羟赖氨酸(Hyl)，以及更高水平的甘氨酸(Gly)支持了我们的结论，即胶原在生物基质支架中是明显富集的(图2A、9和表2)。

使用免疫组织化学和超微结构研究，我们能够在支架中鉴定肝脏中原位发现的所有已知形式的胶原，包括纤维状胶原(I、III和V型胶原，对于小纤维为10-30nm直径，对于装配纤维为500-3000nm直径)和珠状纤维(可能是VI型)。那些纤维和纤丝存在于间皮层下的包膜下结缔组织层中。尽管在沿门三联管至中央静脉的血窦中没有发现基膜的典型结构，我们发现了IV型胶原和一些结合小纤维形成网状、多孔3D网格结构，其充当用于实质细胞的支架(图2)。I型胶原束可视为支架的主要结构，其他型胶原、糖蛋白、以及蛋白聚糖附着至所述支架的主要结构。在狄氏间隙中，我们发现I型胶原的小束和III型和IV型以及一些V型胶原的纤维，所述V型胶原纤维在门三联管和中央静脉附近更丰富。代表性的免疫组织化学数据呈现于图3B中，以及基质成分和它们在正常肝脏组织中的位置与它们在生物基质支架中的位置的比较的概要列于图4D中。在针对生物基质支架制备的方案发展中的早期研究表明，大量的细胞骨架成分在清洗中丢失。但是，我们通过免疫组织化学评估支架，并且我们没有发现微管蛋白、肌间线蛋白或肌动蛋白、微量的细胞角蛋白18和19、以及低水平的波形蛋白遍布整个支架的证据。

与胆管以及部分肝血管系统(动脉和静脉血管)相关的基质由典型的基膜结构组成，所以与在血窦中发现的脉管结构相关的基质薄层相当不同。层粘连蛋白、巢蛋白/内功素、基底膜聚糖和IV型胶原发现于门三联管中，而在狄氏间隙中仅发现基底膜聚糖和一些IV型胶原。存在大量的疏水、波状弹性蛋白；它交联在一起并形成片层和纤维，其主要限定于包膜下结缔组织、门静脉区、以及动脉壁。纤连蛋白普遍存在并遍及于肝基质中，并且在狄氏间隙中是尤其丰富的，在那里它们形成细纤丝或粒状沉积(图2和3)。

免疫组织化学表明，组织中已知的蛋白聚糖保存于生物基质支架中(图3B、4D)。在鉴定的异质蛋白多糖中，沿血窦间插且并连续地发现多配体聚糖，而基底膜聚糖在狄氏间隙中更间插。发现HS-PG和CS-PG的形式遍及生物基质支架中的血窦的残留物，其模式与肝脏组织中已知成带相关。

蛋白聚糖和其他基质成分对于细胞因子和生长因子是重要储库，所述细胞因子和生长因子紧密结合至它们的GAG²⁶。大部分生长因子和激素发现于生物基质支架中，其接近初始组织中发现的浓度。在表6中，给出了来自大鼠肝脏裂解物和大鼠肝脏生物基质支架的比较的数据，以及在表3中，提供了来自人胆管组织与胆管生物基质支架的比较的平行数据。有趣的是，存在肝脏生物基质支架中相比于肝脏裂解物所发现的强烈富集的几个实例(例如，bFGF)。结合的生长因子和细胞因子在肝脏与胆管组织的支架的比较之间在定性和定量上是不同的，其暗示了组织特异性或物种特异性。可替代的，它可以，部分地，是由于胆管支架需要通过在摇杆上摇动缓冲液中的组织而不是通过穿过脉管灌注来制备的事实。

生物基质支架的化学物与组织学相关：该新方案的重要特征在于保留基质化学物，其模式与门三联管至中央静脉的肝腺泡区1-3并与组织学实体诸如血管通路和格利森氏囊(GC)相关，如图4A-C中所示。区1中的门静脉周围的基质化学物类似于胎儿肝脏中所发现的基质化学物，并且部分地由III型胶原、层粘连蛋白、以及CS-PG的形式组成。它转变为中部腺泡(区2)和中心周围区(区3)中不同的基质化学物，其终止于非常稳定的具有高水平IV型胶原和HP-PG的基质²⁷。

已知的是，多种蛋白(例如，生长因子和激素、凝固蛋白、各种酶)通过结合至GAG中离散且特定的硫酸化模式或结合至其他基质成分而结合至基质并保持稳定²⁴。因此，基质化学物从干细胞龛中的其起始点(具有与高转化和最小限度硫酸化相关的不稳定基质化学物)转换为稳定的基质化学物并具有增加量的硫酸化，并向中心周围区进行。我们期望天然结构以及与组织学结构相关的基质化学物的保持将通过将细胞引导至生物基质支架上的特定部位和/或提供合适的信号混合物来驱动扩张和/或分化为成熟细胞来促进组织工程改造过程中的再细胞化。

生物基质支架可以由不同组织和物种来制备：生物基质支架可以由任何正常或病态的组织和由任何物种来容易地制备。在图13-16中，我们显示了来自人胰腺、胆系、和十二指肠以及来自大鼠和猪胰腺的生物基质支架。在图5-7和图12中显示了牛或大鼠肝脏生物基质支架对肝细胞的影响。另外，生物基质支架由人腹主动脉、髂静脉、以及由大鼠和猪的肠来制备。对生物基质支架的组织学、超微结构和免疫组织化学研究表明了在它们的结构、化学组成、以及功能中具有明显的组织特异性，而没有物种特异性。

生物基质支架诱导和/或维持细胞的分化：将hHpSC铺板在具有肝脏生物基质支架切片的皿上以及对于成体肝脏细胞定制的HDM中，导致基本100％的活细胞在几个小时内附着在生物基质支架上；而不论是完整的还是低温粉碎后。在支架切片上初始形成的细胞集落保留了它们的一些干细胞表型，因为集落中心的细胞能够抵抗染料的染色(图11)并表达典型的肝祖细胞标记，诸如趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)(图5)。它们分裂1次或两次，并然后转换到细胞周期停滞并转换到三维(3D)索状形态，其对于成熟实质细胞培养物是典型的(图5和6针对干细胞分化；与图7和图12对比)。所使用的HDM不需要所有的常用细胞因子或生长因子，因为这些以结合至生物基质支架的形式存在。转换到生长停滞与活性染料对整个集落的染色相关(图12)，其伴随EpCAM和CXCR4表达的丢失，以及成体特异性肝细胞和胆管上皮细胞基因诸如尿素和细胞色素P4503A4的表达的稳定增加(图5)。

正常成体大鼠和成体肝细胞铺板在I型胶原上或铺板在来自大鼠或牛肝脏的生物基质支架上，并且对于成体细胞铺板于HDM中。成体实质细胞能够在10分钟内(即使在无血清培养液中)附着至支架，与之相比，在数小时内附着在I型胶原上，其从附着点开始保持在生长停滞；并在支架上保持存活和完全功能持续超过8周，与之相比，在I型胶原上保持约～2周(图7和12)。在生物基质支架上成熟肝脏细胞持续数周的功能水平证实与在其他新鲜分离的成体肝细胞的发现相同或类似²⁸。引入注目的区别是I型胶原上的培养物在2周后迅速恶化，而在生物基质支架上的培养物在形态和功能上保持稳定，持续维持培养物的时间(到目前为止～8周)。

生物基质支架包含了大部分组织的细胞外基质成分和基质结合细胞因子及生长因子，其提供一组复合的化学信号，其可以用于不溶的、稳定的支架，其具有特别的能力以诱导hHpSC为成体肝脏命运，以及维持成体细胞完全分化持续数周。对比研究人员制备的基质提取物的现有类型与本发明的生物基质支架的类型，明显的是，物理处理、酶处理和化学处理对组成、机械行为、以及对源自天然组织和器官脱细胞化的生物支架的宿主反应有实质性的影响，并且相应地，对于它们的体外和体内应用具有重要启示。所有其他现有的用于制备基质或支架的方法通过使用基质降解酶¹⁶或使用溶解大部分基质的缓冲液¹¹而导致大部分基质成分的去除。物理方法(例如，速冻和搅拌)可以作用以从具有分层结构的组织诸如真皮(例如，SIS、BSM)²⁹制备基质提取物，，但不能用于具有复杂组织结构的器官，诸如肝脏。通过对比，我们用于生物基质支架的方法导致大部分细胞蛋白的损失，但保存了基本全部或至少大部分胶原和胶原结合成分，包括基质结合细胞因子、激素和生长因子。

细胞外基质嵌入嵌合体脂质双分子层中，甚至在最简单生物体中，其是复杂的、异质且动态的环境。脱脂方法是方案的关键方面。对于组织脱细胞化通常使用的方法包括离子型去污剂，诸如SDC和十二烷基硫酸钠(SDS)。SDC比SDC相对更温和，倾向于引起对天然组织结构的更少的破坏，并且在溶解细胞质膜和核细胞膜上效率更低³⁰。没有单独使用SDC进行组织脱细胞化的报告。许多研究使用强力非离子型去污剂(例如，TritonX-100)³¹或两性离子去污剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基)]-1-丙磺酸盐，CHAPS)³²。通过对比，我们使用SDC和PLA2组合的方法对组织快速且温和地脱脂。

目前为止已经在脊椎动物中鉴定了至少29种类型胶原(I-XXIX)，所述胶原在细胞粘附、分化、生长、组织发育和结构完整性中具有功能作用^33、34。基质中的主要结构成分，胶原，已知在高盐浓度和中性pH中保持不溶^35、36，这一发现是我们制备生物基质支架策略的基础。该策略具有额外的优势，即胶原实现结合于它们的基质成分诸如层粘连蛋白和纤连蛋白(FN)、富含小亮氨酸的蛋白聚糖(PG)和GAG的保存，所述基质成分进而保存结合于它们的细胞因子、生长因子或细胞表面受体。

生物基质支架在它们诱导干细胞/祖细胞诸如hHpSC快速和稳定分化为成体命运以及保持它们的谱系限制细胞以及保持它们的谱系限制细胞或也保持铺板在支架上的成体细胞作为存活且完全功能细胞持续许多周(＞8周)的意义深远的能力上是独特的。

干细胞诸如胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞或各种形式的间充质干细胞(MSC)分化为完全成熟肝脏细胞类型需要存在于各阶段的多组信号(可溶的和基质)，其具有引发对不同组的应答所需的一组的诱导，并且可以需要数周、最长达6周的培养，以产生具有成体肝脏命运的细胞³⁷。此外，将MSC谱系限制为肝脏命运产生了与具有混合的肝细胞和MSC表型的成体细胞不一致的结果。ES细胞、iPS细胞和MSC的分化导致了肝细胞样细胞，其表达一些、但不是全部的主要肝脏特异性基因；具有其中观察到基因的变化；并且对于表达的那些肝基因的蛋白水平对于一种肝基因通常较低⁴⁰或者较高而对于其他则可以忽略^41、42。通过对比，生物基质支架上hHpSC的分化导致基本所有细胞表达典型的成体表型，以及其中尿素、白蛋白和CYP450活性在培养一周后处于接近正常的水平。

来自任何这些前体细胞并且通过处生物基质支架以外的方案分化的肝细胞样细胞表达了一些但不是全部的主要肝脏特异性基因，具有其中观察到基因的变化；并且对于肝基因的蛋白水平对于一种肝基因通常较低或较高，而对于其他肝基因则可以忽略。出于未知原因，该结果在制备与制备之间是不同的。期望的是，利用本发明的生物基质支架应该导致这些干细胞群体的更加快速分化，其在实现具有稳定的成体表型的细胞中具有更大的一致性。

决定干细胞群体诸如hHpSC在生物基质支架上的分化导致基本所有细胞表达基因的典型成体所有组成成分，以及其中尿素、白蛋白和CYP450活性在培养1-2周内处于接近正常的水平，并且其中该表型的稳定性持续数周。因此，本发明的生物基质支架具有极大促进决定干细胞群体分化为成体肝脏表型的潜能。

在生物基质支架上分化干细胞以实现成熟和功能细胞和组织的能力为学术、工业和临床项目提供了相当多的机会，其使得良好分化的细胞类型用于每种类型的分析研究，以及最令人激动的是，其使得产生可用于基础研究和临床项目的可植入的、再血管化的组织或甚至器官。

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实例2：用于工业规模分散生物基质支架的方法

用于将粉碎后的生物基质支架分散至皿上的其他方法在GigaCyte，LLC(Branford，CT)开发。它们可以与来自任何组织包括大型哺乳动物(例如，人、猪和牛组织，等)的生物基质一起支架使用。猪和牛组织从USDA认证的肉加工厂获得，在RPMI1640中运输。该培养液可以是具有模拟组织液成分的组成并具有250-350mOsm/Kg范围的重量摩尔渗透压浓度的任何培养液。然后如本文所述处理所述组织以生成生物基质支架。

这些方法包括进一步处理生物基质支架，用于降低至悬浮液中的μm大小颗粒，用于通过使用自动化设备包被板。在一个非限制性实例中，该过程包括在高盐溶液中将生物基质支架均质化以确保胶原保持不溶。以1∶1缓冲液：匀浆比例加入由36单位/L磷脂酶A2加上1％脱氧胆酸钠和0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂组成的改良脱脂缓冲液，这导致生物基质材料的浮力上升至顶部，其在顶部被收集用于进一步处理。进一步处理生物基质材料以去除脱脂缓冲液，并以核酸酶溶液清洗以去除核酸酶：5mg/100mlRNase、1mg/100mlDNase和0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂。然后在高盐(＞3.4MNaCl)缓冲液中进一步处理生物基质材料以确保去除所有残留物，从而保持胶原不溶以及还使蛋白酶活性最小化。通过在包含抗菌剂/抗霉菌剂、庆大霉素和HEPES缓冲液的基础培养液清洗生物基质材料，进一步处理生物基质材料以去除高浓度的盐，从而制备用于颗粒大小降低。然后进一步处理生物基质材料以便将生物基质材料的颗粒大小降低至μm大小颗粒(1-100μm范围)，其以任何稀释度(在1∶6最佳)悬浮在包含抗菌剂/抗霉菌剂、庆大霉素和HEPES缓冲液的基础培养液中，在-80℃冷冻，并然后通过低温研磨来粉碎。如果生物基质在研磨前没有稀释，则基质对于均匀包被皿而言太易结块。这对于研磨和均匀包被板是关键步骤。生物基质颗粒可以以任何稀释浓度但最佳1∶6悬浮。将生物基质颗粒解冻且包被至用于干细胞分化的板上。也可以在包含抗菌剂/抗霉菌剂、庆大霉素和HEPES缓冲液的基础培养液中将生物基质颗粒进一步稀释至任何稀释度，最佳为1∶24，并包被至板上，所述板用于长期维持原代新鲜分离的、冷冻保存的、或源自干细胞的终末分化的细胞类型或用于将任何干细胞来源分化为肝细胞。生物基质包被的板的消毒可以例如用伽马辐射(5000rad)来进行，并且在4℃保存(或在-80℃冷冻)直至使用。将细胞铺板至生物基质上不需要用于附着的含有血清的培养液，但是含有血清的培养液可以用于将细胞施加至生物基质。来自任何组织的生物基质颗粒的组合物可以用于包被板和其他装置。

作为另一个实例，本发明提供了由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上，其包括：a)如本文所述根据本发明的任一种方法产生生物基质支架；b)在基础培养液中稀释(a)的生物基质支架；c)在约-80℃冷冻(b)的生物基质支架；d)通过低温研磨将(c)的生物基质支架粉碎为约1μm至约100μm大小范围(例如，约1μm、2μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、150μm、200μm等)的生物基质颗粒；e)在基础培养液中悬浮解冻(d)的生物基质支架；以及f)将步骤(e)的生物基质颗粒分散至培养装置上。进而从生物组织产生生物基质支架，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括消毒生物基质颗粒的步骤，其可以例如通过伽马辐射来进行。

本文所述方法的一些实施方案中，可以在基础培养液中以约1∶6比例(例如，1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9等)稀释步骤(b)的生物基质支架。在一些实施方案中，可以在基础培养液中以约1∶24(例如，1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶26、1∶27、1∶28、1∶29、1∶30等)稀释步骤(e)的生物基质颗粒。

用于成体肝脏的示例性方案的概要

1000x大豆胰蛋白酶抑制剂

·最终浓度0.1mg/ml

组织运输溶液

·基础培养液，诸如RPMI1640或具有钙和镁的磷酸盐缓冲盐水

·抗生素/抗霉菌剂100x溶液(Gibco#15240-112)

·庆大霉素(25μg/ml)(Gibco#15710-072)

溶液1：组织混合溶液

·3.4MNaCl

·0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Gibco#17075-029)

溶液2：脱脂溶液

·溶液1与1∶1PBS((w/Ca&Mg)的混合物；可替代比例是1∶2、1∶3、1∶4)或可替代地基础培养液，诸如RPMI1640；

·0.1％脱氧胆酸钠(SigmaD6750-100g)

·36u/L磷酸酶A2(SigmaP9279-25mg)

·0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Gibco#17075-029)

溶液3：核酸酶溶液

·基础培养液，诸如RPMI1640；

·5mg/100mlRNase(SigmaR6513-1g)

·1mg/100mlDNase(DN25-1g)

·0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂

溶液4：高盐溶液

·3MNaCl

溶液5：盐去除&研磨溶液

·William′sE

·抗生素/抗霉菌剂(100x)

·庆大霉素(30ug/ml)

用于大器官的生物基质分离过程中的步骤

1、高盐中的组织均质化

2、脱细胞化和脱脂

3、核酸酶去除

4、高盐清洗

5、盐去除

6、生物基质颗粒大小降低

7、以生物基质包被板

生物基质分离处理

1.0组织获得

1.1从USDA认证和检查的工厂获得器官组织

1.2在塑料容器中的组织运输溶液中将器官组织从USDA工厂运输至GigaCyte实验室

1.3制备组织用于灌注或均质化

1.3.1对于在多孔板中的体外应用优选均质化

2.0组织均质化

2.1使用手术刀片No.22将组织无菌切割为小片(～3x3cm)，并置于组织运输溶液中以去除血液

2.2在组织运输溶液中冲洗组织片3-4次以去除尽可能多的血液

2.3将～400克组织在等量的溶液1中均质化，直至混合物均匀(～3-5分钟)

2.4将均质化组织溶液倒入2L滚瓶中用于脱细胞化

2.5对于整批组织片重复

3.0脱细胞化和脱脂

3.1将等量溶液2添加至滚瓶中的均质化组织

3.2通过颠倒瓶子数次而混合均匀并放置15-30分钟

3.3有浮力的基质材料将上升至顶部，其产生在肝脏着色溶液顶部的轻基质材料的明显分离

3.4用移液器移取有浮力的基质材料并转移至另一个滚瓶

3.5合并来自多次均质化的基质

3.6将～375ml基质材料转移至750ml离心瓶中，将等量的溶液2添加至每个瓶中，并剧烈摇动～1分钟以确保完全脱细胞化和脱脂

3.7通过高速(3750RPM)离心10分钟而沉淀，然后去除上清液

3.8再1次重复该过程。(总共2次)

4.0核酸酶去除

4.1在最终脱细胞化清洗后去除上清液，小心不要搅动生物基质沉淀

4.2将等量的溶液3添加至每个瓶子，并剧烈摇动～1分钟以确保所有材料悬浮以及核酸酶完全去除

4.3通过高速(3750RPM)离心10分钟而沉淀，然后去除上清液

4.4再1次重复该过程。(总共2次)

5.0高盐清洗

5.1在最终核酸酶清洗后去除上清液，小心不要搅动生物基质沉淀

5.2将等量的溶液4添加至每个瓶子，并剧烈摇动以确保所有材料悬浮

5.3通过高速(3750RPM)离心10分钟而沉淀，然后去除上清液

5.3.1在该阶段生物基质在离心后没有良好沉淀，并且是有浮力的

5.3.2用移液器移取上清液并迁移通过尼龙滤器来收集有浮力的材料

5.3.3将收集的有浮力的基质返回至离心瓶中

5.4重复该过程至少2次，然后停止

5.4.1上清液在最后盐清洗后为淡褐色

5.5如果当天较晚，第二次高盐清洗是好的停止点

5.6将所有离心瓶的内容物倒入一个滚瓶中，并以溶液4结束，然后将生物

基质置于4℃过夜

5.7第二天继续保持盐清洗

5.8剧烈摇动生物基质瓶以均匀混合生物基质材料，然后将生物基质转移至离心瓶，并再继续3-4次盐清洗

5.9将生物基质浓缩至尽可能少的瓶子中，每个填充至最大量的半满以允许盐清洗

6.0盐去除

6.1在最终盐清洗后去除上清液，小心不要搅动生物基质沉淀

6.2添加等量的溶液5，并剧烈摇动以确保生物基质材料悬浮

6.3通过高速(3750RPM)离心10分钟而沉淀

6.4去除上清液，并添加等量溶液5，然后剧烈摇动

6.5重复2次(总共3次)以确保上清液澄清

6.5.1生物基质通过每次旋转将更紧密沉淀

6.5.2在最终清洗后，上清液应该澄清且没有任何颜色

6.6在最终溶液5清洗后，记录来自每个瓶的基质沉淀的体积

6.7将所有生物基质沉淀转移并合并到新的滚瓶中

6.8测量生物基质材料的体积

6.9用溶液5以1∶6稀释合并的生物基质

6.9.1计算所需的溶液5的量

6.9.1.1实例：200ml生物基质x6＝1200

6.9.1.2将1L溶液5添加至200ml生物基质以获得1∶6的生物基质悬浮液

6.10将30ml生物基质1∶6悬浮液等分至预标签的冷冻袋中

6.11-80℃冷冻生物基质的袋，并保存，直至研磨

6.12对于新的生物基质批次，制备“生物基质批次研磨数据表”

6.12.1记录由该新批次产生的袋的数量

6.12.2每个袋是来自相同批次的分开的研磨物

6.13由该批次产生的生物基质材料被认为是一个批次

6.14将批号分配至批次

7.0生物基质颗粒大小降低

7.1准备具有LN2的研磨机(Spex样品Prep6870)并冷却研磨腔

7.2从冷冻机中移出冷冻的生物基质袋

7.3破裂为小片

7.4将冷冻的生物基质片转移至预冷的研磨机腔内

7.5在低温研磨机中研磨两轮(一轮是12x2分钟研磨，每次随后是2分钟冷却降温)，每轮48分钟

7.6将研磨的生物基质转移至100ml瓶中，所述瓶以批号和袋号(袋号标识研磨日期)预标签

7.7保持在-80℃冷冻，直至准备用于包被板

8.0制备用于包被板的生物基质

8.1在37℃水浴中以快速解冻法解冻一瓶生物基质

8.2测量解冻的生物基质悬浮液(应该是～30ml±2ml)

8.3以溶液5稀释至1∶24(参见图17)

8.3.1计算添加至1∶6生物基质悬浮液的溶液5的体积

8.3.1.1将生物基质悬浮液体积x3

8.3.1.2将该体积添加至1∶6悬浮液用于1∶24稀释

8.4立即包被板(放置稀释的生物基质将导致结块)

9.0以生物基质包被板

9.1确定待包被的板的数量。对于铺板体积参照表8

·从包装中无菌取出板并在层流净化罩内组织

·使用合适的多通道吸移器将合适量的生物基质悬浮液转移至每个孔中。对于铺板体积参照表1

·保证悬浮液在孔间均匀分散—必要时轻拍板但不要从罩的平面移出。

·使板过夜保持不被干扰

·第二天的第一件事是从每个孔去除溶液

○小心处理板使得基质包被层不被干扰

○朝操作者倾斜板，而不使板边缘从罩平面移出。这稳定了板以防止急剧运动，所述急剧运动将使得生物基质离开板

○使用具有精细尖端移液器的抽吸装置从每个孔中吸出全部溶液。不要使移液器触与基质表面接触！！！

○将板轻轻放下，去除盖子并使得完全干燥(～2小时)

■移动板同时湿搅动生物基质包被层

■直到基质干燥才移动板

○在完全干燥时更换盖并检查质量

○将具有平滑包被层的板置于板袋中

○密封袋并施加标签

○通过伽马辐射(5,000rad)消毒

○在4℃保存包被板

○以每个冰袋上以5个的包装运输包被板

10.0使用生物基质板

10.1从包装中无菌取出板并置于生物安全工作柜中

10.2在使用前将培养液添加至每个孔并置于培养器中至少2小时

10.3在准备将细胞铺板时，去除再水化培养液并以组织培养的培养液清洗一次

10.4添加细胞

前述是说明本发明，并不应当解释为对本发明的限制。本发明由下面权利要求书限制，其中权利要求书的等价物包括在本文中。所有的公开、专利申请、专利、专利公开、由GenBank数据库鉴定的序列和/或SNP登录号、以及本文中引用的其他参考文献关于与其中提出参考文献的语句和/或段落相关的教导完整地通过引入并入。

表1：对于I-V型胶原的NaCl摩尔浓度范围

这些数据代表用于胶原类型的不溶性的条件。本领域技术人员必须鉴定组织中的胶原类型，并且然后使用对于组织中那些胶原所鉴定的最高盐浓度，以及作为用于制备生物基质支架的缓冲液的最高盐浓度。例如，对于皮肤，本领域技术人员将使用中性pH以及具有4.0M的盐浓度的缓冲液，该盐浓度将保持I型和III型胶原不溶。相比之下，对于胎盘，本领域技术人员将使用中性pH以及具有4.5M的盐浓度的缓冲液以保持IV型和V型胶原不溶。

组织中存在的胶原类型在宿主的不同年龄时是不同的。例如，胎儿肝脏具有高水平的III、IV和V型胶原(需要高于4.0M的盐浓度)，而成体肝脏具有I、III、IV、V、VI和XVIII型胶原的混合物(需要更低的盐浓度)。因此，生物基质支架制备所需的盐浓度是由组织中主要的胶原的所有组成成分所确定。对于进一步的细节，参见实例1的参考文献23。

表3：结合至胆管生物基质支架的生长因子分析

表4：所利用的抗体

表6：结合至肝脏生物基质支架的生长因子分析

表8：用于多孔板的生物基质铺板体积

板大小	体积/孔	体积/板	板/瓶
				384-孔	30μl	12.0ml	10
96-孔	50μl	5.0ml	24
				24-孔	300μl	7.5ml	16
12-孔	800μl	10ml	12
				6-孔	1.5ml	9ml	13

Claims

1.由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上，其包括：

a)以包含3.5MNaCl至4.5MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注所述生物组织或使所述生物组织均质化；然后

b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是250mOsm/kg至350mOsm/kg，并且所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后

c)用处于中性pH且包含2.0MNaCl至5.0MNaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持所述生物组织中鉴定的胶原不溶；然后

d)在缓冲液中用RNase和DNase灌注步骤(c)的组织或提取步骤(c)的匀浆；以及然后

e)用处于中性pH、无血清、且具有250mOsm/kg至350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的第二培养液冲洗步骤(d)的组织或匀浆，

进而从所述生物组织产生完整的或均质化的生物基质支架，所述生物基质支架包含所述生物组织的至少95％的胶原和大部分胶原结合基质成分以及基质结合生长因子、激素和细胞因子；

f)在基础培养液中稀释所述生物基质支架；

g)在-80℃冷冻(f)的生物基质支架；

h)通过低温研磨将(g)的生物基质支架粉碎为1μm至100μm大小范围的生物基质颗粒；

i)在基础培养液中悬浮解冻(h)的生物基质颗粒；以及

j)将步骤(i)的生物基质颗粒分散至培养装置上，进而从生物组织产生生物基质支架，所述生物基质支架用于工业规模分散至培养装置上。

2.权利要求1的方法，还包括对所述生物基质支架消毒的步骤。

3.权利要求2的方法，其中所述消毒步骤通过伽马辐射来进行。

4.权利要求1的方法，其中(f)的生物基质支架以约1∶6比例稀释于所述基础培养液中。

5.权利要求1的方法，其中(i)的生物基质颗粒以约1∶24比例稀释于所述基础培养液中。

6.权利要求1的方法，其中所述第一培养液包含盐、矿物质、氨基酸、维生素和糖。

7.权利要求1的方法，其中所述第一培养液是基础培养液。

8.权利要求7的方法，其中所述基础培养液选自由RPMI1640、DME/F12、DME、F12、Waymouth培养液以及William培养液组成的群组。

9.权利要求1的方法，其中所述第二培养液包含组织液中所存在组分的至少一种。

10.权利要求1的方法，其中步骤(b)的所述脱脂缓冲液包含第一培养液中20单位/L至50单位/L的磷脂酶A2和约1％的脱氧胆酸钠。

11.权利要求1的方法，其中步骤(c)的所述缓冲液的盐浓度在用于从成体肝脏制备支架时为3.4MNaCl至3.5MNaCl，以及在用于从胎儿肝脏制备支架时为4.0MNaCl至4.5MNaCl。

12.权利要求1的方法，其中步骤(c)的所述缓冲液还包含蛋白酶抑制剂。

13.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂。

14.权利要求1的方法，其中步骤(d)的所述缓冲液还包含蛋白酶抑制剂。

15.权利要求13的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂。

16.权利要求1的方法，其中步骤(a)至(e)的所有培养液和缓冲液中没有可检测量的使细胞外基质成分降解的酶。

17.权利要求1的方法，其中所述生物组织选自由肝脏组织、肺脏组织、胰脏组织、甲状腺组织、肠组织、皮肤组织、血管组织、膀胱组织、心脏组织和肾脏组织组成的群组。

18.权利要求1的方法，其中所述生物组织来自哺乳动物。

19.通过权利要求1-18中任一项的方法产生的生物基质支架。