ES2946590T3 - Andamios de biomatriz para dispersión a escala industrial - Google Patents

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Richard Harold Malavarca
Yunfang Wang
Lola Cynthia Mcadams Reid
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Abstract

La presente invención proporciona andamios de biomatriz para la dispersión a escala industrial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Andamios de biomatriz para dispersión a escala industrial
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos para producir andamios de biomatriz.
Antecedentes de la invención
La capacidad de usar células diferenciadas ex vivo o en programas clínicos tales como terapias celulares depende de la capacidad de mantener las células con un fenotipo adulto y completamente funcionales o de poder restringir el linaje de células madre o progenitores ("células madre/progenitores") para lograr ese fenotipo adulto. La revolución en curso en la investigación de células madre ha hecho posible la identificación y el aislamiento de poblaciones de células madre/progenitores, que incluye las de tejidos embrionarios, fetales y posnatales1. La capacidad de identificar y aislar las células madre/progenitores para todos los tipos de células adultas y expandirlas y diferenciarlas aumenta en gran medida el potencial para usarlas en programas de investigación farmacéutica y otros programas industriales, investigaciones académicas y programas clínicos tales como terapias basadas en células, e ingeniería tisular2
Los métodos actuales para mantener células diferenciadas o de linaje tras restringir las células madre a un destino adulto ex-vivo son parcialmente exitosos e implican sembrar las células o embeberlas en un sustrato de uno o varios componentes de la matriz extracelular y en un medio que comprende hormonas específicas, factores de crecimiento y nutrientes adaptados al fenotipo adulto deseado. Para las células madre muy primitivas, tales como las células madre embrionarias (ES) o las células madre pluripotentes inducidas (iPS) o las derivadas de manera postnatal, que pueden seguir múltiples destinos adultos, tales como células madre mesenquimales (MSC) o células madre derivadas de líquido amniótico (AFSC), las células madre se someten a una mezcla de señales solubles y/ componentes de la matriz extracelular y deben tratarse con múltiples conjuntos de estas señales durante semanas. Típicamente, el fenotipo adulto que se logra es distinto con cada preparación y tiene una expresión excesiva o insuficiente de ciertos genes específicos de adultos y/o una regulación anómala de uno o más de los genes específicos de tejidos de adultos.
La matriz extracelular es secretada por las células, está adyacente a ellas en una o más de sus superficies y durante mucho tiempo se ha entendido que es el soporte estructural de las células7. Es un andamio extraordinariamente complejo compuesto por una variedad de moléculas biológicamente activas que están altamente reguladas y son críticas para determinar la morfología, el crecimiento y la diferenciación de las células unidas8. La expresión génica específica de tejido en células cultivadas se mejora tras cultivar las células en extractos de matriz o componentes de matriz purificados9. Sin embargo, los componentes individuales de la matriz, solos o en combinación, son incapaces de recapitular la química y la arquitectura complejas de una matriz del tejido. Esto se relaciona con el hecho de que los componentes de la matriz se encuentran en gradientes asociados con zonas tisulares naturales y con estructuras histológicas tales como vasos sanguíneos. Esta complejidad de la matriz tisular se logra más fácilmente mediante extracciones que descelularizan un tejido y dejan la matriz como residuo1011. Sin embargo, los protocolos de descelularización actuales dan como resultado pérdidas importantes de algunos de los componentes de la matriz debido al uso de enzimas que degradan la matriz o tampones que solubilizan los componentes de la matriz.
Se conoce de la técnica anterior (Ross y otros, J.AM. Soc. Nephrol 2009, 20, 11, 2338-2347 y Shupe, Organogenesis, 2010, 6, 2, 134-136) el uso de tratamientos con SDS y Triton o SDS solo (WO2010/039823). Sin embargo, estos detergentes duros pueden dañar la matriz extracelular.
La presente invención proporciona métodos para fabricar andamios de biomatriz. Los métodos de esta invención dan como resultado la producción de un extracto de especificidad tisular, enriquecido mayoritariamente de los colágenos del tejido y con componentes de unión a la matriz y hormonas, factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz que en conjunto producen efectos de diferenciación más reproducibles y potentes tanto en células maduras como en la restricción del linaje de poblaciones de células madre/progenitoras.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico seleccionado del grupo que consiste en pulmón, tiroides, piel, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón o intestinos para su dispersión (por ejemplo, dispersión a escala industrial mediante el empleo de volúmenes como se describe, por ejemplo en los protocolos establecidos en el Ejemplo 2) en aparatos de cultivo, que comprende: a) perfundir el tejido biológico u homogeneizar el tejido biológico con un tampón que comprende una concentración de sal de aproximadamente NaCl 3,5 M a aproximadamente NaCl 4,5 M; b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón de deslipidación que comprende fosfolipasa A2 y desoxicolato de sodio en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y a pH neutro; después
c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a pH neutro y que comprende una concentración de sal de aproximadamente NaCl 2,0 M a aproximadamente NaCl 5,0 M, concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después
d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con ARNasa y ADNasa en un tampón; y después e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que tiene un pH neutro, no contiene suero y tiene una osomolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de esta manera se produce un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos el 95 % de los colágenos y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico;
f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal;
g) congelar el andamio de biomatriz de (f) a aproximadamente -80 °C;
h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituración criogénica en partículas de biomatriz que varían en tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 100 μm;
i) descongelar las partículas de biomatriz de (h) en suspensión en medio basal; y
j) dispersar las partículas de biomatriz de la etapa (i) en un aparato de cultivo,
de esta manera se produce un andamio de biomatriz de tejido biológico para la dispersión a escala industrial en aparatos de cultivo.
En algunas modalidades, el método comprende además la etapa de esterilizar el andamio de biomatriz.
En algunas modalidades, la esterilización de la etapa se lleva a cabo mediante radiación gamma.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz de (f) se diluye en una relación de aproximadamente 1:6 en el medio basal.
En algunas modalidades, las partículas de biomatriz de (i) se diluyen en una relación de aproximadamente 1:24 en el medio basal.
En algunas modalidades, el primer medio comprende sales, minerales, aminoácidos, vitaminas y azúcares.
En algunas modalidades, el primer medio es un medio basal
En algunas modalidades, el medio basal se selecciona del grupo que consiste en RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, medio de Waymouth y de William.
En algunas modalidades, el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el líquido intersticial.
En algunas modalidades, el tampón de deslipidación de la etapa (b) comprende de aproximadamente 20 unidades/l a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y aproximadamente 1 % de desoxicolato de sodio en el primer medio.
En algunas modalidades, la concentración de sal del tampón de la etapa (c) es de aproximadamente NaCl 3,4 M a aproximadamente NaCl 3,5 M cuando se usa para la preparación de andamios a partir de un hígado adulto y es de aproximadamente NaCl 4,0 M a aproximadamente NaCl 4,5 M cuando se usa para la preparación de andamios a partir de un hígado fetal.
En algunas modalidades, el tampón de la etapa (c) comprende además un inhibidor de proteasa.
En algunas modalidades, el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
En algunas modalidades, el tampón de la etapa (d) comprende además un inhibidor de proteasa.
En algunas modalidades, el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
En algunas modalidades, todos los medios y tampones de las etapas (a) a la (e) no contienen una cantidad detectable de una enzima que degrada los componentes de la matriz extracelular.
El andamio de biomatriz producido por los métodos de esta invención también se describen pero no se reivindican. Los aspectos anteriores y otros de la presente invención se describirán ahora con más detalle con respecto a otras modalidades descritas en la presente descripción. Se apreciará que la invención puede realizarse en formas diferentes y por lo tanto no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente descripción. Estas modalidades más bien se proporcionan para que la descripción sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.
Breve descripción de los dibujos
La invención se define en las reivindicaciones. Cualquiera de las siguientes figuras que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.
Las Figuras 1A-E1. Preparación de andamios de biomatriz de hígado de rata. (A) Proceso de descelularización de cuatro etapas que comprende lavado de perfusión, deslipidación con PLA2 y SDC, lavados con alto contenido de sal y tratamiento con nucleasas para la eliminación de ácidos nucleicos. (B-D) Cuatro etapas en la preparación del andamio de biomatriz de rata. (B) Después de perfusión, lavar con medio basal durante 10 minutos, el hígado se vuelve pálido; (C) durante la deslipidación, el hígado se vuelve parcialmente transparente bajo GC (D) el andamio final intacto se ve transparente a los 40 minutos de perfusión; (E) andamio de biomatriz mostrado a bajo aumento. (E1) La visualización del andamio perfundido con partículas de dextrano marcadas con rodamina demuestra un flujo progresivo desde los vasos grandes hasta las ramas finas de los vasos sanguíneos a lo largo de los canales sin fugas, lo que indica vasculatura permeable en los andamios. La tinción correspondiente con hematoxilina y eosina (H y E) del andamio de biomatriz en diferentes etapas demostró que las estructuras histológicas tales como los vasos sanguíneos y la matriz tipo encaje que envuelve el parénquima se conservan, mientras que las células se eliminan. La estructura normal de la tríada portal hepática de rata consiste en la vena porta (PV), la arteria hepática (HA) y el conducto biliar (BD) (B1); las fibras de la matriz se hacen evidentes a medida que las células se eliminan gradualmente durante el proceso de descelularización (C1); región de la tríada portal descelularizada, comparar (B1) con la de (D1); D2 y D3 muestran que todas las células se eliminan del andamio de la matriz, pero se conservan las estructuras de malla, como los vasos sanguíneos, GC y la matriz similar a un cordón que rodea la muralia de las células parenquimatosas.
Las Figuras 2A-H. Imágenes de TEM (A-C) y SEM (D-H) de andamios de biomatriz de hígado de rata. (A) Bajo aumento de vaso sanguíneo (BV) con una pared gruesa (W). El colágeno tipo I (punta de flecha grande) es numeroso y contiene secciones transversales de fibras individuales que no absorben las manchas de metales pesados (puntos blancos, puntas de flecha pequeñas). (B) A mayor aumento de la pared de un vaso, se muestra la membrana basal (flecha grande), elastina amorfa (*) y fibras elásticas asociadas, un remanente de vesícula de membrana poco frecuente (punta de flecha pequeña), una fibra con bandas de colágeno tipo I (punta de flecha) y fibrillas pequeñas (pequeñas flechas). Las pequeñas fibrillas son probablemente fibrilina (colágeno tipo VI) que se asocia estrechamente con el colágeno tipo I y ayuda a organizarlo. (C) Gran aumento de colágeno tipo I con patrón de bandas de 64 nm (flechas). (D) Bajo aumento de un vaso con pared delgada (BV) y la pared de un vaso más grande (W). (E) A mayor aumento, la pared del vaso grande (W) está festoneada, en consistencia con la arteria hepática de una tríada portal, véase (A). Debajo de la pared hay numerosos haces de colágeno tipo I (flecha grande) unidos por fibrillas de colágeno (tipo III) (flechas pequeñas) reticulares, delgadas, ramificadas y largas. (F) Un haz grande de colágeno tipo I tiene fibras paralelas características (flecha grande) asociadas con una variedad de fibras más pequeñas (flecha) y fibras nodulares o en forma de cuentas (punta de flecha). (G) Malla 3D de fibras grandes/pequeñas interconectadas en un plano que forma un límite tal como un sinusoide hepático. (H). Mayor aumento de la malla que muestra una variedad de fibras (flechas): Colágeno tipo III (mayor diámetro recto), fibras elásticas o colágeno tipo VI.
Las Figuras 3A-B. Análisis químico de colágenos y expresión de componentes de matriz extracelular (ECM) en andamios de biomatriz. (A) El contenido de tres aminoácidos, todos encontrados en los colágenos: hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl) y glicina (Gly). Los números representan los residuos de cada aminoácido/1000 aminoácidos. Los datos indican el aumento dramático en el contenido de colágeno en el proceso de descelularización que va de <0,2 % en el hígado a más del 15 % en los andamios de biomatriz. (B) Tinción inmunohistoquímica de moléculas de matriz en andamios de biomatriz, muestra la distribución en andamios de biomatriz de hígado de laminina (LAM), sulfato de heparán (HS), colágeno tipo III (COL3) y fibronectina (FN) y proteínas típicas de la membrana basal asociados con restos de vasos sanguíneos. A mayor aumento, pueden observarse los miembros principales de la membrana basal, que incluyen colágeno tipo IV (COL4), entactina (Ent, denominada además nidógeno), laminina (LAM) y perlecán (Per), una forma de HS-PG en la porción de los andamios cercana a las tríadas portales.
Las Figuras 4A-D. Patrón de los componentes de ECM desde la tríada portal hasta la vena central en andamios de biomatriz. Comparación histológica desde la tríada portal (zona 1) hasta la vena central (zona 3) del hígado normal (A) y el andamio de biomatriz de hígado (B); ambos son secciones teñidas con hematoxilina/eosina. (C) El modelo que ilustra una célula madre y un sistema de linaje de maduración en el hígado con componentes de matriz representativos que forman patrones asociados con la zonificación del hígado. Los componentes se enumeran en orden de abundancia a partir de los hallazgos de inmunohistoquímica. Las etapas de linaje conocidas dentro de los hígados humanos comienzan periportalmente en la zona 1 (alrededor de las tríadas portales) y progresan en la maduración para terminar con células apoptóticas en la zona 3. La química de matriz conocida identificada en el nicho de células madre del hígado comprende hialuronanos, colágeno tipo III, una forma de laminina que se une a la integrina a6p4 y una forma de CS-PG sulfatada débilmente4344. Justo fuera del nicho de células madre se encuentra el colágeno tipo IV, normalmente con CS-PG sulfatados y HS-PG y formas de laminina que se unen a la integrina ap1. Se ha documentado que los HP-PG se ubican únicamente pericentralmente4546. (D) El estudio de los componentes de la matriz y su ubicación en el hígado frente a los de los andamios de biomatriz, datos resumidos de los hallazgos de inmunohistoquímica (N/D = no probado. *Encontrado por otros exclusivamente cerca de las venas centrales). La mayoría de los componentes del citoesqueleto se pierden durante los lavados, quedan presentes residuos de algunas, pero no de todas, las proteínas citoesqueléticas. Los andamios no tienen cantidades detectables de tubulina, desmina y actina (ensayos de faloidina). Sin embargo, existen cantidades trazas de citoqueratinas diseminadas al azar en los andamios; cantidades traza de a-actina del músculo liso alrededor de restos de vasos sanguíneos en las tríadas portales; y niveles bajos de vimentina en todas partes.
Las Figuras 5E-I. Caracterización de hHpSC sobre andamios de biomatriz de hígado frente a colágeno tipo 1. Las imágenes de contraste de fase (A-D) muestran los cambios morfológicos de las colonias de hHpSC derivadas del mismo hígado y cultivadas en medio de Kubota que no contiene suero y en plástico de cultivo de tejidos (A), una de las condiciones para la autorreplicación, frente a las condiciones de diferenciación del medio de diferenciación que no contiene suero para hígado, y en colágeno tipo I (B) frente a andamios de biomatriz de hígado bovino (C-E). Los cultivos funcionales y completamente viables no duraron más de ~ 2 semanas en colágenos tipo I. Por el contrario, aquellas en andamios de biomatriz de hígado estaban viables y sanas y con un repertorio completo de funciones que duraron al menos un mes. Los cultivos hicieron la transición a células entre los días 7-12 con una relación citoplasmática/nuclear aumentada y una expresión marcada de glucógeno (C) y después a unos con morfología clásica de hepatocitos poligonales intercalados por canalículos biliares claros (D) , una morfología de cultivo que persistió después de esto, como se indica en el cultivo representativo el día 24 (E) . Los ensayos de RT-PCR muestran cambios en la expresión génica de hHpSC en condiciones de autorreplicación en plástico de cultivo (F) frente a andamios de biomatriz de hígado de rata el día 7 (G). Comparamos la expresión de los marcadores hHpSC, que incluyen CXCR4 y EpCAM; genes hepatocíticos tempranos que incluyen CK19 (KRT19), HNF6, FOXA2, AFP y niveles bajos de albúmina; marcadores hepatocíticos maduros que incluyen niveles altos de albúmina (a Lb ), transferrina (TF), CYP450-3A4, tirosina aminotransferasa (TAT) y glucosa-6-fosfatasa (G6PC) y genes colangiocíticos, que incluyen CFTR, gamma glutamil transpeptidasa (GGT1), intercambio aniónico 2 (AE2) y transportador apical de ácidos biliares dependientes de sodio (ASBT). Los ensayos bioquímicos que miden la urea (H) sintetizada en cultivos sobre colágeno tipo I frente a andamios de biomatriz de hígado de rata y la actividad de CYP450-3A4 (I) en cultivos sobre colágeno tipo I frente a andamios de biomatriz preparados a partir de hígados de ratas o bovinos. La Tabla 7 proporciona un resumen de las medidas cuantitativas que comparan la unión, la viabilidad, el crecimiento, la vida útil del cultivo y la expresión génica específica de tejido de hHpSC recién aisladas, en condiciones de cultivo para la autorreplicación (colágeno tipo III) o en condiciones de diferenciación en el colágeno I, frente a andamios de biomatriz de hígado.
Las Figuras 6A-D. Tinción de inmunofluorescencia de linaje celular restringido de hHpSC en andamios de biomatriz. (A) Teñido con marcador específico hepático: albúmina (Alb, gris claro) y marcador de superficie de células madre hepáticas: EpCAM (blanco). Obsérvese que las células sembradas sobre el andamio de biomatriz no expresan EpCAM. Barra de escala = 200 μm. (B) Teñido con marcador hepático temprano a-fetoproteína (AFP, gris claro) y con un anticuerpo contra el marcador de colangiocitos humanos, citoqueratina 19 (CK19, blanco) que a este nivel de expresión es indicador de colangiocitos maduros. El anticuerpo para el ensayo de CK19 es específico de humanos y no tiñó el residuo en la CK19 de rata en los andamios no sembrados con células. La expresión de AFP es baja pero todavía evidente en el día 7. Barra de escala = 200 μm. (C) Teñido con Alb (gris claro) y marcador de células estrelladas hepáticas, actina de músculo liso a (ASMA, blanco). La expresión de albúmina y ASMA es una fuerte indicación de la presencia de hepatocitos maduros y células estrelladas. Barra de escala = 100 μm. (D) Teñido con proteína hepática funcional CYP450-3A4 (gris claro) y marcador específico de colangiocitos, receptor de secretina (SR, blanco) que muestra que los hepatocitos y colangiocitos en maduración son funcionales y expresan los marcadores clásicos para estos dos tipos de células. Barra de escala = 200 μm.
Las Figuras 7A-D. Estabilidad de hepatocitos humanos maduros completamente funcionales en andamios de biomatriz. Hepatocitos humanos adultos sembrados en el medio de diferenciación y en colágeno tipo I (A,B) frente a andamios de biomatriz de hígado bovino (C) que se pulverizaron criogénicamente, se dispersaron en el medio y se dejaron sedimentar en las placas. Las células en colágeno tipo I son completamente viables y en su punto máximo de diferenciación de 7-12 días (se muestra A a los 7 días); comienzan a deteriorarse después de ~2 semanas, y a los 20 días (B) están muertos, moribundos y no funcionales. Por el contrario, los que se sembraron en andamios de biomatriz de hígado (C) son funcionales durante al menos 8 semanas (aún no se han evaluado tiempos más largos); aquí se muestra después de 21 días en cultivo en andamios de biomatriz de hígado pulverizado. Ensayos de CYP450-3A4 en cultivos de dos preparaciones separadas de células hepáticas humanas adultas criopreservadas sembradas en andamios de biomatriz frente a colágeno tipo I y analizados el día 12 (D). La muestra ZHep-007 es representativa de las muestras criopreservadas con buena unión después de la descongelación; la muestra ZL-013 es representativa de aquellos lotes que tienen poca o ninguna unión después de la descongelación. Por lo tanto, incluso estas muestras de menor calidad son capaces de unirse a los andamios de biomatriz y permanecer viables a largo plazo. En ambas muestras sometidas al ensayo, los niveles de P450 son mayores cuando se cultivan sobre andamios de biomatriz de hígado. Con el tiempo sobre los andamios de biomatriz, los lotes de células criopreservadas de menor calidad mejorarán.
Las Figura 8. Activación de la fosfolipasa A2 por desoxicolato de sodio para producir lisolecitina. Principio del protocolo: La fosfolipasa A2 (PLA2) activada por desoxicolato sódico degradará el fosfoglicérido ubicado en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensioactivo, que induce necrosis celular.
Las Figura 9. Análisis de la composición de colágeno de hígados de ratas frente a andamios de biomatriz de hígado de rata. La composición de aminoácidos de la biomatriz (negro) y del hígado entero (gris claro) presentada en forma de un diagrama de rosa. Se usa una abreviatura de tres letras para cada aminoácido analizado. El triptófano y la cisteína no se analizaron. Los números indican los residuos de aminoácidos/1000. Las Figuras 10A-C. Análisis de ácidos nucleicos del andamio de biomatriz de hígado de rata. Foto de contraste de fase (A) y tinción con DAPI fluorescente (B) del portaobjetos de biomatriz de hígado, y ensayos cuantitativos sobre ADN y ARN totales a partir de tejido de hígado fresco de rata frente a andamio de biomatriz (C).
Las Figuras 11A-C. Tinción del andamio de biomatriz después de sembrar hHpSC sobre el andamio de biomatriz. El ensayo Live (calceína-AM, blanca)/Dead (bromuro de etidio o EtD-Br-i, gris claro) indica que las colonias de hHpSC fueron viables en secciones de andamios de biomatriz, pero no absorbieron el colorante en el medio de las colonias (A,B) durante los primeros días debido a las bombas conocidas en las células madre (por ejemplo, MDR1) que eliminan los colorantes vitales. En (B), la imagen de fluorescencia se fusiona con la fase uno para indicar que el centro de la colonia contiene células. Para el día 7, las células de la colonia se habían diferenciado y absorbido el colorante vital en casi todas las células de la colonia (C).
Las Figuras 12A-F. Comparación de hepatocitos de rata cultivados sobre colágeno tipo I con respecto a hepatocitos de rata cultivados sobre andamios de biomatriz de hígado de rata. Hepatocitos de rata adulta cultivados sobre colágeno tipo I y andamio de biomatriz en el día 3 (A, C) y el día 10 (B, D). Se unieron dentro de varios minutos en andamios de biomatriz de hígado y sobrevivieron durante el tiempo que se probó, más de 8 semanas (C, D); no se probaron períodos de tiempo más largos. Los cultivos son muy tridimensionales en los andamios de biomatriz. La síntesis de urea (E) y el ensayo de viabilidad celular (F) en los días 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28, n=3.
Las Figuras 13A-D. Comparación de un páncreas humano con un andamio de biomatriz pancreática humana. Páncreas humano (A) frente a andamio de biomatriz pancreática humana (B-D) embebido en parafina, seccionado y teñido con hematoxilina y eosina (H y E). Las estructuras de los islotes se han representado en B. Las regiones acinares de los andamios de biomatriz pancreática se muestran en C y D.
La Figura 14. Comparación de los componentes representativos de la matriz y un componente del citoesqueleto, vimentina, encontrado en tejido pancreático humano frente a andamios de biomatriz pancreática de rata. Otros componentes del citoesqueleto (desmina, tubulina, actina) no se encontraron en cantidades detectables o se encontraron en cantidades traza (citoqueratinas). Las líneas discontinuas rodean los islotes, donde se observa que sindecano1 y el colágeno tipo VI son fuertemente positivos en los islotes tanto en el tejido pancreático como en los andamios de biomatriz. Sindecano 1 se encuentra sólo en los islotes (línea discontinua), pero no en las células acinares (flechas); el colágeno tipo III es más abundante en las células acinares y alrededor de los vasos sanguíneos (flechas), pero no en los islotes.
Las Figuras 15A-C. Tinción histológica e inmunohistoquímica de andamio de biomatriz de duodeno humano. (A) Exterior y cara luminal del andamio de biomatriz de duodeno humano. Las estructuras multicapa entre el tejido normal (B) y el andamio de biomatriz (C) se compararon en secciones teñidas con H y E y los resultados muestran que los andamios conservaron las vellosidades y los vasos sanguíneos en las capas de mucosa y submucosa. Los paneles inferiores muestran que la tinción inmunohistoquímica del andamio de biomatriz de duodeno humano indicó cantidades variables de proteínas de la matriz extracelular conservadas en el andamio. Las Figuras 16A-D. Comparación de un tejido de vesícula biliar humana con un andamio de biomatriz de vesícula biliar humana. Tejido de vesícula biliar humana (A,B) frente a andamios de biomatriz (C,D) preparados a partir de este. El tejido y los andamios de biomatriz se embebieron en parafina, se cortaron y tiñeron con hematoxilina y eosina.
Las Figura 17. Ejemplo de preparación de solución de biomatriz para la dilución 1:24. 30 ml * 3 = 90 ml. 30 ml de biomatriz 90 ml de la Solución 5 = 120 ml de la solución de biomatriz para la dilución 1:24.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora más en detalle de aquí en adelante. Esta invención puede, sin embargo, realizarse en formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Estas modalidades más bien se proporcionan para que la descripción sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.
La terminología que se usa en la descripción de la invención en la presente es con el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no se pretende que sean limitativas de la invención. Tal como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente de cualquier otra manera.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos (que incluyen los términos técnicos y científicos) usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Se comprenderá además que los términos, tales como los definidos en los diccionarios usados comúnmente, deben interpretarse como que tienen un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la técnica relevante y no deben interpretarse en un sentido idealizado o excesivamente formal, a menos que así se defina expresamente en la presente descripción. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente descripción es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente.
Además, como se usa en la presente, "y/o" se refiere y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
A menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descritas en la presente puedan usarse en cualquier combinación. Por otra parte, la presente invención contempla además que en algunas modalidades de la invención, cualquier característica o combinación de características expuestas en la presente descripción pueden excluirse u omitirse. Para ilustrar, si la descripción establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, está específicamente destinado que cualquiera de A, B o C, o una combinación de estos, puede omitirse y rechazarse individualmente o en cualquier combinación.
Como se usa en la presente descripción, la frase de transición "que consiste esencialmente en" (y variantes gramaticales) debe interpretarse como que abarca los materiales o etapas enumeradas "y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada. Véase, In re Herz,537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original);véase también MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en" como se usa en la presente descripción no debe interpretarse como equivalente de "que comprende".
El término "aproximadamente", como se usa en la presente descripción cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad o concentración (por ejemplo, el porcentaje de colágeno en las proteínas totales en el andamio de biomatriz) y similares, está destinado a abarcar variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, o incluso 0,1 % de la cantidad especificada.
La presente invención está dirigida al descubrimiento y desarrollo de un andamio de biomatriz que tiene mejoras y ventajas inesperadas sobre los andamios de tejido descelularizado ahora conocidos, donde algunos ejemplos de la mejora y ventaja son el uso del andamio de biomatriz de esta invención para, de manera eficiente, mantener células maduras y/o restringir el linaje y/o diferenciar células madre a destinos maduros y/o mantener dichas células maduras como funcionales durante un período de tiempo prolongado. Como un ejemplo adicional, el uso de los andamios de biomatriz producidos por los métodos de esta invención reduce el tiempo para producir células de destino maduro de aproximadamente tres a seis semanas o más a aproximadamente una a dos semanas. Los andamios de biomatriz producidos por los métodos de esta invención se producen mediante el uso de protocolos específicos que emplean el equilibrio apropiado de concentración de sal y fuerza iónica (diferentes colágenos tienen diferentes constantes de solubilidad (23)) para un tejido dado, para permitir la conservación de colágenos nativos presentes en ese tejido en forma insoluble, lo que da como resultado un andamio de biomatriz que conserva un alto porcentaje de colágenos nativos que proporcionan señales para impulsar la restricción y diferenciación del linaje. Por el contrario, los andamios descelularizados producidos de acuerdo con protocolos conocidos no emplean tal equilibrio de concentración de sal y fuerza iónica para permitir la retención de un alto por ciento de estos colágenos nativos y la mayoría de estos colágenos nativos se pierden cuando se usan estos protocolos conocidos. Además, los andamios de biomatriz producidos por los métodos de esta invención permiten la producción de virus y/o patógenos dependientes del linaje (por ejemplo, dependientes de la diferenciación) en cantidades suficientes para uso experimental y/o terapéutico (por ejemplo, para la producción de vacunas).
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico seleccionado del grupo que consiste en pulmón, tiroides, piel, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón o intestinos para la dispersión a escala industrial que comprende: a) perfundir el tejido biológico u homogeneizar el tejido biológico con un tampón que comprende una concentración de sal de aproximadamente NaCl 3,5 M a aproximadamente NaCl 4,5 M; b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón de deslipidación que comprende la fosfolipasa A2 y lipasas y/o detergentes de desoxicolato de sodio en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y tiene un pH neutro; entonces
c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a pH neutro y que comprende una concentración de sal de aproximadamente NaCl 2,0 M a aproximadamente NaCl 5,0 M, concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después
d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con ARNasa y ADNasa en un tampón; y después e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que tiene un pH neutro, no contiene suero y tiene una osomolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de esta manera produce un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos 95 % de los colágenos y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico; f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal;
g) congelar el andamio de biomatriz de (f) a aproximadamente -80oC;
h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituración criogénica en partículas de biomatriz que varían en tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 100 μm;
i) descongelar las partículas de biomatriz de (h) en suspensión en medio basal; y
j) dispersar las partículas de biomatriz de la etapa (i) en un aparato de cultivo,
de esta manera produce un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico para su dispersión (por ejemplo, dispersión a escala industrial como se describe en la presente descripción) en aparatos de cultivo. También se proporciona en la presente descripción, pero no se reivindica, un andamio de biomatriz producido por cualquiera de los métodos de esta invención.
"Andamio de biomatriz", como se usa en la presente descripción, se refiere a un extracto tisular aislado enriquecido en matriz extracelular, como se describe en la presente, que conserva muchos o la mayoría de los colágenos y factores unidos al colágeno encontrados naturalmente en el tejido biológico. En algunas modalidades, se conservan esencialmente todos los colágenos y factores unidos a colágeno y, en otras modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende todos los colágenos que se conoce que están en el tejido. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los colágenos, componentes de la matriz asociados al colágeno y/o factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz, en cualquier combinación, que se encuentran en el tejido biológico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende al menos el 95 % de los colágenos y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz del tejido biológico. Como se describe en la presente descripción, "la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas del tejido biológico unidos a la matriz" se refiere a que el andamio de biomatriz conserva aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, sin procesar).
Los colágenos ilustrativos incluyen todos los tipos de colágeno, tales como colágenos de Tipo I a Tipo XXIX. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de uno o más de los colágenos encontrados en el tejido biológico natural y/o pueden tener uno o más de los colágenos presentes en una concentración que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de los encontrados en el tejido biológico natural. La cantidad de colágeno en el andamio de biomatriz puede determinarse mediante varios métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente descripción, tal como la determinación del contenido de hidroxiprolina.
Los componentes de la matriz asociados a colágeno ilustrativos incluyen moléculas de adhesión; proteínas de adhesión; selectina L y P; molécula asociada al crecimiento de unión a heparina (HB-GAM); repetición de trombospondina tipo I (TSR); amiloide P (AP); lamininas; nidógenos/entactinas; fibronectinas; elastinas; vimentinas; proteoglicanos (PG); sulfato de condroitina-PG (CS-PG); dermatán sulfato-PG (DS-PG); miembros de la familia de los pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRP), como el biglicano y las decorinas; heparina-PG (HP-PG); heparán sulfato-PG (HS-PG) tales como glipicanos, sindecanos y perlecanos; y glicosaminoglicanos (GAG) tales como hialuronanos, sulfatos de heparán, sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina y heparinas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende, consiste en, o consiste esencialmente en colágenos, fibronectinas, lamininas, nidógenos/entactinas, elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, hormonas y citocinas (en cualquier combinación) unidos a varios componentes de la matriz. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de uno o más de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colágeno que se encuentran en el tejido biológico natural y/o puede tener uno o más de estos componentes presentes en una concentración que es al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de la que se encuentra en el tejido biológico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende todos o la mayoría de los componentes de la matriz, hormonas y/o citocinas asociados a colágeno que se conoce que están en el tejido. En otras modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende, consiste esencialmente en uno o más de los componentes de la matriz asociados a colágeno, hormonas y/o citocinas en concentraciones cercanas a las que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la concentración encontrada en el tejido natural).
Los factores de crecimiento ilustrativos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformante, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento similar a la insulina (IGF), proteínas de unión a IGF, factores de crecimiento de fibroblastos básicos y factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Las citocinas ilustrativas incluyen interleucinas, linfocinas, monocinas, factores estimulantes de colonias, quimiocinas, interferones y factor de necrosis tumoral (TNF). El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o más (en cualquier combinación) de uno o más de los factores de crecimiento unidos a la matriz y/o citocinas encontradas en el tejido biológico natural y/o puede tener uno o más de estos factores de crecimiento y/o citocinas (en cualquier combinación) presentes a una concentración que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % o más de la encontrada en el tejido biológico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende niveles fisiológicos o niveles casi fisiológicos de muchos o la mayoría de los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz que se conoce que están en el tejido natural y/o se detectan en el tejido y en otras modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende uno o más factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz en concentraciones cercanas a las concentraciones fisiológicas que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, que difieren en no más de aproximadamente el 30 %, 25 %, 20 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % en comparación). La cantidad o concentración de factores de crecimiento o citocinas presentes en el andamio de biomatriz puede determinarse mediante varios métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente descripción, tales como varios ensayos de anticuerpos y ensayos de factores de crecimiento.
"Tejido biológico" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier tejido de un organismo vivo o fallecido o cualquier tejido derivado de un organismo vivo o fallecido. El término "tejido biológico natural" y variaciones de este, como se usan en la presente descripción, se refieren al tejido biológico tal como existe en su estado natural o no modificado en el organismo. Los andamios de biomatriz producidos por los métodos de la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier tejido biológico. El tejido biológico puede incluir cualquier tejido único (por ejemplo, una colección de células que pueden estar interconectadas) o un grupo de tejidos que forman un órgano o parte o región del cuerpo de un organismo. El tejido puede comprender un material celular homogéneo o puede ser una estructura compuesta tal como la que se encuentra en regiones del cuerpo que incluyen el tórax que, por ejemplo, puede incluir tejido pulmonar, tejido esquelético y/o tejido muscular.
Los tejidos biológicos de esta invención incluyen pulmón, tiroides, piel, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que incluye cualquier combinación de estos. El organismo (es decir, el sujeto) del cual el tejido biológico se asocia o deriva puede ser cualquier animal, que incluye mamíferos y no mamíferos tales como invertebrados.
Los sujetos ilustrativos incluyen mamíferos, tales como humanos, ratones, ratas, hurones, hámsteres, conejos, cobayos, cerdos, porcinos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, monos y chimpancés, y no mamíferos, tales como aves, reptiles y animales invertebrados. El sujeto puede ser de cualquier edad y/o tamaño. El tejido biológico puede estar sano, enfermo y/o tener mutaciones genéticas. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz producidos por los métodos de la presente invención son específicos de tejido en su química y funcionalidad, es decir, los andamios de biomatriz son representativos o comparables al tejido biológico a partir del cual fueron creados en términos de su química y funcionalidad.
En algunas modalidades, la histología original y las vasculaturas evidentes se mantienen en los andamios de biomatriz. Esto puede incluir los restos reconocibles de las principales entidades histológicas del tejido biológico, como vasos sanguíneos y otra vasculatura de cualquier tejido; conductos biliares y cápsula de Glisson (GC) del hígado; conductos pancreáticos, islotes y acinos del páncreas; bronquios, tráquea y alvéolos de los pulmones, etcétera. En otras modalidades, la química del andamio de biomatriz se compara con la histología (por ejemplo, la matriz alrededor de los vasos sanguíneos es distinta de la que rodea a los hepatocitos). En algunas modalidades la química del andamio de biomatriz está en un gradiente que se correlaciona con la histología. Por ejemplo, cuando el tejido biológico es el hígado, el andamio de biomatriz puede conservar el gradiente en la química de la matriz que se correlaciona con las zonas acinares hepáticas 1-3 desde la tríada portal a la vena central y con entidades histológicas tales como los canales vasculares y la cápsula de Glisson (GC). Los ejemplos adicionales incluyen vasos sanguíneos donde la química de la matriz alrededor de los vasos sanguíneos está repleta de altos niveles de colágenos en red (por ejemplo, tipo IV y tipo VI), elastinas y formas de HS-PG; alrededor de los hepatocitos en la zona periportal (zona 1), donde las lamininas tienen una alta concentración junto con una mezcla de CS-PG y HS-PG, mientras que alrededor de la zona pericentral (zona 3), hay hepatocitos rodeados por una mezcla de HS-PG y HP-PG; asociado con los conductos biliares donde hay altos niveles de colágeno tipo I, fibronectinas y formas de CS-PG y DS-PG. En todos los tejidos existen gradientes paralelos en la química de la matriz.
Una serie de medios de enjuague, tales como el primer y el segundo medio, y tampones pueden usarse en la presente invención. En particular, puede usarse cualquier medio de enjuague o tampón que mantenga los colágenos y los factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) en un estado insoluble. Al elegir un medio o tampón, la concentración de sal, el pH y la fuerza iónica deben ser adecuados para mantener los colágenos y/o la mayoría o muchos de los componentes de la matriz unidos al colágeno y otros factores (por ejemplo, en virtud de sus conexiones químicas directa o indirectamente con los colágenos) en estado insoluble. La Tabla 1 proporciona intervalos de concentración molar de cloruro de sodio para varios tipos de colágeno para ayudar a los expertos en la técnica a proporcionar medios y tampones que aseguren que los colágenos, los componentes de la matriz asociados al colágeno y los factores de crecimiento unidos a la matriz y las citocinas permanezcan insolubles. Deyl y otros, ("Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins" Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275) proporciona adicionalmente información sobre la química del colágeno que puede facilitar la identificación de las condiciones óptimas para mantener los colágenos y los factores ligados en un estado insoluble.
La Tabla 1 demuestra que el pH es una variable que trabaja junto con la concentración de sales para definir la solubilidad. Cuando se tienen altas concentraciones de sal, el pH puede ser neutro. En algunas modalidades de la presente invención, la concentración de sal elegida es la que mantiene todos los colágenos del tejido en un estado insoluble, no sólo uno de los colágenos del tejido en un estado insoluble. Por ejemplo, los colágenos conocidos en el hígado fetal son los insolubles en concentraciones de sal de 4,5 M de NaCl y los de tejido hepático adulto que son insolubles en concentraciones de sal de aproximadamente 3,4 M-3,5 M de NaCl.
La osmolalidad de cualquiera de los medios de enjuague y/o tampones puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, que incluye, pero no se limita a, todos los valores dentro de estos intervalos que no se mencionan explícitamente en la presente descripción. El agua destilada y los tampones diluidos (por ejemplo, con osmolalidad < 100 mOsm/kg) darán como resultado la pérdida de cantidades significativas de colágeno, componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento unidos a la matriz y citocinas. Por lo tanto, en algunas modalidades de los métodos de esta invención, no se incluyen agua destilada ni tampones diluidos.
Como reconocerá un experto en la técnica, la osmolalidad es una expresión de la concentración osmótica de un soluto por masa, mientras que la osmolaridad es por volumen del disolvente. Por lo tanto, la conversión de osmolaridad a osmolalidad puede realizarse mediante la multiplicación por la densidad de masa. La osmolalidad puede medirse con un osmómetro que mide las propiedades coligativas, tales como la depresión del punto de congelación, la presión de vapor y la elevación del punto de ebullición.
La osmolaridad es la medida de la concentración de soluto, definida como el número de osmoles (Osm) de soluto por litro (L) de solución (osmol/L u Osm/L). La osmolaridad de una solución habitualmente se expresa como Osm/L. Mientras que la molaridad mide el número de moles de soluto por unidad de volumen de solución, la osmolaridad mide el número de osmoles de partículas de soluto por unidad de volumen de solución. La osmolalidad es una medida de los osmoles de soluto por kilogramo del solvente (osmol/kg u Osm/kg).
La molaridad y la osmolaridad no se usan comúnmente en osmometría porque son dependientes de la temperatura. Esto se debe a que el agua cambia su volumen con la temperatura. Sin embargo, si la concentración de solutos es muy baja, la osmolaridad y la osmolalidad se consideran equivalentes.
La osmolaridad de una solución puede calcularse a partir de la siguiente expresión:
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donde 0 es el coeficiente osmótico, que explica el grado de no idealidad de la solución; n es el número de partículas (por ejemplo, iones) en las que se disocia una molécula; C es la concentración molar del soluto; y el índice i representa la identidad de un soluto particular. En el caso más simple 0 es el grado de disociación del soluto. Entonces, 0 está entre 0 y 1 donde 1 indica 100 % de disociación. Sin embargo, 0 también puede ser mayor que 1 (por ejemplo, para sacarosa). Para las sales, los efectos electrostáticos causan que 0 sea menor que 1 incluso si se produce una disociación del 100 %.
La perfusión del tejido biológico con cualquier medio o tampón puede lograrse al forzar el medio o tampón a través de la vasculatura relevante del tejido biológico. Por ejemplo, si el tejido biológico es el hígado, entonces el medio o tampón pueden perfundirse a través de la vena porta del hígado. Alternativamente, el medio o tampón pueden verterse sobre el tejido biológico y/o dejar que difundan a través del tejido biológico. Por ejemplo, el tejido biológico puede sumergirse y/o dializarse en el medio o tampón, para permitir que el medio o tampón difundan a través del tejido biológico. Mientras se sumergen y/o se dializan en el medio o tampón, la solución y el tejido biológico pueden sacudirse, tal como sobre un balancín, y/o agitarse. En algunas modalidades los medios y tampones se perfunden a través de la vasculatura relevante del tejido biológico.
Alternativamente, el tejido puede homogeneizarse en el medio inicial y los tampones y medios usados después de esto son para la extracción del homogeneizado. Las versiones homogeneizadas de los andamios de biomatriz se preparan a partir de órganos grandes (por ejemplo, de tejidos de vaca o porcino), después se pulverizan hasta obtener un polvo a temperaturas del nitrógeno líquido y el polvo se usa en placas para estudios de cultivo.
En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio es un medio basal, tal como RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, BME, DMEM, medio de Waymouth o de William. En la técnica se conocen otros medios basales ilustrativos y están disponibles comercialmente. El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir esencialmente o consistir en componentes que se combinan para mantener la mayoría de los colágenos insolubles y como moléculas nativas, como se describe en la presente descripción (por ejemplo, mediante la combinación particular de la osmolalidad y la fuerza iónica así como la ausencia de suero). El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir en, o consistir esencialmente en constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el líquido intersticial tal como agua; sales tales como sales inorgánicas; vitaminas; minerales; aminoácidos tales como glicina, serina, treonina, cisteína, asparagina y/o glutamina; azúcares; ácidos grasos; coenzimas; hormonas; y neurotransmisores. En ciertas modalidades en las que el primer medio y/o el segundo medio comprenden constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el líquido intersticial, los constituyentes pueden producir una osmolalidad aproximadamente equivalente a la osmolalidad del medio basal disponible comercialmente o producir una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio incluyen medio que no contienen suero, comprenden constituyentes presentes en el líquido intersticial, y/o tienen una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. Tales medios también pueden estar a pH neutro. La composición específica del primer medio y/o el segundo medio se determina, en modalidades particulares, por las constantes de insolubilidad de los colágenos del tejido biológico usado para obtener el andamio de biomatriz, como conocerá un experto en la técnica.
El tampón de deslipidación debe ser efectivo y, al mismo tiempo, suave. El tampón de deslipidación puede comprender, consistir o consistir esencialmente en detergentes o tensioactivos, medio basal, sales y/o lipasas. Al elegir los componentes para el tampón de deslipidación, deben evitarse detergentes duros (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, Triton X-100) para minimizar la pérdida de componentes de la matriz. Los detergentes ilustrativos incluyen detergentes aniónicos, tales como sales del ácido desoxicólico, ácido 1-heptanosulfónico, N-laurilsarcosina, laurilsulfato, ácido 1-octanosulfónico y ácido taurocólico; detergentes catiónicos tales como cloruro de benzalconio, cetilpiridinio, cloruro de metilbenzetonio y bromuro de decametonio; detergentes zwitteriónicos tales como alquil betaínas, alquil amidoalquil betaínas, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato y fosfatidilcolina; y detergentes no iónicos tales como n-decil a-D-glucopiranósido, n-decil p-D-maltopiranósido, ndodecil p-D-maltósido, n-octil p-D-glucopiranósido, ésteres de sorbitán, n-tetradecil p-D-maltósido, tritones, Nonidet-P-40, Poloxámero 188 y cualquiera de los grupos de detergentes Tween; lauril sulfato sódico; y desoxicolato sódico.
Las lipasas ilustrativas incluyen, fosfolipasas tales como fosfolipasa A2, lipasa pancreática humana, esfingomielinasas, lipasa lisosomal, lipasa endotelial y lipasa hepática. En los métodos de la invención, el tampón de deslipidación comprende desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2. Esta combinación, en algunas modalidades, puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y aproximadamente 1 % de desoxicolato sódico preparado en un medio basal de pH neutro y que no contiene suero, que puede ser, por ejemplo, el primer medio. La combinación de desoxicolato sódico y fosfolipasa A2 degrada rápidamente el fosfoglicérido ubicado en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un tensioactivo potente, que puede inducir necrosis y citólisis. Como reconocerá un experto en la técnica, la cantidad y el tipo de lipasa y/o detergente pueden depender del tejido biológico.
La etapa de perfusión del tejido biológico con el tampón de deslipidación se lleva a cabo, en algunas modalidades, hasta que el tejido se vuelve transparente. En otras modalidades, la etapa de perfusión del tejido biológico con el tampón de deslipidación se lleva a cabo hasta que la efusión se vuelve clara. En algunas modalidades, la etapa de deslipidación se lleva a cabo hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusión se vuelve clara.
En algunas modalidades se evita la exposición prolongada de los andamios de biomatriz a las enzimas de las células lisadas, ya que puede disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos tales como sulfatos de heparán, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatán y heparinas, que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento. La exposición a las enzimas de las células lisadas puede evitarse, por ejemplo, durante la deslipidación y/o los lavados posteriores después de la deslipidación. En algunas modalidades, puede emplearse el uso de un inhibidor de proteasas y/o un control cuidadoso del pH, la temperatura y/o el tiempo para limitar la actividad de las proteasas y/u otras enzimas de las células lisadas.
Los inhibidores de proteasa ilustrativos incluyen inhibidores de serina proteasa tales como antipaína, aprotinina, quimostatina, elastatina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, leupeptina e inhibidor de tripsina de soja; proteasas de cisteína tales como IAA (ácido indolacético) y E-64; inhibidores de la proteasa aspártica tales como pepstatina y VdLPFFVdL; metaloproteasas tales como EDTA, 1,10-fenantrolina y fosforamodón; exopeptidasas tales como amastatina, bestatina, diprotina A y diprotina B; proteasas tiol; a-2-macroglobulina, inhibidor de tripsina de soja o haba de lima; inhibidor de la proteasa pancreática; ovostatina de clara de huevo; cistatina de clara de huevo; y combinaciones de inhibidores de proteasa, comúnmente denominadas "cóctel de inhibición de proteasa" por los proveedores comerciales de dichos inhibidores.
El pH del andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios puede mantenerse de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios se mantienen a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0 o se mantienen a un pH de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5, que incluye, pero no se limita a, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no mencionado explícitamente en la presente descripción. En otras modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios se mantienen a pH neutro. La temperatura del andamio de biomatriz (por ejemplo, durante y/o después de la preparación), los tampones y/o los medios puede ser de aproximadamente 0°C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, que incluye, sin limitación, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no mencionado explícitamente en la presente descripción. En algunas modalidades la temperatura se mantiene a aproximadamente 20 °C. El tiempo de perfusión del tejido biológico con cualquier medio 0 tampón puede ser de aproximadamente 5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos, aproximadamente 1 hora o menos, aproximadamente 30 minutos o menos, o aproximadamente 15 minutos o menos. En algunas modalidades, la etapa de perfusión del tejido biológico con el tampón de deslipidación es de aproximadamente 30 minutos o menos. En algunas modalidades en las que se usan pH ácidos, las concentraciones de sal para mantener insolubles a los colágenos y los componentes asociados al colágeno pueden ser diferentes; las concentraciones pueden determinarse por la literatura existente sobre la química del colágeno mediante la elección de concentraciones de sal que mantienen la insolubilidad de los colágenos.
Los tampones ilustrativos incluyen cloruro de sodio, lactato de sodio, acetato de sodio, fosfato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio, gluconato de sodio, tampones de citrato, tampones bis\tris, tampones de fosfato, fosfato de potasio, citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio, cloruro de amonio, ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico, tris(hidroximetil)metilamina, N-tris(hidroximetil)metilglicina, ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanosulfónico y ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico.
En algunas modalidades, el tampón de esta invención (por ejemplo, el tampón usado en la etapa c) descrito en la presente descripción) puede comprender una sal en una concentración de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M. Por ejemplo, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,5 M, o de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,0 M, que incluye, sin limitación, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no mencionado explícitamente en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades el tampón usado en los métodos de la presente invención puede comprender una sal tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 2,0 M de NaCl a aproximadamente 4,5 M de NaCl. En otros ejemplos no reivindicados, como los de hígados adultos, el tampón usado puede comprender de aproximadamente NaCl 3,4 M a aproximadamente 3,5 M. En ejemplos no reivindicados tales como los del hígado fetal, el tampón usado puede comprender una sal tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 4,0 M a aproximadamente 4,50 M. En algunas modalidades, la perfusión del tejido biológico con un lavado con sal, como la de la etapa c) de los métodos ilustrativos descritos en la presente descripción, se lleva a cabo hasta que el perfundido (es decir, el fluido usado para la perfusión, tal como el fluido que ha sido forzado a través de la vasculatura) es negativo para proteínas por densidad óptica (DO) a 280 nm.
Cualquiera de los medios y/o tampones de la presente invención puede comprender un inhibidor de proteasas. Los inhibidores de proteasas ilustrativos se describen anteriormente. En algunas modalidades, el tampón tal como el de la etapa (c) de los métodos ilustrativos descritos en la presente comprende un inhibidor de proteasas, tal como un inhibidor de tripsina de soja. En otras modalidades, el tampón de la etapa (d) comprende uno o más inhibidores de proteasas, tales como un inhibidor de tripsina de soja.
Los medios y/o tampones de la presente invención pueden comprender una o más nucleasas, que en algunas modalidades pueden prepararse en los tampones estándar recomendados por los proveedores comerciales de estas enzimas. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tampón de la etapa d) comprende una o más nucleasas, como ARNasa y ADNasa. La perfusión con nucleasas elimina residuos de ácidos nucleicos. En otras modalidades, el tampón de la etapa d) comprende ARNasa, ADNasa y uno o más inhibidores de proteasas. En algunas modalidades, la perfusión del tejido biológico con una o más nucleasas se lleva a cabo hasta que el perfundido (es decir, el fluido usado para la perfusión, tal como el fluido que ha sido forzado a través de la vasculatura) es negativo para ácidos nucleicos por densidad óptica (DO) a 260 nm. En algunas modalidades, las nucleasas eliminan el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de los ácidos nucleicos en el tejido biológico.
El segundo medio (por ejemplo, medio de enjuague final) puede ser cualquier medio que asegure que los colágenos y los factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) permanecerán insolubles, como se describió anteriormente. Los medios de enjuague finales ilustrativos se han descrito anteriormente con referencia al primer medio y no contienen suero, a pH neutro y con una osmolalidad de 250­ 350 mOsm/kg. Por ejemplo, en algunas modalidades el segundo medio comprende un medio basal. En algunas modalidades, el segundo medio es un medio basal que no contiene suero. En otras modalidades, el segundo medio es un medio hormonalmente definido, que no contiene suero (HDM) que comprende hormonas, factores de crecimiento, lípidos y albúmina sérica y se adapta a las necesidades de las células a cultivar. Un segundo medio ilustrativo es el medio de Kubota (Kubota y Reid, PNAS 97:12132-12137, 2000), que está diseñado para células madre hepáticas, hepatoblastos y otros progenitores. En ciertas modalidades, el segundo medio puede comprender o no la suplementación con suero o un factor derivado del suero, como la albúmina sérica humana. En algunas modalidades, el enjuague del tejido con el segundo medio elimina los residuos del tampón de deslipidación y las nucleasas. En otras modalidades, el lavado con el segundo medio y/o cualquier tampón o medio posteriores equilibra el andamio de biomatriz con el medio o tampón. En algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser iguales y, en algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser diferentes.
En algunas modalidades uno o más de los medios y/o tampones usados en la preparación del andamio de biomatriz no contiene (es decir, no contienen una cantidad detectable de) una o más enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. En otras modalidades, todos los medios y tampones usados en la preparación del andamio de biomatriz no contienen (es decir, no contienen una cantidad detectable de) una o más enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. Las enzimas ilustrativas incluyen colagenasas; proteasas; glicosidasas tales como heparinasa, heparitinasa, condroitinasa e hialuronidasa; y elastasas.
La esterilización del tejido biológico, del homogenado y/o del andamio de biomatriz de esta invención puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, con la advertencia de que deben evitarse métodos que utilicen un factor que pueda unirse al andamio de biomatriz (por ejemplo óxido de etileno). Los métodos de esterilización ilustrativos incluyen irradiación gamma, esterilización por plasma de descargas luminiscentes de radiofrecuencia (RFGD), esterilización por haz de electrones y esterilización con dióxido de carbono supercrítico. En algunas modalidades, la esterilización del tejido, del homogeneizado y/o del andamio de biomatriz se realiza con irradiación gamma a aproximadamente 5000 rads. Si los andamios se usarán inmediatamente para la recelularización, y si se usaron procedimientos estériles en el proceso de descelularización (especialmente después de la extracción con alto contenido de sal), puede que la esterilización no sea necesaria.
El almacenamiento del andamio de biomatriz puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para usarse intacto), el andamio de biomatriz puede almacenarse a aproximadamente 4 °C y en otras modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para dispersarse en la secta, el andamio de biomatriz se congela, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención comprende, consiste en, o consiste esencialmente en colágenos, fibronectinas, lamininas, nidógeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y cualquier combinación de estos, siendo todos parte del andamio de biomatriz (por ejemplo, unidos al andamio de biomatriz). En algunas modalidades, el andamio de biomatriz producido por los métodos de la invención carece de una cantidad detectable de colágeno, fibronectina, laminina, nidógeno/entactina, elastina, proteoglicano, glicosaminoglicano y cualquier combinación de estos.
Los andamios de biomatriz producidos por los métodos de la presente invención han demostrado ser sustratos de diferenciación potentes para las células y pueden usarse para muchos tipos de células, tal como cualquier célula madura o para diversas poblaciones de células madre. Estos incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre de la capa germinal (por ejemplo, células madre endodérmicas definitivas), células madre determinadas (por ejemplo, células madre hepáticas, pulmonares, pancreáticas o intestinales), células madre hepáticas humanas (hHpSC), células madre perinatales (por ejemplo, células madre derivadas del líquido amniótico (AFSC)), células madre mesenquimales (MSC) tales como las de la médula ósea o del tejido adiposo, progenitores comprometidos, células adultas de cualquier tipo de tejido, células enfermas, células tumorales, células maduras, células parenquimatosas, células estrelladas, colangiocitos, células del árbol biliar tales como las que no son colangiocitos, hepatocitos, células renales, células uroteliales, células mesenquimatosas, células del músculo liso o esquelético, miocitos (células madre musculares), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, fibromioblastos, células endoteliales, células ectodérmicas, que incluye células dúctiles y de la piel, células neurales, células de los islotes, células presentes en el intestino, osteoblastos, otras células que forman hueso o cartílago, y cualquier combinación de estas. Estas células pueden ser normales o enfermas.
En algunos ejemplos no reivindicados, los andamios de biomatriz se usan para estudios biológicos, farmacéuticos, genéticos, moleculares y/o virológicos de células, ya sea recién aisladas del tejido o de células madre de linaje restringido. En otros ejemplos no reivindicados, los andamios de biomatriz se usan para órganos implantables, vascularizados, tal como el hígado. Otros usos ilustrativos para los andamios de biomatriz incluyen, fabricación de proteínas, pruebas de toxicidad de fármacos, desarrollo de fármacos, cribado de anticuerpos y/o producción viral para preparaciones de vacunas de virus. La producción viral de virus dependientes del linaje (por ejemplo, virus del papiloma y de la hepatitis C) puede lograrse tras sembrar poblaciones de células madre en un andamio de biomatriz específico de tejido y después cultivándolos en un medio que funciona en combinación con el andamio de biomatriz para inducir completamente la diferenciación de las células. Los viriones maduros se producirán cuando las células maduren completamente. Mientras el virus en sí no afecte la viabilidad celular, las células maduras infectadas con el virus pueden mantenerse durante al menos ocho semanas lo que ofrece un medio para generar grandes cantidades de virus con un sistema de cultivo estable.
Los andamios de biomatriz pueden usarse intactos, tal como el uso para cultivos 2-D y/o 3-D para células. En algunos ejemplos no reivindicados, los andamios de biomatriz pueden usarse en combinación con un medio específico para la diferenciación en cultivos 2-D y/o 3-D para líneas celulares, tales como células normales o enfermas de cualquier etapa de linaje de maduración, desde células madre hasta células en etapa tardía.
Alternativamente, los andamios de biomatriz pueden congelarse. Estas secciones congeladas pueden prepararse y usarse como sustratos. Los andamios de biomatriz pueden congelarse rápidamente en hielo seco y las secciones congeladas pueden prepararse con un criostato, se colocan en aparatos de cultivo (por ejemplo, placas, matraces, paños, transpocillos, etcétera), esterilizados y rehidratados en el medio antes de sembrar las células. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz congelado de esta invención puede seccionarse.
En algunos ejemplos no reivindicados, se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con células, de esta manera se produce un cultivo celular.
En algunos ejemplos no reivindicados, se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invención; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una sección congelada del andamio de biomatriz de la etapa (b) como sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con células, de esta manera se produce un cultivo celular.
En otros ejemplos no reivindicados, los andamios de biomatriz pueden molerse hasta convertirlos en polvo. Un método de triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo comprende triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo en un molino con congelación a temperaturas del nitrógeno líquido o cercanas a esta. Los demás aparatos para triturar a nitrógeno líquido o a temperaturas equivalentes (por ejemplo, congelación con hielo seco) se conocen en la técnica. El polvo puede llevarse a temperatura ambiente a la cual adquiere la consistencia de una pintura con la que se puede recubrir los aparatos de cultivo mediante el uso de un cepillo de pintura esterilizado o un aparato equivalente. El polvo o las placas pueden esterilizarse.
Así, en algunos ejemplos no reivindicados, se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz producido por los métodos de la presente invención; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta obtener un polvo; c) recubrir un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con medio de cultivo celular en el aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con células, de esta manera se produce un cultivo celular. En algunos ejemplos no reivindicados de este método, la trituración de la biomatriz puede llevarse a cabo en un molino congelador (por ejemplo, trituración criogénica) a la temperatura del nitrógeno líquido o cerca de ella.
En algunas modalidades antes de sembrar las células para el cultivo celular, se añade una porción del medio al aparato de cultivo ya que las células pueden unirse en segundos. Las células, en algunos casos, se unen dentro de segundos a minutos para las células adultas normales y dentro de minutos a unas pocas horas para varios tipos de células madre. En algunas modalidades la unión de las células puede depender de cómo se dispersan los andamios de biomatriz para su uso en los cultivos. El medio celular puede ser cualquier medio que sea adecuado para producir un cultivo celular. En algunas modalidades, el medio de cultivo celular comprende al menos un constituyente presente en el líquido intersticial, en donde la osmolalidad de dicho medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, en donde dicho medio no contiene suero y en donde el pH es neutro. En otras modalidades, el medio de cultivo celular puede ser un medio basal, tales como RPMI-1640, DME/F12, medio de Ham, medio de Kubota, etcétera.
Los cultivos celulares producidos con los andamios de biomatriz, en algunos ejemplos no reivindicados, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en el mismo tipo de células que las células del tejido biológico que se usó para fabricar el andamio de biomatriz. Los ejemplos no limitantes de las células de esta invención incluyen células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre determinadas, células madre perinatales, células madre derivadas de líquido amniótico (AFSC), células madre mesenquimales (MSC) de cualquier fuente, progenitores comprometidos o células adultas de cualquier tipo de tejido, células maduras, células normales, células enfermas, células tumorales y cualquier combinación de estas. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen células hepáticas, células parenquimatosas, células estrelladas, células endoteliales, hepatocitos, colangiocitos, células del árbol biliar que no son colangiocitos y células pancreáticas.
En algunos ejemplos no reivindicados, las células madre primitivas (ya sean ES, iPS, MSC o AFSC) restringirán el linaje de las células, al menos parcialmente, al tipo de tejido usado para fabricar el andamio de biomatriz. Las células madre determinadas de una capa germinal dada limitarán su linaje al tipo de tejido usado para obtener el andamio de biomatriz cuando el andamio se prepara a partir de un tejido derivado de esa capa germinal y pueden diferenciarse parcialmente al destino adulto si están sobre un andamio a partir de un tejido derivado de una capa germinal diferente. Por lo tanto, la capacidad de las células adultas de diferenciarse completamente puede determinarse por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. Paralelamente, el destino de las células madre puede estar parcial o totalmente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz o el destino de las células madre puede estar completamente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. En algunos ejemplos no reivindicados, las células del cultivo celular son de un tipo diferente al de las células del tejido biológico usado para fabricar el andamio de biomatriz. Como se describió en detalle anteriormente, los tipos de células ilustrativos que pueden usarse para producir un cultivo celular incluyen células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre mesenquimales, células madre derivadas de líquido amniótico, células madre determinadas, células maduras, células normales, células enfermas celulares, células tumorales y cualquier combinación de estas. Estas células pueden ser de cualquier tejido biológico como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, los andamios de biomatriz producidos por los métodos de la invención inducen un crecimiento lento o una detención del crecimiento correlacionada con la diferenciación de las células normales, ya sean células madre o células maduras. Las células maduras, en algunos ejemplos, se diferencian por completo en cuestión de horas y permanecen establemente diferenciadas durante al menos ocho semanas después de esto. En algunos ejemplos, las células adultas (es decir, células completamente maduras) se unen a los andamios en cuestión de minutos y conservan su diferenciación completa después de esto durante más de ocho semanas. Las células madre, en algunos ejemplos, se someten a algunas divisiones y después detienen su crecimiento y se diferencian por completo. Las células madre permanecen estables en la detención del crecimiento, viables y totalmente diferenciadas durante al menos ocho semanas. En algunos ejemplos, las células madre sembradas en andamios de biomatriz sufren una detención del crecimiento o un crecimiento lento, pierden marcadores de células madre y se diferencian a células maduras y funcionales en aproximadamente una semana, se conservan fenotipos y viabilidades estables durante al menos ocho semanas o más (por ejemplo, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de viabilidad durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas, al menos 11 semanas, al menos 12 semanas, al menos 13 semanas, al menos 14 semanas, al menos 15 semanas, al menos 16 semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos 11 meses, al menos un año, etcétera)
En otros ejemplos no reivindicados, el andamio de biomatriz se usa para diferenciar células madre embrionarias (ES) y/o inducir células madre pluripotentes (IPS) a un destino específico. Por ejemplo, en algunos ejemplos no reivindicados, se usa un andamio de biomatriz específico de tejido para facilitar la diferenciación de células madre embrionarias o células pluripotentes inducidas hacia un destino específico.
En ciertos ejemplos no reivindicados, el andamio de biomatriz se usa para diferenciar células madre derivadas de líquido amniótico (AFSC) o células madre mesenquimales (MSC) de la médula ósea o del tejido adiposo o de cualquier tejido fetal o posnatal o cualquier célula madre determinada (por ejemplo, de pulmón, intestino, árbol biliar, riñón, piel, corazón, etcétera) hacia un destino adulto específico. En algunos ejemplos no reivindicados, los andamios de biomatriz producidos mediante los métodos de la presente invención se usan para mejorar y acelerar la diferenciación de células madre en células maduras mediante la producción de un cultivo celular. En otros ejemplos no reivindicados proporcionados en la presente descripción hay un método para mejorar y/o acelerar la diferenciación de células madre y/o progenitores a células maduras, que comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los métodos de esta invención, en donde las células son células madre y el medio de cultivo está formulado para células maduras, de esta manera mejora y/o acelera la diferenciación de células madre y/o progenitores a células maduras. El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio que se formule para células maduras. Los constituyentes en el medio son distintos para cada tipo celular. La diferenciación significa que las condiciones provocan que las células maduren a tipos celulares adultos que producen productos génicos específicos de adultos. Las células empleadas en estos métodos pueden ser células adultas de cualquier tipo o células madre o progenitores, cuyos ejemplos no limitantes incluyen células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre de la capa germinal, células madre determinadas, células madre perinatales, células madre derivadas de líquido amniótico, células madre mesenquimatosas, células amplificadoras de tránsito o progenitores comprometidos de cualquier tipo de tejido.
Las células sembradas en los andamios de biomatriz (por ejemplo, andamios de biomatriz intactos, secciones de andamios o andamios de biomatriz en polvo mezclados con/sobre otros materiales implantables) pueden trasplantarse a animales o seres humanos como método de injerto de células in vivo. En algunos ejemplos no reivindicados, se proporciona un método para suministrar células a un sujeto que comprende poner en contacto al sujeto con el andamio de biomatriz de la presente invención, donde el andamio de biomatriz comprende células. En otros ejemplos no reivindicados, se proporciona un método para suministrar células a un sujeto que comprende sembrar el andamio de biomatriz de la presente invención con células y después trasplantar el andamio de biomatriz sembrado con las células al sujeto. En algunos ejemplos no reivindicados, puede trasplantarse a un sujeto un andamio de biomatriz que no ha sido sembrado con ninguna célula.
En algunos ejemplos no reivindicados, el andamio de biomatriz puede usarse como un injerto que puede usarse para regenerar el tejido u órgano en el sujeto.
Los andamios de biomatriz producidos por los métodos de la presente invención pueden usarse para establecer órganos bioartificiales, que pueden ser útiles para programas analíticos y/o clínicos. Los andamios de biomatriz pueden usarse, además, para identificar productos génicos específicos o facetas de estados patológicos. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos de animales mutantes y posteriormente se usan para definir factor(es) relevante(s) asociado(s) con la(s) mutación(es). En otras modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos patológicos y se usan para definir cambios en la matriz relevantes para la enfermedad.
Los ejemplos adicionales no limitantes de usos de los andamios de biomatriz producidos por los métodos de esta invención pero no reivindicados incluyen: 1) uso del andamio para cultivar células malignas para definir su potencial metastásico (la capacidad de las células tumorales para formar colonias crecientes de células en un tipo dado de andamio de biomatriz es predictiva de la capacidad de las células para hacer metástasis al tejido del que se preparó ese andamio; 2) colocar injertos de tejido en el andamio para usarse para el trasplante en un sujeto); 3) producción de organoides formados por recelularización de andamios para usarse como dispositivos auxiliares, tales como, por ejemplo, un organoide hepático que después se conecta a un sujeto con insuficiencia hepática; 4) el uso del andamio para la producción de proteínas (las células en el andamio producen un factor que puede aislarse del medio y/o de las células y después purificarse, y 5) el uso del andamio para la producción de virus dependientes del linaje; por ejemplo, para la producción de virus que requieren células diferenciadas para producir partículas suficientes para su uso como vacuna.
Por lo tanto, en la presente descripción se proporciona, pero no se reivindica, un método para identificar el potencial metastásico de células tumorales en un tipo de tejido, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) monitorear el crecimiento de las células tumorales sobre el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las células tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido a partir del cual se produjo el andamio de biomatriz, de esta manera se identifica el potencial metastásico de las células tumorales en el tipo de tejido.
También se proporciona en la presente descripción, pero no se reivindica, un método para identificar una célula tumoral sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las células tumorales en el andamio de biomatriz; y f) monitorear el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la falta de crecimiento de las células tumorales y/o la muerte de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica a las células tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral. Los ejemplos no limitantes de tratamiento antitumoral incluyen agentes quimioterapéuticos, anticuerpos, terapia de radiación, inmunoterapia, terapia hormonal, etcétera, como se conoce bien en la técnica. En algunos ejemplos no reivindicados, las células tumorales de un sujeto pueden sembrarse en diferentes andamios de biomatriz de esta invención y exponerse a tratamientos antitumorales respectivos. De acuerdo con los resultados de estos respectivos análisis de diferentes tratamientos antitumorales, se puede seleccionar un tratamiento antitumoral que sea efectivo contra las células tumorales del sujeto y el tratamiento antitumoral que pueda administrarse al sujeto para tratar el tumor del sujeto.
En ejemplos adicionales no reivindicados, se proporciona un método para producir un injerto tumoral para trasplantarlo a un animal huésped, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) establecer una población de células tumorales en el andamio de biomatriz de (d), de esta manera produce un injerto tumoral para trasplante en el animal huésped. En algunos ejemplos no reivindicados, este método puede comprender además la etapa de trasplantar el injerto tumoral en el animal huésped. En diversas modalidades, el injerto tumoral puede ser singénico, alogénico o xenogénico con respecto al animal huésped.
También se proporciona en la presente descripción, pero no se reivindica, un método para producir partículas virales de un virus dependiente de linaje, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células de un tipo y etapa de linaje que pueden infectarse con el virus dependiente del linaje; d) infectar las células de (c) con el virus dependiente del linaje; e) mantener las células infectadas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y f) recoger partículas virales producidas en las células infectadas, de esta manera se producen partículas virales del virus dependiente del linaje.
Los ejemplos no limitantes de un virus dependiente del linaje incluyen el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis B, el virus del papiloma humano norovirus y cualquier otro virus conocido ahora o identificado posteriormente como dependiente del linaje. Por dependiente del linaje se entiende que la célula en la que está presente el virus debe madurar o diferenciarse a una etapa particular antes de que el virus pueda replicarse con éxito en la célula y producir partículas virales, como se conoce en la técnica.
Además, se proporciona pero no se reivindica un método para producir un organoide formado por recelularización de un andamio de biomatriz, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células del mismo tipo de tejido que el tejido biológico usado para preparar el andamio de biomatriz; y d) mantener las células en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, mientras que se forman organoides a partir de las células, de esta manera se produce un organoide formado por recelularización del andamio de biomatriz. Este método puede comprender además la etapa de poner en contacto el organoide producido por las etapas (a) a (d) con un sujeto, para usar como un dispositivo auxiliar, como se conoce en la técnica. Cualquier tipo de célula que pueda usarse para producir el andamio de biomatriz de esta invención puede usarse en este método. En algunos ejemplos no reivindicados, las células son células hepáticas.
También se proporciona, pero no se reivindica, un método para producir una proteína de interés en células cultivadas sobre un andamio de biomatriz, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células que producen la proteína de interés; d) mantener las células de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y e) recoger la proteína de interés producida por las células de (d), de esta manera se produce una proteína de interés en células cultivadas sobre un andamio de biomatriz. Este método puede comprender la etapa adicional de purificar la proteína de interés recolectada en la etapa (f). La proteína de interés de esta invención puede ser cualquier proteína producida por una célula, ya sea a partir de un gen endógeno y/o como una proteína recombinante, en una cantidad que pueda recolectarse de las células en cultivo y/o el medio de cultivo. Numerosos ejemplos de tales proteínas de interés se conocen en la técnica.
La presente invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
La invención se define en las reivindicaciones. Cualquiera de los siguientes ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.
Ejemplo 1. La restricción del linaje de células madre hepáticas humanas a los destinos maduros se hace eficiente mediante andamios de biomatriz con especificidad tisular.
Resumen. Los protocolos actuales para la diferenciación de células madre hacen uso de múltiples tratamientos de señales solubles y/o factores de matriz y dan como resultado típicamente una diferenciación parcial a células maduras con subexpresión o sobreexpresión de genes específicos de tejido adulto. En la presente invención, se desarrolló una estrategia para la diferenciación rápida y eficaz de células madre mediante el uso de sustratos de andamios de biomatriz, extractos específicos de tejidos enriquecidos en matriz extracelular y factores de crecimiento y citocinas asociados, en combinación con un medio hormonalmente definido y que no contiene suero (HDM), adaptado para el tipo de células adultas de interés. Los estudios descritos en la presente demuestran la eficacia de los andamios de biomatriz de esta invención en la diferenciación de células madre hepáticas humanas (hHpSC) a destinos maduros y en el mantenimiento de células parenquimatosas maduras como completamente funcionales durante largos períodos de tiempo. Los andamios de biomatriz se prepararon por un novedoso protocolo de descelularización de cuatro etapas mediante el uso de condiciones diseñadas para mantener insolubles a todos los tipos de colágeno. Los andamios mantuvieron la histología nativa, vasculatura evidente y aproximadamente el 1 % de las proteínas tisulares, pero > 95 % de sus colágenos, la mayor parte de los componentes de la matriz asociados al colágeno del tejido y los niveles fisiológicos de factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz. Los colágenos aumentaron de niveles casi indetectables a > 15 % de las proteínas del andamio con el resto que incluye lamininas, fibronectinas, elastina, nidógeno/entactina, proteoglicanos y citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz en patrones correlacionados con la histología. Las células madre hepáticas humanas (hHpSC), sembradas en los andamios de biomatriz de hígado y en un HDM adaptado para células hepáticas adultas, perdieron los marcadores de células madre y se diferenciaron a células parenquimatosas maduras y funcionales en aproximadamente una semana, permaneciendo viables y con fenotipos de células maduras estables para más de ocho semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de esta invención pueden usarse para estudios biológicos y farmacéuticos de células madre restringidas al linaje, para el mantenimiento de células maduras y para tejidos u órganos modificados, vascularizados e implantables.
Procedimientos para la descelularización. Después de la anestesia con ketamina-xilazina, se abrió la cavidad abdominal de la rata y se insertó un manguito con una cánula en la vena porta para perfundir todo el hígado. (1) La perfusión se realiza con RPMI 1640 durante 10 minutos; seguido de (2) deslipidación con una lipasa (por ejemplo, 20-50 unidades de fosfolipasa A2--PLA2) combinada con un detergente suave tal como desoxicolato sódico al 1 % (SDC) durante aproximadamente 30-60 minutos hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusión se vuelve clara; (3) la perfusión con lavados con alto contenido de sal (para hígados fetales: 4,5 M de NaCl y para hígados adultos 3,4 M-3,5 M de NaCl) se realiza hasta que el perfusado sea negativo para proteínas según la densidad óptica (DO) a 280 nm; (4) perfusión con nucleasas (ADNasa, ARNasa) en RPMI 1640 hasta que el perfusado sea negativo para ácidos nucleicos según DO 260; y (5) enjuague final con RPMI 1640 durante 2 horas o más.
Los andamios de biomatriz se congelan rápidamente en hielo seco y se preparan secciones congeladas con un criostato, se colocan en placas de cultivo celular de 24 pocillos, se esterilizan por irradiación gamma (5000 rads) y se rehidratan en medio (KM) durante 30 minutos antes de sembrar las células. Las secciones de andamios de biomatriz cubrieron ~ 95 % de la superficie de los pocillos en la placa de 24 pocillos.
Un método alternativo para distribuir los andamios de biomatriz en las placas de cultivo consistió en pulverizarlo hasta obtener un polvo mediante el uso de un molino con congelación lleno con nitrógeno líquido. El polvo pulverizado, cuando se lleva a temperatura ambiente, adquiere la consistencia de una pintura, y con él puede recubrirse cualquier superficie, tales como placas, portaobjetos, tela, filtros u otras superficies usadas para unir células y/o cultivo de células. La pulverización de los andamios elimina los gradientes de los componentes y las señales de la matriz, pero la mezcla de componentes presentes todavía produce potentes efectos de diferenciación. Los andamios también pueden usarse intactos y volver a sembrar con células en la preparación de órganos modificados para trasplante in vivo o para cultivos 3-D.
Se desarrollaron métodos alternativos para usar con hígados porcinos y bovinos. Los hígados de cerdo y bovino se obtuvieron de una instalación de procesamiento de carne certificada por el USDA (CT). Ver el Ejemplo 3 para un esquema de un protocolo representativo. Cada hígado se inspeccionó por USDA y recibió el sello USDA antes de salir de la instalación. Los hígados se transportaron en medio ESP-Gro (Gigacyte, Branford, CT, núm. de catálogo 1101-250). Los hígados recibidos en el laboratorio se pesaron, se fotografiaron y se prepararon para la perfusión. Después de triturar, la mezcla se descongeló y se diluyó a una relación de medio: biomatriz de 1:48. Esta suspensión de biomatriz se usó después para recubrir las placas. Después de secar, la biomatriz se lavó tres veces y después se aplicaron las células. Las células hepáticas adultas se unieron en 10 minutos a las placas. Las células madre/progenitores pueden tomar más tiempo (unas pocas horas). Sin embargo, tanto para las células madre/progenitores como las células hepáticas adultas, esencialmente el 100 % de las células viables se unen.
Medios y soluciones. Todos los medios se esterilizaron por filtración (filtro de 0,22 μm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes de su uso. Para mantener los colágenos estables en la biomatriz, el pH del medio de perfusión para la preparación de los andamios de biomatriz se mantuvo a 7,5-8,0. Se usó RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) como medio basal para la preparación de los andamios de biomatriz y para los cultivos de hepatocitos o células madre hepáticas. Todos los reactivos excepto los indicados se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
Medios de perfusión para la preparación de andamios de biomatriz.
(1) . Lavado por perfusión y enjuague por perfusión: medio basal que no contiene suero (por ejemplo, RPMI-1640);
(2) . Perfusión con detergente: 36 unidades/l de PLA2 más 1 % de SDC;
(3) . Perfusión con alto contenido de sales: NaCl 3,4 M con inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml;
(4) . Perfusión con nucleasas: ARNasa a 5 mg/l00 ml, ADNasa a 1 mg/l00 ml e inhibidor de la tripsina de soja a 0,1 mg/ml (por ejemplo, preparado en RPMI 1640).
El medio de Kubota. KM se diseñó originalmente para hepatoblastos47 y ahora se ha encontrado efectivo para progenitores hepáticos humanos48 y para otros progenitores endodérmicos, que incluye los del árbol biliar (Wang y otros, "Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic islets" Hepatology, 2011, en prensa) y páncreas (Wang, Y y Reid L, datos no publicados). Consiste en cualquier medio basal (siendo aquí RPMI 1640) sin cobre, bajo en calcio (0,3 mM), Selenio 10'9M, BSA 0,1 %, nicotinamida 4,5 mM, sulfato de zinc heptahidratado 0,1 nM (de Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston, Inglaterra), hidrocortisona 10'8M, transferrina/Fe 5 μg/ml, insulina 5 μg/ml, lipoproteína de alta densidad 10 μg/ml y una mezcla de ácidos grasos libres que se añaden unidos a la albúmina sérica humana purificada.
Para diferenciar las células a un destino adulto, puede usarse un medio hormonalmente definido, que no contiene suero (HDM) adaptado al tipo deseado de células adultas. Por ejemplo, usamos HDM para el destino del hígado adulto que consiste en KM suplementado con calcio para lograr una concentración de 0,6 mM, cobre 10'12 M, triyodotironina (T3) 1 nM, glucagón 7 ng/ml, FGF 20 ng/ml, galactosa 2 g/l, oncostatina M (OSM) 10 ng/ml, factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10 ng/ml, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 20 ng/ml e hidrocortisona 10'8M. Las células se sembraron en este HDM que no contiene suero en caso de sembrarse en los andamios; en circunstancias en las que se usaron enzimas para procesar las células o los tejidos, entonces el HDM se suplementó con FBS al 5 % (HyClone, Waltham, MA) durante unas pocas horas y después se cambió a HDM que no contiene suero a continuación. En paralelo, los experimentos de control, los cultivos se mantuvieron en el HDM con 5 % de FBS en todo el estudio, pero se encontró que la presencia de suero provocó que las células perdieran funciones diferenciadas con el tiempo. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores están unidos a los andamios de biomatriz. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores están unidos a los andamios de biomatriz.
Caracterización de árboles vasculares intactos en los andamios de biomatriz de hígado. Los restos de matriz ramificada de la vasculatura, que incluye la red de capilares en el andamio de biomatriz de hígado de rata, se ha visualizado mediante microscopía de luz y fluorescencia, respectivamente. Se inyectaron partículas de dextrano de 250 kDa marcadas con rodamina en el andamio de biomatriz de hígado a través del resto de la vena porta para comprobar la integridad de los restos del sistema vascular en la matriz en los andamios de biomatriz. Se preparó una película mediante el uso de un microscopio de disección de fluorescencia Leica MZ16FA (motorizado).
Procesamiento de hígado fetal humano. Los tejidos de hígado fetal fueron proporcionados por una agencia acreditada (Recursos Biológicos Avanzados, San Francisco, CA) a partir de fetos de entre 16-20 semanas de edad gestacional obtenidos mediante interrupciones electivas del embarazo. El protocolo de investigación se revisó y aprobó por la Junta de Revisión Institucional para Estudios de Investigación en Humanos en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se prepararon suspensiones de células hepáticas humanas fetales como se describió anteriormente4849. Brevemente, el procesamiento se llevó a cabo en RPMI 1640 suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1 %, selenio 1 nM y antibióticos. El tampón de procesamiento enzimático contenía colagenasa tipo IV a 300 U/ml y desoxirribonucleasa a 0,3 mg/ml a 32 °C con agitación frecuente durante 15-20 min. Las suspensiones enriquecidas se presionaron a través de una malla de calibre 75 y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos antes de la resuspensión. La viabilidad celular estimada por exclusión de azul de tripán fue habitualmente superior al 95 %.
Enriquecimiento de hHpSC y cultivo en andamios de biomatriz. Usamos dos métodos para la purificación o enriquecimiento de hHpSC:
1) Selección del cultivo. Aproximadamente 3*105 células se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y en KM. El medio se cambió cada 3 días. Las colonias se formaron en cuestión de 5-7 días y se observaron durante y hasta 3 meses. Las colonias Se recolectaron manualmente después de 14-18 días mediante el uso de un microscopio invertido (1X-FLAIII, Olympus, Japón y Melville, NY).
2) La inmunoselección magnética de subpoblaciones de progenitores hepáticos multipotentes (hHpSC y hHB) se logró mediante la selección de células positivas para la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM, CD326) mediante el uso de tecnologías de inmunoselección de perlas magnéticas con el sistema Miltenyi Biotech MACS (Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo la Instrucciones del fabricante50. En resumen, las células disociadas se incubaron con anticuerpo para EpCAM unido a microperlas magnéticas durante 30 min a 4 °C, y se separaron mediante el uso de un sistema de separación en columna magnética de Miltenyi según los procedimientos recomendados por el fabricante.
Los cultivos se sembraron con 250 colonias hHpSC o hHpSC enriquecidas 5x105 o hepatocitos adultos primarios 2,5*105. El medio se reemplazó diariamente y el medio recolectado se almacenó a -20 °C para un análisis posterior. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos recubiertas con Colágeno tipo I sirvieron como control.
Aislamiento de hepatocitos de rata adulta. Se obtuvieron suspensiones recién aisladas de hepatocitos de rata a partir de ratas Lewis macho adultas de 3 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que pesaban 200-250 g. Un método de perfusión de dos etapas mejorado como se describió anteriormente49 se usó para el aislamiento y la purificación de hepatocitos de rata. El hígado se perfundió durante 10-15 minutos con un tampón que no contiene calcio que contenía EGTA y después colagenasa en un tampón que contenía calcio durante 10-15 minutos. Después el hígado se disoció mecánicamente presionando el hígado digerido a través de una tela de queso y después se filtró secuencialmente la suspensión celular a través de tamices con tamaño de la malla cada vez menores. Las células se lavaron dos veces y después se sedimentaron a 50 g. La viabilidad se definió mediante el conteo de las células después de la tinción con azul de tripán. Rutinariamente, se aislaron 200-300 millones de células por rata con una viabilidad del 89-96 % y una pureza > 99 %.
Aislamiento y cultivo de células hepáticas adultas humanas. Se obtuvieron suspensiones de células hepáticas humanas frescas de CellzDirect. (ahora una parte de Invitrogen, RTP, NC). Las suspensiones se procesaron según los métodos de CellzDirect y después se resuspendieron en medio HeptoMAIN (núm. de catálogo 1103-250; GigaCyte, Branford, CT) sembradas a 1,88 * 105 células/cm2 en placas de pocillos múltiples recubiertas con andamios de biomatriz de hígado o en colágeno tipo I (1 μg/ml; Meridian Catalog núm. A33704H).
Análisis químico del colágeno. La cantidad de colágeno en los andamios de biomatriz se evaluó sobre la base del contenido de hidroxiprolina (hyp). Las muestras de hígados enteros y de andamios de biomatriz se pulverizaron, lavaron y liofilizaron. Después, las alícuotas se hidrolizaron y se sometieron a análisis de aminoácidos51, y el contenido de colágeno por proteína total se estimó sobre la base del valor hyp de 300 residuos/colágeno.
Análisis cuantitativo del contenido de ADN y ARN. Para evaluar el ADN total que quedaba en la biomatriz de hígado descelularizada, se pesaron, cortaron y digirieron con proteinasa K tanto el tejido de hígado de rata fresco como la biomatriz descelularizada y se aisló el ADN celular total52. Para evaluar el ARN total que permanecía en la biomatriz de hígado descelularizada, tanto el tejido hepático fresco de rata como la biomatriz de hígado descelularizada de rata se pesaron y después se homogeneizaron en solución de TRIzol (Invitrogen), y se aisló el ARN celular total. Ensayos de factor de crecimiento. Se enviaron muestras de hígados de rata, andamios de biomatriz de hígado de rata, tejido de conducto biliar humano y andamios de biomatriz de conducto biliar humano (dos muestras cada uno) a RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia) para el análisis de factores de crecimiento. Las muestras se homogeneizaron, se prepararon como lisados y después se sometieron a ensayo con 1 mg/ml de proteína, que produce fluorescencia, definida en unidades de intensidad fluorescente (FIU). Los ensayos semicuantitativos del factor de crecimiento se realizaron mediante el uso de Matrices de factores de crecimiento humano RayBio®, Serie G 1. Las FIU se redujeron con respecto a la de los controles negativos en cuanto a la unión no específica y se normalizaron con respecto a la concentración de proteínas. Los datos de los duplicados se promediaron. Se usaron cuatro arreglos que permitieron el estudio de ~ 40 factores de crecimiento. Aunque el ensayo se desarrolló para factores de crecimiento humanos, hay suficiente solapamiento en reacción cruzada con los factores de crecimiento de rata para permitir el uso tanto de muestras de rata como humanas.
Microscopía electrónica de transmisión y barrido (TEM y SEM). Para TEM, los andamios de biomatriz se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en glutaraldehído al 3 %/cacodilato de sodio al 0,1 %, pH 7,4 durante la noche. Después de tres lavados con tampón de cacodilato sódico, los andamios de biomatriz se fijaron posteriormente durante 1 hora en tampón de tetróxido de osmio al 1 %/cacodilato sódico 0,1. Después de enjuagar en agua desionizada, se deshidrató y se embebió en resina epóxica Polybed 812 (Polysciences, Niles, IL). Los andamios de biomatriz se cortaron perpendicular al sustrato a 70 nm mediante el uso de una cuchilla de diamante. Las secciones ultrafinas se recogieron en rejillas de cobre con malla 200 y se tiñeron con acetato de uranilo acuoso al 4 % durante 15 minutos, seguido por citrato de plomo de Reynolds durante 7 minutos. Las muestras se visualizaron mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión LEO EM910 que funciona a 80 kV (LEO Electron Microscopy, Oberkochen, Alemania). Las imágenes digitales se adquirieron mediante el uso de una cámara digital CCD SC1000 Orius de Gatan y Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan, Pleasanton, CA).
Para SEM, después de la fijación y los enjuagues, los andamios de biomatriz se deshidrataron y se transfirieron en etanol al 100 % al secador de punto crítico CPD -020 Balzers (Bal-Tec AG, Balzers, Suiza) y se secaron mediante el uso de dióxido de carbono como disolvente de transición. La matriz se montó sobre soportes de muestra de aluminio con lengüetas adhesivas de carbono y se recubrió con un espesor de 10 nm de metal oro-paladio (aleación 60:40) mediante el uso de un recubridor por pulverización Hummer X (Anatech, Worcester MA). Las muestras se examinaron mediante el uso de un Zeiss Supra 55 FESEM a un voltaje de aceleración de 5 kV y se adquirieron imágenes digitales mediante el uso del programa informático SmartSEM de Zeiss (Carl Zeiss SMT, Alemania y Thornwood, NY).
Inmunocitoquímica e inmunohistología. Para la tinción fluorescente de células cultivadas en andamios de biomatriz, las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente, se enjuagaron con HBSS, se bloquearon con suero de cabra al 10 % en HBSS durante 2 h y se enjuagaron. Las células fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, se lavaron, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos del isotipo y marcados, se lavaron, se contratiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos celulares y se observaron mediante el uso de un microscopio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX).
Para la inmunohistoquímica, los andamios de biomatriz se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 %. Se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Las secciones se desparafinaron, y los antígenos se recuperaron. Las peroxidasas endógenas se bloquearon mediante incubación durante 30 min en solución de H2O2 al 0,3 %. Después de bloquear con suero de caballo al 10 %, se aplicó el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche; el anticuerpo secundario y la tinción ABC se realizaron mediante el uso del kit RTU Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El vector Nova RED se usó como sustrato. Las secciones se deshidrataron, fijaron y embebieron en medio de montaje Eukitt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y se analizaron mediante el uso de un microscopio invertido. Los anticuerpos usados para las secciones de hígado y para los cultivos se enumeran en la Tabla 4.
Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Las hHpSC se cultivan en placas de cultivo celular y las colonias se transfirieron a un andamio de biomatriz. Después de otro cultivo durante 7 días, las colonias se lisaron para RT-PCR. El ARN total se extrajo mediante el uso de un Mini kit RNeasy Plus (Qiagen GmbH, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se llevó a cabo con el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó el kit de mezcla maestra HotStarTaq (Qiagen) para la PCR. Los cebadores de PCR se enumeraron en la Tabla 5.
Ensayo LIVE/DEAD y ensayo de viabilidad celular. Se usó un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) para los ensayos de adhesión y proliferación. Las hHpSC o los hepatocitos se incubaron con dos sondas, calceína-AM (Live, gris claro) y homodímero-1 de etidio (EtdD-1, Dead), para la actividad de esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmática, respectivamente. Los especímenes se observaron bajo un estereoscopio de fluorescencia Olympus SZX12 (OLYMPUS, Japón y Melville, NY). Se usó un kit para el ensayo de viabilidad celular de resazurina (Biotium, Hayward, CA) según el manual del fabricante. Brevemente, se añadió 10 % de solución de resazurina al medio de cultivo y se incubó a 37 °C durante la noche. Se obtuvo una absorbancia de DO570-DO600 mediante el uso de un lector de microplacas de detección múltiple Biotek Synergy HT (Winooski, VT) y se graficó la curva de viabilidad. Todos los experimentos se realizaron tres veces mediante el uso de un mínimo de tres muestras por condición experimental.
Ensayos funcionales específicos hepáticos. Se detectó la actividad de CYP4503A4 mediante el uso de un Sistema de detección P450-Glo™ (Promega, Madison, WI). Brevemente, las células cultivadas se incubaron con medio que contenía el sustrato luminogénico CYP3A4, luciferina-PPXE para CYP, durante 4 horas a 37 °C. La detección y análisis de luciferina se realizó según las instrucciones del fabricante con un contador Wallace Victor2 Multilabel (ahora parte de Perkins/Elmer en Waltham, MA). La cuantificación de la secreción de albúmina se realizó mediante el uso de un kit de cuantificación de ELISA para albúmina humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Para los ensayos de síntesis de urea, las células se incubaron con amonio 2 mM durante 24 horas y el sobrenadante se recogió y se ensayó con el kit de ensayo para urea Quantichrom (Bioessay Systems, Hayward, CA). El sobrenadante de una muestra para cada condición de cultivo se ensayó por triplicado y el experimento se repitió 3 veces.
Análisis estadístico. Los experimentos se repitieron al menos 2-3 veces con muestras duplicadas o triplicadas para cada condición. Se presentan datos de experimentos representativos, mientras que se observaron tendencias similares en los múltiples ensayos. Todas las barras de error representan la S.E.M.
Los andamios de biomatriz se preparan con un protocolo novedoso de cuatro etapas. Los andamios de biomatriz se prepararon mediante el uso de un protocolo que comprende la deslipidación seguida de extracciones con alto contenido de sales y mediante el uso de métodos de perfusión (Figura 1). Una presentación detallada del protocolo se da en los métodos. Esto se logra mediante un novedoso protocolo de cuatro etapas: 1) deslipidación suave; 2) lavados con tampones con concentraciones de sales de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M (por ejemplo, 2,0 M-2,5 M, 2,6 M-3,0 M; 3,1 M-3,5 M, 3,6 M-4,0 M, 4,1 M-4,5 M; 4,6 M-5,0 M), concentraciones de sales conocidas para mantener los colágenos en un estado insoluble23 (la concentración y el pH exactos de los tampones lo determinan los tipos de colágeno en el tejido), concentraciones que se conoce que mantienen los colágenos en un estado insoluble 23; 3) tratamiento con nucleasas para eliminar ácidos nucleicos residuales; y 4) enjuagues con un medio basal para eliminar los residuos de detergente, sales y nucleasa, así como también equilibrar los componentes de la matriz con el medio (Figura 1A).
Las elecciones de los medios de enjuague o de los tampones para las nucleasas pueden ser cualquiera de un número de opciones siempre y cuando la concentración de sal y la fuerza iónica sean tales que mantengan los componentes de la matriz en un estado insoluble. En la elección del método de deslipidación es fundamental que sea efectivo y sin embargo suave. Se seleccionó una combinación de desoxicolato sódico (SDC) y Fosfolipasa A2 (PLA2) para degradar rápidamente el fosfoglicérido ubicado en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensioactivo, que puede inducir necrosis y citólisis. La fórmula reactiva se muestra en la Figura 8. Evitamos los detergentes agresivos, tales como el dodecilsulfato de sodio (SDS) o Triton-X 100, que podrían disolver algunos componentes de la matriz, como los glicosaminoglicanos (consulte la revisión deGilbert y otros, "Decellularization of tissues and organs" Biomaterials 27:3675-3683 (2006)).
Evitamos la exposición prolongada de los andamios a las enzimas de las células alteradas durante la deslipidación y los lavados con alto contenido de sales, ya que pueden disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos (GAG), como los sulfatos de heparán (HS), los sulfatos de condroitina (CS), sulfatos de dermatán (DS) y heparinas (HP), que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento24. Se usó un inhibidor de la tripsina de soja y un control cuidadoso del pH (7,5-8,0), la temperatura (20 °C) y el tiempo (30-60 min) para limitar la actividad de las proteasas derivadas de las células lisadas.
Se perfundió todo el tejido a través de la vasculatura relevante (por ejemplo, la vena porta en el hígado), lo que permitió aislar rápidamente (en pocas horas) un andamio de biomatriz con pérdida mínima de los componentes de la matriz. La rapidez del aislamiento se debe a la etapa inicial con detergente que deslipida el tejido en aproximadamente 30-60 minutos (no horas o días como en los protocolos usados por otros). Los andamios de biomatriz resultantes son translúcidos o blancos (Figura 1). Además, mediante el uso de este método de perfusión, mantuvimos los canales de vasculatura primarios, la vena porta y hepática y la mayoría de las ramas vasculares en el hígado, lo que aumentó la eficiencia de descelularización. Las partículas de dextrano marcadas con rodamina fluorescente perfundidas a través de los andamios de biomatriz permanecieron dentro de los restos de la vasculatura, lo que demuestra que son permeables (Figura 1E). Hay un flujo progresivo del colorante desde los vasos grandes a las ramas finas de los vasos sanguíneos a lo largo de los canales sin fugas. Este hecho será útil en la revascularización de los andamios como un medio para preparar tejidos modificados para cultivo tridimensional y/o para implantación ex-vivo.
Cuando se seccionaron, los andamios conservaron la estructura histológica del tejido original, que incluye los restos reconocibles de las principales entidades histológicas, tales como los vasos sanguíneos, los conductos biliares y la cápsula de Glisson (GC) (Figura 1). Comparar las Figuras 1B1 y 1D1, en las que se contrasta una sección del tejido hepático con la de un andamio de biomatriz. Los restos de la matriz de la muralia de las células parenquimatosas consisten en una red similar a un encaje (Figuras 1D2-1D3).
El colágeno, las proteínas asociadas al colágeno y las citocinas unidas se mantienen en los andamios de biomatriz. La cantidad de colágeno en andamios de biomatriz se evaluó mediante análisis de aminoácidos mediante métodos usados anteriormente25. Dado que la hidroxiprolina (Hyp) es única para los colágenos y las proteínas colágenas, la composición de colágeno en relación con la proteína total se expresó como residuos de Hyp por cada 1000 aminoácidos. Los resultados demostraron que el contenido de colágeno aumentó desde niveles casi indetectables, es decir, menos de 0,2 residuos de hidroxiprolina (Hyp)/1000 en el hígado, a ~ 13 residuos de Hyp/1000 en los andamios de biomatriz. Esto indica que la deslipidación y los lavados con alto contenido de sal, descritos anteriormente, no eliminaron los colágenos, dejando casi todos los colágenos en los andamios de biomatriz. La detección de niveles significativos de hidroxilisina (Hyl), otro aminoácido asociado al colágeno, y niveles más altos de glicina (Gly) en el andamio de biomatriz respaldan nuestra conclusión de que el colágeno está notablemente enriquecido en los andamios de biomatriz (Figuras 2A, 9 y Tabla 2).
Mediante el uso de estudios inmunohistoquímicos y ultraestructurales, pudimos identificar en los andamios todas las formas conocidas de colágeno que se encuentran en el hígado in situ que incluye colágenos fibrilares (colágeno tipos I, III y V, 10-30 nm de diámetro para fibrillas y 500-3000 nm para fibras ensambladas) y filamentos en perlas (posiblemente tipo VI). Esas fibras y filamentos están presentes en la capa de tejido conectivo subcapsular situada debajo de la capa mesotelial. Aunque las estructuras típicas de las membranas basales no se encontraron a lo largo de los sinusoides desde las tríadas portales hasta las venas centrales, encontramos que el colágeno tipo IV y algunas pequeñas fibrillas unidas forman entramados 3D porosos en forma de red, que sirven como andamio para las células parenquimatosas (Figura 2). Los haces de colágeno tipo I pueden verse como la estructura principal de los andamios a los que se unen otros tipos de colágeno, glicoproteínas y proteoglicanos. En el espacio de Disse encontramos pequeños haces de colágeno tipo I y fibras de colágeno tipo III y VI así como también algún tipo V, el cual es más abundante cerca de las tríadas portales y venas centrales. Los datos de inmunohistoquímica representativos se presentan en la Figura 3B, y en la Figura 4D se enumera un resumen de los componentes de la matriz y su ubicación en el tejido hepático normal frente a los de los andamios de biomatriz. Los primeros estudios en el desarrollo de protocolos para la preparación de andamios de biomatriz indicaron que la mayor parte de los componentes del citoesqueleto se pierden en los lavados. Sin embargo, evaluamos los andamios mediante inmunohistoquímica y no encontramos evidencia de tubulina, desmina o actina, cantidades traza de citoqueratinas 18 y 19, y bajos niveles de vimentina dispersos a lo largo de los andamios.
La matriz asociada con los conductos biliares y las porciones de los sistemas vasculares hepáticos (vasos arteriales y venosos) consiste en estructuras típicas de la membrana basal y por lo tanto es bastante distintiva de las capas delgadas de la matriz asociada con las estructuras vasculares encontradas en los sinusoides. En la tríada portal se encuentra laminina, entactina/nidógeno, perlecán y colágeno tipo IV, mientras que en el Espacio de Disse sólo se encuentra perlecán y algo de colágeno tipo IV. Están presentes cantidades enormes de elastina ondulada e hidrófoba; ésta se reticula y forma láminas y fibras restringidas principalmente al tejido conectivo subcapsular, regiones portales y paredes arteriales. Las fibronectinas son ubicuas y prevalentes en toda la matriz hepática y son especialmente abundantes en el Espacio de Disse, donde forman filamentos finos o depósitos granulares (Figuras 2 y 3).
La inmunohistoquímica indica que los proteoglicanos conocidos en el tejido se conservan en los andamios de biomatriz (Figuras 3B, 4D). Entre los proteoglicanos heterogéneos identificados, el sindecano se encontró intercalado y de manera continua a lo largo de los sinusoides, y el perlecán es más puntual en el espacio de Disse. Las formas de HS-PG y CS-PG se encuentran a lo largo de los restos de los sinusoides en los andamios de biomatriz y en patrones que se correlacionan con la zonación conocida del tejido hepático.
Los proteoglicanos y otros componentes de la matriz son reservorios importantes de citocinas y factores de crecimiento que se unen estrechamente a sus GAG26. La mayoría de los factores de crecimiento y las hormonas se encuentran en los andamios de biomatriz en concentraciones cercanas a las encontradas en el tejido original. En la Tabla 6 se proporcionan los datos de los lisados de hígados de rata frente a andamios de biomatriz de hígado de rata y en la Tabla 3, se proporcionan datos paralelos de tejido de conducto biliar humano frente a andamios de biomatriz de conducto biliar. Curiosamente, hubo algunos ejemplos (por ejemplo, bFGF) con un fuerte enriquecimiento en los andamios de biomatriz de hígado sobre el que se encontró en los lisados hepáticos. Los factores de crecimiento y las citocinas unidas tienen diferencias cualitativas y cuantitativas entre los andamios de tejido hepático con respecto a los de conducto biliar, lo que implica especificidad tisular o especificidad de especie. Alternativamente, puede deberse, en parte, al hecho de que los andamios de conductos biliares se prepararon, por necesidad, mediante agitación del tejido en los tampones sobre un balancín y no mediante perfusión a través de la vasculatura.
La química de los andamios de biomatriz se correlaciona con la histología. Una característica importante de este nuevo protocolo es la retención de la química de la matriz en patrones que se correlacionan con las zonas acinares hepáticas 1-3 desde la tríada portal hasta la vena central y con entidades histológicas como los canales vasculares y la cápsula de Glisson (GC), como se muestra en las Figuras 4A-C. La química de la matriz periportalmente en la zona 1 es similar a la encontrada en los hígados fetales y consiste, en parte, en colágeno tipo III, laminina y formas de CS-PG. Esto hace la transición a una química de la matriz diferente en las zonas acinar media (zona 2) y pericentral (zona 3) y termina con una matriz muy estable con altos niveles de colágeno tipo IV y HP-PG27.
Se conoce que innumerables proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento y hormonas, proteínas de coagulación, diversas enzimas) se unen a la matriz y se mantienen estables mediante la unión a patrones de sulfatación discretos y específicos en los GAG o a otros componentes de la matriz24. Por lo tanto, la química de la matriz pasa de su punto de inicio en el nicho de células madre que tiene una química de matriz lábil asociada con un alto recambio y una sulfatación mínima a químicas de matriz estables y que tienen cantidades crecientes de sulfatación con progresión hacia la zona pericentral. Esperamos que el mantenimiento de la arquitectura natural y la química de la matriz en correlación con la histología facilitará la recelularización en los procesos de ingeniería tisular al dirigir a las células a sitios específicos en los andamios de biomatriz y/o proporcionar la mezcla adecuada de señales para conducir a la expansión y/o diferenciación a células maduras.
El andamio de biomatriz puede prepararse a partir de diferentes tejidos y especies. Los andamios de biomatriz pueden prepararse fácilmente a partir de cualquier tejido, normal o enfermo y de cualquier especie. En las Figuras 13-16 mostramos andamios de biomatriz a partir de páncreas humano, árbol biliar y duodeno y a partir de páncreas de rata y porcino. En las Figuras 5-7 y la Figura 12 se muestran los efectos de andamios de biomatriz de hígado bovino o de rata sobre células hepáticas. Además, los andamios de biomatriz se han preparado a partir de aorta abdominal, vena ilíaca humanas y a partir de intestino de rata y cerdo. Los estudios histológicos, ultraestructurales e inmunohistoquímicos en los andamios de biomatriz indican una marcada especificidad tisular, pero no especificidad de especie, en su estructura, composición química y funciones.
Los andamios de biomatriz indujeron y/o mantuvieron la diferenciación de las células. La siembra de hHpSC en placas con secciones de andamios de biomatriz de hígado y en HDM adaptado para células hepáticas adultas dio como resultado esencialmente el 100 % de las células viables unidas dentro de unas pocas horas a los andamios de biomatriz; ya sea intacto o después de la pulverización criogénica. Las colonias de células que se formaron inicialmente en las secciones de los andamios conservaron parte de su fenotipo de células madre, ya que las células en el centro de las colonias pudieron resistir la tinción con colorantes (Figura 11) y expresaron marcadores progenitores hepáticos clásicos, tales como el receptor 4 de la quimiocina (motivo C-X-C) (CXCR4) y la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) (Figura 5). Se dividieron una o dos veces y después pasaron a la detención del ciclo celular y a morfologías 3-dimensionales (3-D) en forma de cordón típicas de cultivos de células parenquimatosas maduras (Figuras 5 y 6 para la diferenciación de células madre; comparar con la Figura 7 y la Figura 12). El HDM usado no requirió todas las citocinas o factores de crecimiento habituales, ya que estos están presentes unidos a los andamios de biomatriz. La transición a la detención del crecimiento se correlacionó con la tinción en todas las colonias con colorantes de viabilidad (Figura 12), con la pérdida de expresión de EpCAM y CXCR4 y con un aumento constante en la expresión de genes colangiocíticos y hepatocíticos específicos de adultos, como la urea y el citocromo P4503A4. (Figura 5).
Los hepatocitos normales adultos humanos y adultos de rata se sembraron sobre andamios de colágeno tipo I o de biomatriz de hígado a partir de hígado de rata o de bovino y en HDM para células adultas. Las células parenquimatosas adultas pudieron unirse a los andamios en 10 minutos (incluso en un medio que no contiene suero) frente a las pocas horas con colágeno tipo I, permanecieron en detención del crecimiento desde el punto de unión; y permanecieron viables y completamente funcionales durante más de 8 semanas en andamios frente a solo aproximadamente ~2 semanas en colágeno tipo I. (Figuras 7 y 12). Los niveles de funciones de las células hepáticas maduras en andamios de biomatriz durante semanas demostraron ser iguales o de manera similar a los hallazgos de otros hepatocitos adultos recién aislados28. Las diferencias drásticas son que los cultivos sobre colágeno tipo I se deterioran rápidamente después de 2 semanas, mientras que los de los andamios de biomatriz permanecen estables morfológica y funcionalmente mientras los cultivos se mantengan (hasta ahora ~8 semanas).
Los andamios de biomatriz contienen la mayor parte de los componentes de la matriz extracelular del tejido y las citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz que proporcionan un conjunto compuesto de señales químicas que pueden usarse como un andamio insoluble y estable con una extraordinaria capacidad para inducir hHpSC a destinos hepáticos adultos, así como también mantener las células adultas completamente diferenciadas durante semanas. Al comparar los tipos existentes de extractos de matriz preparados por los investigadores con los del andamio de biomatriz de la presente invención, está claro que los tratamientos físicos, enzimáticos y químicos tienen efectos sustanciales sobre la composición, el comportamiento mecánico y las respuestas del huésped a los andamios biológicos derivados de la descelularización de tejidos y órganos nativos y, en consecuencia, tienen implicaciones importantes para sus aplicaciones in vitro e in vivo. Todos los demás métodos existentes para la preparación de sustratos o andamios dan como resultado la eliminación de una gran parte de los componentes de la matriz, ya sea mediante el uso de enzimas que degradan la matriz16 o mediante el uso de tampones que disuelven porciones importantes de la matriz11. Los métodos físicos (por ejemplo, congelación instantánea y agitación) pueden funcionar para preparar extractos de matriz a partir de tejidos con una estructura en capas tal como la dermis (por ejemplo, SIS, BSM)29 pero no son útiles para órganos con estructuras tisulares complejas como el hígado. Por el contrario, nuestro método para obtener andamios de biomatriz dio como resultado la pérdida de la mayoría de las proteínas celulares pero conservó esencialmente todos o al menos la mayoría de los colágenos y los componentes asociados al colágeno, que incluyen citocinas, hormonas y factores de crecimiento unidos a la matriz.
La matriz extracelular está embebida en una bicapa lipídica en mosaico, que incluso en el organismo más simple es un ambiente complejo, heterogéneo y dinámico. El método de deslipidación es una faceta crítica del protocolo. Los métodos usados comúnmente para la descelularización de tejidos implican detergentes iónicos tales como SDC y dodecilsulfato sódico (SDS). El SDC es relativamente más suave que el SDS, tiende a causar menos alteraciones en la arquitectura del tejido nativo y es menos efectivo para solubilizar las membranas celulares citoplasmáticas y nucleares30. No existen informes de descelularización tisular con el uso de SDC solo. Muchos estudios han hecho uso de un detergente fuerte no iónico (por ejemplo, Triton X-100)31 o detergentes zwitteriónicos (por ejemplo, 3-(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato, CHAPS)32 Por el contrario, nuestro método donde se usa una combinación de SDC y PLA2 logra la deslipidación del tejido rápida y suavemente.
Hasta el momento se han identificado al menos veintinueve tipos de colágenos (I-XXIX) en vertebrados con funciones funcionales en la adhesión celular, la diferenciación, el crecimiento, el desarrollo de tejidos y la integridad estructural3334. Se conoce que los principales componentes estructurales de la matriz, los colágenos, permanecen insolubles en altas concentraciones de sales y a pH neutro3536, hallazgo que es la base de nuestra estrategia en la preparación de andamios de biomatriz. La estrategia tiene las ventajas añadidas de que los colágenos permiten la preservación de los componentes de la matriz unidos a ellos, tales como lamininas y fibronectinas (FN), proteoglicanos ricos en leucina (PG) y GAG que a su vez preservan las citocinas, factores de crecimiento o receptores de la superficie celular que están unidos a ellos.
Los andamios de biomatriz son únicos en su gran capacidad para inducir una diferenciación rápida y consistente de las células madre/progenitoras tales como hHpSC a destinos adultos y para mantener aquellas células restringidas a un linaje y para mantener aquellas células restringidas a un linaje o también para mantener células adultas sembradas en los andamios, como células viables y plenamente funcionales durante muchas semanas (> 8 semanas).
La diferenciación de células madre, tales como células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS) o diversas formas de células madre mesenquimales (MSC) en tipos de células hepáticas completamente maduras, requiere múltiples conjuntos de señales (solubles y de matriz) presentadas en etapas, se requiere la inducción de cebado por un conjunto para responder a un conjunto diferente, y puede tomar muchas semanas, hasta 6 semanas de cultivo, para generar células que tengan el destino del hígado adulto37. Además, la restricción del linaje de las MSC a los destinos hepáticos produce resultados inconsistentes con células adultas que tienen fenotipos mezclados de hepatocitos y MSC. La diferenciación de las células ES, las células iPS y las MSC da como resultado células similares a los hepatocitos que expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes específicos del hígado; con variabilidad en la que se observan los genes; y los niveles de proteína para los genes hepáticos expresados suelen ser bajos 40 o altos para un gen hepático e insignificante para otros41.42 Por el contrario, la diferenciación de las hHpSC en los andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las células expresaron un fenotipo adulto clásico y con actividades de urea, albúmina y CYP450 a niveles casi normales después de una semana en cultivo.
Las células similares a hepatocitos a partir de cualquiera de estos precursores y diferenciadas mediante otros protocolos distintos a los andamios de biomatriz, expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes específicos del hígado, con variabilidad en los genes que se observan y con niveles de proteína para los genes hepáticos generalmente más bajos o altos para un gen hepático e insignificantes para otros. Por razones desconocidas, los resultados son diferentes de preparación en preparación. Se espera que la utilización de los andamios de biomatriz de esta invención dé como resultado una diferenciación más rápida de estas poblaciones de células madre y con mayor consistencia en el logro de células con un fenotipo adulto estable.
La diferenciación de determinadas poblaciones de células madre, tales como hHpSC en andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las células expresan un repertorio clásico de genes adultos y con actividades de urea, albúmina, y CYP450 a niveles casi normales en 1 a 2 semanas en cultivo y con estabilidad de ese fenotipo durante muchas semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de la presente invención tienen el potencial de facilitar en gran medida la diferenciación de determinadas poblaciones de células madre a un fenotipo hepático adulto.
La capacidad de diferenciar las células madre en los andamios de biomatriz para lograr células y tejidos maduros y funcionales ofrece oportunidades considerables para los programas académicos, industriales y clínicos que permiten el uso de tipos de células bien diferenciadas para cada tipo de estudio analítico y, lo más emocionante, permite la generación de tejidos o incluso órganos implantables, revascularizados que pudieran usarse para la investigación básica y programas clínicos.
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Ejemplo 2. Métodos para la dispersión a escala industrial de andamios de biomatriz.
En GigaCyte, LLC (Branford, CT) se desarrollaron métodos adicionales para dispersar los andamios de biomatriz sobre placas después de la pulverización. Ellos pueden usarse con andamios de biomatriz a partir de cualquier tejido, que incluye los grandes mamíferos (por ejemplo, tejidos humanos, porcinos y bovinos, etcétera). Los tejidos de cerdo y bovino se obtuvieron de una instalación de procesamiento de carne certificada por el USDA, se transportaron en RPMI 1640). Este medio puede ser cualquier medio con una composición que imite los constituyentes del líquido intersticial y con una osmolalidad que esté en el intervalo de 250-350 mOsm/Kg. A continuación, los tejidos se procesan como se describe en la presente descripción para generar andamios de biomatriz.
Estos métodos incluyen el procesamiento adicional de los andamios de biomatriz para la reducción a partículas de tamaño μm en suspensión para recubrir placas mediante el uso de automatización. En un ejemplo no limitante, el proceso incluye la homogeneización del andamio de biomatriz en una solución con alto contenido de sales para garantizar que los colágenos permanezcan insolubles. Se añade un tampón de deslipidación modificado que comprende 36 unidades/l de fosfolipasa A2 más desoxicolato de sodio al 1 % y el inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml en una relación de tampón: homogeneizado de 1:1, lo que da como resultado un ascenso del material de la biomatriz flotante hacia la parte superior donde se recoge para su posterior procesamiento. El material de la biomatriz se procesa adicionalmente para eliminar el tampón de deslipidación y se lava con una solución de nucleasa para eliminar las nucleasas: ARNasa 5 mg/l00 ml, ADNasa 1 mg/l00 ml y el inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml. Después, el material de la biomatriz se procesa adicionalmente en un tampón con alto contenido de sales (NaCl > 3,4 M) para garantizar la eliminación de todos los residuos, mantener los colágenos insolubles y también para minimizar la actividad de la proteasa. El material de la biomatriz se procesa adicionalmente para eliminar la alta concentración de sales y prepararse para la reducción del tamaño de las partículas tras lavar el material de la biomatriz en un medio basal que contiene antimicrobianos/antimicóticos, gentamicina y tampón HEPES. Después, el material de la biomatriz se procesa adicionalmente para reducir el tamaño de partícula del material de la biomatriz a partículas de tamaño μm (intervalo 1-100 μm) en suspensión, en cualquier dilución, óptimamente a 1:6, en medio basal que contiene antimicrobianos/antimicóticos, gentamicina y tampón HEPES, se congela a -80 °C y después se pulveriza por trituración criogénica. Si la biomatriz no se diluye antes de triturar, la matriz es demasiado grumosa para recubrir las placas de manera uniforme. Esta es una etapa clave para permitir la trituración e incluso el recubrimiento de las placas. Las partículas de la biomatriz pueden estar en suspensión a cualquier dilución, pero de manera óptima 1:6. Las partículas de la biomatriz se descongelan y recubren sobre placas que se usan para la diferenciación de células madre. Las partículas de la biomatriz pueden diluirse adicionalmente a cualquier dilución, de manera óptima 1:24 en un medio basal que contiene antimicrobianos/antimicóticos, gentamicina y tampón HEPES y pueden recubrirse en placas usadas para el mantenimiento a largo plazo de células primarias recién aisladas, criopreservadas o tipos de células derivadas de células madre diferenciadas terminalmente o para diferenciar cualquier fuente de células madre en hepatocitos. La esterilización de las placas recubiertas con biomatriz puede realizarse, por ejemplo, con radiación gamma (5000 rads) y almacenarse a 4oC (o congelado a -80oC) hasta su uso. La siembra de células en la biomatriz no requiere un medio que contenga suero para la unión, pero puede usarse un medio que contenga suero para aplicar las células a la biomatriz. La composición de las partículas de la biomatriz de cualquier tejido puede usarse para recubrir placas y otros aparatos.
Como otro ejemplo, la presente invención proporciona un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico para su dispersión a escala industrial en aparatos de cultivo, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con cualquiera de los métodos de esta invención como se describe en la presente descripción, b) diluir el andamio de biomatriz de (a) en medio basal; c) congelar el andamio de biomatriz de (b) a aproximadamente -80 °C; d) pulverizar el andamio de biomatriz de (c) mediante trituración criogénica en partículas de la biomatriz que varían en tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 100 μm (por ejemplo, aproximadamente 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm, 110 μm, 120 μm, 150 μm, 200 μm, etcétera); e) descongelar las partículas de la biomatriz de (d) en suspensión en medio basal; y f) dispersar las partículas de la biomatriz de la etapa (e) en un aparato de cultivo, de esta manera se produce un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico para la dispersión a escala industrial en un aparato de cultivo. En algunas modalidades, este método puede comprender además la etapa de esterilizar las partículas de la biomatriz, que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante radiación gamma.
En algunas modalidades de los métodos descritos anteriormente, el andamio de biomatriz de la etapa (b) puede diluirse en una relación de aproximadamente 1:6 (por ejemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, etcétera) en medio basal. En algunas modalidades, las partículas de la biomatriz de la etapa (e) pueden diluirse a aproximadamente 1:24 (por ejemplo, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27: 1:28, 1:29, 1:30, etcétera) en medio basal.
Resumen del protocolo ilustrativo usado para el inhibidor de tripsina de soja 1000x de hígado adulto
• Concentración final 0,1 mg/ml
Solución de transporte de tejidos
• Medio basal tal como RPMI 1640 o solución salina tamponada con fosfato con calcio y magnesio
• Solución de antibiótico/antimicótico 100 x (Gibco núm. 15240-112)
• Gentamicina (25 ug/ml) (Gibco núm. 15710-072)
Solución 1: Solución de mezcla de tejidos
• NaCl 3,4 M
• Inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml (Gibco núm. 17075-029)
Solución 2: Solución de deslipidación
• Una mezcla de la Solución 1 con PBS 1:1 (w/Ca y Mg); relaciones alternativas de 1:2, 1:3, 1:4) o alternativamente un medio basal tal como RPMI 1640
• Desoxicolato de sodio 0,1% (Sigma D6750-100g)
• Fosfolipasa A236 u/l (Sigma P9279-25 mg)
• Inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml (Gibco núm. 17075-029)
Solución 3: Solución de nucleasa
• Medio basal tal como RPMI 1640
• ARNasa 5 mg/l00ml (Sigma R6513-1g)
• ADNasa 1 mg/l00ml (DN25-1g)
• Inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml
Solución 4: Solución con alto contenido de sales
• 3. M NaCl
Solución 5: Solución de eliminación de sales y trituración
• EdeWilliam
• Antibiótico/antimicótico (100 x)
• Gentamicina (30 ug/ml)
Etapas en el proceso de aislamiento de la biomatriz para órganos grandes
1. Homogeneización de tejidos en alto contenido de sales
2. Descelularización y Deslipidación
3. Eliminación de nucleasa
4. Lavado con alto contenido de sales
5. Eliminación de sales
6. Reducción del tamaño de partículas de la biomatriz
7. Placas de recubrimiento con biomatriz
Proceso de aislamiento de la biomatriz
1.0 Adquisición de tejidos
1.1 Obtener tejido de órganos a partir de una instalación certificada e inspeccionada por el USDA
1.2 Transporte de tejido de órganos desde las instalaciones del USDA hasta el laboratorio de GigaCyte en un contenedor de plástico en la solución de transporte de tejidos
1.3 Preparar el tejido para perfusión u homogeneización
1.3.1 Se prefiere la homogeneización para la aplicación in vitro en placas de pocillos múltiples
2.0 Homogeneización de tejidos
2.1 Asépticamente, corte el tejido en piezas pequeñas (~3 x 3 cm) con bisturí núm. 22 y colóquelo en la solución de transporte de tejidos para eliminar la sangre
2.2 Enjuague las piezas de tejido 3-4 veces en la solución de transporte de tejidos para eliminar la mayor cantidad de sangre posible
2.3 Homogeneice ~ 400 g de tejido en el mismo volumen de la Solución 1 hasta que la mezcla sea homogénea (~ 3-5 minutos)
2.4 Vierta la solución de tejido homogeneizado en una botella giratoria de 2 l para la descelularización 2.5 Repita para todo el lote de piezas de tejido
3.0 Descelularización y deslipidación
3.1 Añada un volumen igual de la Solución 2 al tejido homogeneizado en una botella giratoria
3.2 Mezcle bien tras invertir la botella varias veces y después deje reposar durante 15-30 minutos.
3.3 El material de la matriz flotante subirá a la parte superior lo que crea una clara separación del material de la matriz ligera encima de la solución coloreada de hígado.
3.4 Retirar con pipeta el material de matriz flotante y transferir a otro frasco tipo rodillo
3.5 Matriz del conjunto de múltiples homogeneizaciones
3.6 Transfiera ~ 375 ml del material de matriz a una botella de centrífuga de 750 ml, añada el mismo volumen de la Solución 2 a cada botella y agite enérgicamente durante ~ 1 minuto para garantizar una descelularización y deslipidación completas
3.7 Sedimente por centrifugación a alta velocidad (3750 RPM) durante 10 minutos, después elimine el sobrenadante
3.8 Repita este proceso 1 vez más (2 veces en total)
4.0 Eliminación de nucleasas
4.1 Elimine el sobrenadante después del lavado de descelularización final, tenga cuidado de no perturbar el sedimento de biomatriz
4.2 Añada el mismo volumen de la Solución 3 a cada botella y agite vigorosamente durante ~ 1 minuto para garantizar que todo el material esté en suspensión y la eliminación completa de las nucleasas
4.3 Sedimente por centrifugación a alta velocidad (3750 RPM) durante 10 minutos, después elimine el sobrenadante
4.4 Repita este proceso 1 vez más. (2 veces en total)
5.0 Lavado con alto contenido de sales
5.1 Elimine el sobrenadante después del lavado final con nucleasa, tenga cuidado de no perturbar el sedimento de biomatriz
5.2 Añada un volumen igual de la Solución 4 a cada botella y agite vigorosamente, tenga cuidado de asegurarse de que todo el material esté en suspensión.
5.3 Sedimente por centrifugación a alta velocidad (3750 RPM) durante 10 minutos, después elimine el sobrenadante
5.3.1 En esta fase la biomatriz no sedimenta bien y flota después de la centrifugación.
5.3.2 Pipetee el sobrenadante y páselo por un filtro de nailon para recoger el material flotante
5.3.3 Regrese la matriz flotante recogida a la botella de centrífuga
5.4 Repita este proceso al menos 2 veces antes de detenerse
5.4.1 El sobrenadante tiene un color entre tostado y claro después del lavado final con sales
5.5 Después del 2do lavado con alto contenido de sales es un buen punto de parada si es tarde en el día. 5.6 Vierta el contenido de todas las botellas de centrífuga en una botella rotatoria y rellene con la Solución 4, después coloque la biomatriz a 4 °C durante la noche.
5.7 Al día siguiente continúe con los lavados de sales restantes
5.8 Agite vigorosamente la botella de biomatriz para mezclar bien el material de la biomatriz, después transfiera la biomatriz a las botellas de centrífuga y continúe con 3-4 lavados más con sales
5.9 Condense la biomatriz en la menor cantidad posible de botellas tras llenar cada una hasta la mitad como máximo para permitir los lavados con sales
6.0 Eliminación de las sales
6.1 Elimine el sobrenadante después del lavado final con sales, tenga cuidado de no perturbar el sedimento de biomatriz
6.2 Añada un volumen igual de la Solución 5 y agite vigorosamente para asegurarse de que todo el material de la biomatriz esté en suspensión
6.3 Sedimente por centrifugación a alta velocidad (3750 RPM) durante 10 minutos
6.4 Elimine el sobrenadante y añada un volumen igual de la Solución 5 y después agite vigorosamente. 6.5 Repita 2 veces (3 veces en total) para asegurarse de que el sobrenadante sea claro
6.5.1 La biomatriz sedimentará mejor con cada centrifugado
6.5.2 El sobrenadante debe ser claro sin ningún color después del lavado final
6.6 Después del lavado final con la Solución 5, registre el volumen de gránulos de matriz de cada botella 6.7 Transfiera y agrupe todos los gránulos de biomatriz en una nueva botella giratoria
6.8 Mida el volumen del material de la biomatriz
6.9 Diluya la biomatriz agrupada 1:6 con la Solución 5
6.9.1 Calcule la cantidad de la Solución 5 requerida
6.9.1.1 Ejemplo: Biomatriz de 200 ml * 6 = 1200
6.9.1.2 Añada 1 l de la Solución 5 a 200 ml de biomatriz para una suspensión de biomatriz 1:6
6.10 Alicuote 30 ml de suspensión de biomatriz 1:6 en bolsas de congelación etiquetadas previamente 6.11 Congele bolsas de biomatriz a -80 °C y almacene hasta la trituración
6.12 Prepare la "hoja de datos de trituración del lote de biomatriz" para el nuevo lote de biomatriz
6.12.1 Registre el número de bolsas producidas a partir de este nuevo lote
6.12.2 Cada bolsa es una trituración separada del mismo lote
6.13 El material de la biomatriz producido a partir de este lote se considera un lote
6.14 Asignar número de lote al lote
7.0 Reducción del tamaño de partículas de la biomatriz
7.1 Prepare el molino (Spex Sample Prep 6870) con LN2 y la cámara de trituración enfriada
7.2 Elimine la bolsa de la biomatriz congelada del congelador
7.3 Rompa en pedazos pequeños
7.4 Transfiera las piezas de biomatriz congeladas a la cámara del trituración enfriada previamente
7.52 corridas de trituración (una corrida es de 12 * 2 minutos de trituración, cada una seguida de 2 minutos de enfriamiento) 48 minutos cada una en criomolino
7.6 Transfiera la biomatriz triturada a una botella de 100 ml marcada previamente con el número de lote y el número de la bolsa (el número de la bolsa identifica la fecha de la trituración)
7.7 Mantenga congelado a -80 °C hasta que esté listo para recubrir las placas
8.0 Prepare la biomatriz para placas de recubrimiento
8.1 Descongele una botella de biomatriz por el método de descongelación rápida en baño de agua a 37 °C 8.2 Mida la suspensión de la biomatriz descongelada (debe ser ~30 ml ± 2 ml)
8.3 Diluya a 1:24 con la Solución 5 (véase la Figura 17)
8.3.1 Calcule el volumen de la Solución 5 para añadir a la suspensión de la biomatriz 1:6
8.3.1.1 Multiplique el volumen de suspensión de biomatriz * 3
8.3.1.2 Añada ese volumen a la suspensión 1:6 para una dilución 1:24
8.4 Recubra las placas inmediatamente (si se deja que la biomatriz diluida fragüe dará como resultado la formación de grumos)
9.0 Placas de recubrimiento con biomatriz
9.1 Determine el número de placas a recubrir. Consulte la Tabla 8 para los volúmenes de siembra
• Retire asépticamente las placas del empaque y organizarlas en la campana de flujo laminar
• Transfiera el volumen apropiado de la suspensión de biomatriz en cada pocillo mediante el uso de una pipeta multicanal cuando sea apropiado. Consulte la Tabla 1 para el volumen de siembra
• Asegurar que la suspensión esté uniformemente distribuida en el pocillo, si es necesario, golpee suavemente la placa pero no la retire de la superficie plana de la campana.
• Dejar que las placas permanezcan en reposo durante la noche
• La primera acción a realizar el día siguiente es eliminar la solución de cada pocillo
o Manipule las placas con cuidado para que no se altere el recubrimiento de la matriz.
o Incline la placa hacia usted sin quitar el borde de la placa de la superficie de la campana. Esto estabiliza la placa para evitar movimientos bruscos que produzcan que la biomatriz salga de la placa o Mediante el uso de un aparato de succión con pipeta de punta fina, aspire toda la solución de cada pocillo. ¡NO TOQUE LA SUPERFICIE DE LA MATRIZ CON LA PIPETA!!!
o Vuelva a colocar suavemente la placa, retire la tapa y deje que se seque por completo (~ 2 horas) ■ Mover la placa mientras está húmeda altera el recubrimiento de la biomatriz ■ No mueva las placas hasta que la matriz esté seca
o Cuando esté completamente seca, vuelva a colocar la tapa y examine la calidad
o Coloque las placas que tengan un recubrimiento liso en la bolsa para placas
o Selle la bolsa y aplique la etiqueta
o Esterilice por radiación gamma (5000 rads)
o Almacene las placas recubiertas a 4 °C
o Envíe las placas recubiertas en paquetes de 5 en bolsa de hielo
10.0 Uso de placas de biomatriz
10.1 Retire la placa del empaque asépticamente y colóquela en un gabinete de seguridad biológica 10.2 Añada medio a cada pocillo y colóquelo en la incubadora durante al menos 2 horas antes de su uso 10.3 Cuando esté listo para sembrar las células, elimine el medio de rehidratación y lave una vez con medio de cultivo de tejidos.
10.4 Añada las células
Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no debe interpretarse como una limitante de esta. La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones, donde se incluyen los equivalentes de las reivindicaciones.
T l 1: In rv l n nr i n m l r N l r l l n i I-V.
Figure imgf000030_0001
Sage (1980) Structurally Distinct Collagen Types. Annual Review of
Figure imgf000031_0001
______________________________________________________
Estos datos son representativos de las condiciones para la insolubilidad de los tipos de colágenos. Se deben identificar los tipos de colágeno dentro de un tejido y después usar la concentración de sal más alta identificada para esos colágenos en el tejido y como la de los tampones usados para preparar los andamios de biomatriz. Por ejemplo, para la piel, se usaría un tampón a pH neutro y con una concentración de sal de 4,0 M, una concentración de sal que mantendría insolubles a los colágenos tipo I y III. Por el contrario, para la placenta, se usaría un tampón a pH neutro y sal a 4,5 M para mantener insoluble tanto al colágeno tipo IV como el tipo V.
Los tipos de colágenos presentes en un tejido son distintos en las diferentes edades de un huésped. Por ejemplo, los hígados fetales tienen niveles altos de colágenos tipo III, IV y V (que requieren concentraciones de sal superiores a 4,0 M), mientras que los hígados adultos tienen una mezcla de colágenos tipo I, III, IV, V, VI y XVIII (que requieren concentraciones de sal más bajas). Por lo tanto, la concentración de sal necesaria para la preparación de un andamio de biomatriz está dictada por el repertorio de colágenos que son dominantes en el tejido. Ver la referencia 23 del Ejemplo 1 para más detalles.
Figure imgf000032_0001
Tabla 3. Análisis de factores de crecimiento unidos a los andamios de biomatriz de conducto biliar
Figure imgf000033_0001
Tabla 4. Anticuerpos usados
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Tabla 6. Análisis de factor de crecimiento unido a andamios de biomatriz de hígado
Figure imgf000036_0002
Tabla 7. Proiedades de las células madre heáticas humanas hHSC desués del aislamiento en cultivo
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
T l . Vl mn imr i m riz r l ili mlil
Figure imgf000037_0002

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico seleccionado del grupo que consiste en pulmón, tiroides, piel, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón o intestinos para la dispersión a escala industrial en aparatos de cultivo, que comprende:
a) perfundir el tejido biológico u homogeneizar el tejido biológico con un tampón que comprende una concentración de sales de aproximadamente NaCl 3,5 M a aproximadamente NaCl 4,5 M; después b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón de deslipidación que comprende fosfolipasa A2 y desoxicolato de sodio en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y está a pH neutro; después
c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a pH neutro y que comprende una concentración de sales de aproximadamente NaCl 2,0 M a aproximadamente NaCl 5,0 M, concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con ARNasa y ADNasa en un tampón; y después
e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que tiene un pH neutro, no contiene suero y tiene una osomolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de esta manera se produce un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos el 95 % de los colágenos y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico;
f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal;
g) congelar el andamio de biomatriz de (f) a aproximadamente -80 °C;
h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituración criogénica en partículas de biomatriz que varían en tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 100 μm;
i) descongelar las partículas de biomatriz de (h) en suspensión en medio basal; y j) dispersar las partículas de biomatriz de la etapa (i) en un aparato de cultivo,
de esta manera se produce un andamio de biomatriz de tejido biológico para la dispersión a escala industrial en aparatos de cultivo.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de esterilizar el andamio de biomatriz.
3. El método de la reivindicación 2, en donde la etapa de esterilización se lleva a cabo mediante radiación gamma.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el andamio de biomatriz de (f) se diluye en una relación de aproximadamente 1:6 en el medio basal.
5. El método de la reivindicación 1, en donde las partículas de la biomatriz de (i) se diluyen en una relación de aproximadamente 1:24 en el medio basal.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el primer medio comprende sales, minerales, aminoácidos, vitaminas y azúcares.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el primer medio es un medio basal
8. El método de la reivindicación 7, en donde el medio basal se selecciona del grupo que consiste en RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, medio de Waymouth y de William.
9. El método de la reivindicación 1, en donde el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el líquido intersticial.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el tampón de deslipidación de la etapa (b) comprende de aproximadamente 20 unidades/l a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y desoxicolato de sodio aproximadamente al 1 % en el primer medio.
11. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de sales del tampón de la etapa (c) es de aproximadamente NaCl 3,4 M a aproximadamente NaCl 3,5 M cuando se usa para la preparación de andamios a partir de un hígado adulto y es de aproximadamente NaCl 4,0 M a aproximadamente NaCl 4,5 M cuando se usa para la preparación de andamios a partir de un hígado fetal.
12. El método de la reivindicación 1, en donde el tampón de la etapa (c) comprende además un inhibidor de proteasa.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
14. El método de la reivindicación 1, en donde el tampón de la etapa (d) comprende además un inhibidor de proteasa.
15. El método de la reivindicación 13, en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
16. El método de la reivindicación 1, en donde todos los medios y tampones de las etapas (a) a la (e) no contienen una cantidad detectable de una enzima que degrada los componentes de la matriz extracelular.
17. El método de la reivindicación 1, en donde el tejido biológico es de un mamífero.
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