CN108753686B - 组织工程肝脏模型、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程肝脏模型、构建方法及其应用。该组织工程肝脏模型是用肝样种子细胞对去细胞的肝脏生物基质支架循环灌注，进行再细胞化，得到组织工程肝脏模型。该组织工程肝脏模型包括组织工程肝脏器官模型可用于大量未知肝毒性药物、中草药、化合物、化学品、化妆品等的安全性评测中，提高筛选的准确性，甚至再血管化完全的组织工程肝脏器官模型可直接用于人源化肝脏小鼠的移植、肝衰竭患者肝脏移植等方面，为移植提供有功能的肝脏替代物，应用前景广阔；还包括组织工程肝脏疾病模型，可用于对已知肝毒性药物的毒性机制研究中。

Description

组织工程肝脏模型、其构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及组织化培养模型及其构建方法，特别涉及一种三维组织工程肝脏器官模型、组织工程肝脏疾病模型及其构建方法与其的应用。

背景技术

肝脏在药物(或外源性毒物)的代谢和处置中起着十分重要的作用，大多数药物和毒物在肝内经生物转化作用而排出体外。药物诱导的肝损伤(Drug-Induced LiverInjury，DILI)是导致肝功能障碍的最常见原因，也常导致药物研发失败，以及药物上市后被撤回或使用限制。此外，化妆品中重金属超标，新装修的房子甲醛超标，使用有毒的干洗剂四氯乙烯干洗衣物等都可能导致中毒性肝脏损伤。

肝脏是一种结构复杂及细胞排列有序性强的器官，是严重依赖结构的功能性组织。肝细胞是具有高度极性化的细胞，其极性是维持肝脏独特生理功能的基础，而传统二维培养的细胞呈平面生长，细胞因在培养条件下缺少细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的接触而丧失极性，因而丧失肝细胞功能。有证据表明肝细胞在体外2D普通培养中通过去分化或上皮-间质转化几天内即失去其形态和功能。

此外，药物代谢酶和药物转运体等与药物代谢相关的酶表达量及活性随培养时间延长而急剧降低，这些极大限制了二维培养的肝系细胞在药物安全性评价中的应用；而用于体内安全性评价的动物模型的价格昂贵，实验周期长，还涉及动物福利问题。并且对于化妆品的毒性检测，使用动物模型更是阻碍重重，在2013年，欧盟就禁止销售经过动物测试的化妆品。更为重要的是，由于药物代谢酶具有种属特异性，动物实验结果常无法准确预测临床人体反应。因此，开发建立一种高效、精确、可重复且廉价的体外培养体系用于药物、化妆品等安全性尤其是肝毒性实验和研究，具有重要的理论和应用意义。

体外培养体系可利用组织工程学的方法构建。组织工程是一种将工程学、材料学与生命科学的原则应用到开发生物代替物的前沿交叉学科，其核心内容是体外构建具有相应生物学功能的工程化组织。随着组织工程学科的发展，科学家们提出并逐渐完善了组织化培养技术(或称三维培养)，这种培养方法获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与单层培养均有明显差异，与体内细胞生长情况更为相似，而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的结构基础，又能为细胞生长提供物质基础，能够将组织化体外细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。

肝脏组织工程一直都是组织工程的热点研究方向，近数十年间构建精确的体外人肝脏模型已成为本领域研究人员的研究目标。目前大多数关于肝脏的研究使用的都是啮齿类或其它(如食蟹猴)动物的肝脏构建的模型，如对非酒精性脂肪性肝病发展机制的研究主要依赖于实验动物，范围从遗传肥胖的Zucker大鼠，Ossabaw小型猪的模型，到高脂饮食的兔子和小鼠模型等，都是利用自身遗传、或外界干预造成的动物体内肝脏病变而构建的模型，并非体外模型，且这些模型已被证明不足以完全体现人体肝脏毒理学或病理生理学的特性，因此需要构建功能更优越、更接近人体肝脏的人肝细胞体外模型。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种组织工程肝脏模型，包括组织工程肝脏器官模型和组织工程肝脏疾病模型，疾病包括非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病(如Gilbert综合征、Crigler-Najjar综合征、Wilson病等)、病毒性肝炎(如HCV、HBV及各种嗜肝病毒的感染)等，是用肝样种子细胞对去细胞的肝脏生物基质支架循环灌注，进行再细胞化，得到组织工程肝脏模型。

所述肝样种子细胞选自肝细胞、肝样细胞和肝相关细胞中的一种或多种，肝样种子细胞来源于人或动物，优选来源于人。

所述肝细胞为普通二维(2D)培养的肝细胞(如HepaRG、HepG2、LO2、Huh7细胞等)或原代分离的肝细胞，优选为HepaRG细胞、HepG2细胞；所述肝样细胞可为干细胞来源的肝样细胞(如hES细胞)或自体来源的iPSC诱导的肝样细胞，优选为自体来源的iPSC诱导的肝样细胞；所述肝相关细胞包括血管内皮细胞(如HUVEC细胞)、免疫细胞(如kuffer细胞等)、肝星状细胞等。

所述肝脏生物基质支架(LBS)为从肝脏中脱去细胞但保留肝脏细胞外基质(ECM)等成分的生物材料，即去细胞的肝脏，其保留了原始肝脏器官的总体外观和尺寸，颜色透明，含有大部分肝特异性ECM成分、基质结合细胞因子和生长因子。

所述组织工程肝脏疾病模型中的疾病包括非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病(如Gilbert综合征、Crigler-Najjar综合征、Wilson病等)、病毒性肝炎(如HCV、HBV及各种嗜肝病毒的感染)等。

本发明的第二个目的是提供上述组织工程肝脏模型的构建方法，包括肝脏生物基质支架的获得和对肝脏生物基质支架进行再细胞化；

优选的，所述肝脏生物基质支架用以下方法获得：将取自SD大鼠血液流尽的肝脏器官用含PLA2(含磷脂酶A2 72.2ng/mL，30-100ng/mL均可)的1％SDC溶液灌注至肝脏透明，洗尽肝脏中残留的SDC，得到去细胞的肝脏即为肝脏生物基质支架；具体为：雄性SD大鼠进行麻醉后，剪开腹腔，分离出肝脏门静脉，用导管插入门静脉作为灌注入口；灌注PBS，将血液从肝脏中移除；灌注含有36U/L的磷脂酶A的21％去氧胆酸钠溶液去除血浆和核膜，灌注直到肝组织变得透明；用3.4M NaCl缓冲液灌注30分钟，用PBS冲洗肝脏15分钟，然后用DNase和RNase灌注除去残余的核酸，得到肝脏生物基质支架粗品(LBS粗品)；用PBS冲洗LBS粗品除去残留的盐和核酸酶，保留肝中叶，所有血管结构完整，最后使用钴-60γ辐照器进行灭菌，得到肝脏生物基质支架(LBS)。

构建所述组织工程肝脏器官模型的方法中对肝脏生物基质支架进行再细胞化具体为：

对肝脏生物基质支架进行再细胞化：将肝脏生物基质支架用无血清的培养基以循环灌注至平衡后，用培养基将肝样种子细胞稀释至浓度为500-100000个细胞/mL，得到肝样种子细胞液，将肝样种子细胞液灌注至肝脏生物基质支架中；用培养基继续灌注进行换液培养，换液培养3-10天，得到组织工程肝脏器官模型。

本发明所提供的组织工程肝脏疾病模型的构建方法，与组织工程肝脏器官模型的构建方法的不同之处在于，所用培养基为高脂培养基，构建所述组织工程肝脏疾病模型的方法中对肝脏生物基质支架进行再细胞化具体为：

对肝脏生物基质支架进行再细胞化：将肝脏生物基质支架用无血清的培养基以循环灌注至平衡后，用培养基将肝样种子细胞稀释至浓度为500-100000个细胞/mL，得到肝样种子细胞液，将肝样种子细胞液灌注至肝脏生物基质支架中；用高脂培养基继续灌注进行换液培养，换液培养3-10天，得到组织工程肝脏疾病模型。

本发明的第三个目的是提供上述的组织工程肝脏模型中的组织工程肝脏器官模型在肝毒性相关物质的安全性评测中的应用，肝毒性相关物质包括中草药、化合物、化学品、化妆品、含甲醛样品、洗涤剂等；或在肝毒性药物的毒性机制评价中应用；或在构建人源化肝脏小鼠模型中的应用；或在制备肝脏移植过程中的肝脏替代物中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述的组织工程肝脏模型中的组织工程肝脏疾病模型在构建肝脏相关疾病模型中的应用；或在评价肝脏相关疾病的发病机理中应用；或在评价治疗和/或预防肝脏相关疾病药物有效性中的应用；或在治疗和/或预防肝脏相关疾病药物的药理学、体外机制及毒理学的评价中的应用；所述肝脏相关疾病包括非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病(如Gilbert综合征、Crigler-Najjar综合征、Wilson病等)、病毒性肝炎(如HCV、HBV及各种嗜肝病毒的感染)等。

本发明提供了一种组织工程肝脏模型及其构建方法与应用，该模型包括组织工程肝脏器官模型和组织工程肝脏疾病模型。本发明的组织工程肝脏模型是将肝细胞或肝样细胞或多种肝相关细胞与去细胞的肝脏生物基质支架在生物反应器中循环灌注培养得到的具有肝脏器官结构的体外培养体系。在该体外培养体系中细胞分散在支架内且成片生长、绒毛发达、细胞与细胞基质连接紧密，说明通过门静脉灌注细胞的再细胞化方式能够得到应用于以上方面的组织工程肝脏模型。肝脏生物基质支架良好的结构基础使得肝细胞的功能得到大大改善，如肝细胞的白蛋白、尿素合成等功能，并对肝细胞功能的发挥起着不可或缺的作用。

本发明提供的组织工程肝脏模型，包括组织工程肝脏器官模型和组织工程肝脏疾病模型。其中组织工程肝脏器官模型可用于大量未知肝毒性药物、中草药、化合物、化学品、化妆品、洗涤剂等的安全性评测，提高筛选的准确性，或用于对已知肝毒性药物的毒性机制研究，还可用于对已知肝毒性药物的毒性机制研究，甚至可直接移植到免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID小鼠)体内构建人源化肝脏小鼠模型，可能为移植有功能的肝脏替代物提供来源，为肝衰竭患者的肝脏移植提供理论和实验基础，应用前景广阔。组织工程肝脏疾病模型可用于研究肝脏疾病的发生与发展机制，或用于治疗肝病药物的药理学研究、药物开发和体外机制及毒理学的研究。

附图说明

图1为SD大鼠肝脏去细胞前、后的形貌照片；

图2为再细胞化的组织工程肝脏器官模型过程形态图；

图3为本发明组织工程肝脏器官模型HE染色的照片；

图4为组织工程肝脏器官模型中肝细胞分泌白蛋白和尿素的检测结果柱图；

图5为组织工程肝脏疾病模型中肝细胞的染色结果图；

图6为组织工程肝脏器官模型的药物代谢酶和药物转运体基因(肝功能相关基因)的表达水平柱图；

图7为肝毒性药物对组织工程肝脏器官模型中细胞毒性的检测结果曲线。

具体实施方式

本发明旨在利用组织工程学技术提供一种组织工程肝脏模型，包括组织工程肝脏器官模型和组织工程肝脏疾病模型。其中组织工程肝脏器官模型用于大量未知肝毒性药物、中草药、化合物、化学品、化妆品、洗涤剂等的安全性评测，提高筛选的准确性，或用于对已知肝毒性药物的毒性机制研究，或用于肝衰竭患者的肝脏移植，为移植有功能的肝脏替代物提供来源；组织工程肝脏疾病模型用于研究肝脏疾病的发生与发展机制，或用于治疗肝病药物的药理学研究、药物开发和体外机制及毒理学的研究。

组织工程中建立良好的组织化培养模型，包含三个重要因素，种子细胞、支架材料与微环境。具有良好的生物相容性支架材料是有效模拟细胞外基质、提供细胞体外构建三维组织模型的关键因素。人们不断探索使用不同的生物材料做支架，如纳米纤维支架、三维聚苯乙烯薄膜、多孔支架、胶原水凝胶支架、Matrigel等。

肝细胞在体外2D普通培养中通过去分化或上皮-间质转化几天内即失去其形态和功能说明微环境对维持肝细胞生长及功能起着非常重要的作用。构建组织工程肝脏模型的目的就在于尽可能地模拟肝细胞在体内的微环境，从而增强其在体外的分化功能。组织工程肝脏模型的构建需要种子细胞和支架材料。目前组织工程肝脏模型所用的支架材料主要有可降解高分子材料或天然基质材料，如PLGA、海藻酸钠、壳聚糖、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等。

“Development of complex-shaped liver multicellular spheroids as ahuman-based model for nanoparticle toxicity assessment in vitro”(MonikaDubiak-Szepietowska,2016)采用三种不同的水凝胶制备肝脏多细胞球体：即无生长因子和酚红的基质胶(Corning，荷兰)、猪皮肤来源的(Sigma)A型明胶和I型胶原蛋白(Sigma)的A型明胶。用DMEM制备1mg/mL的基质胶储备液，在接种细胞前以1：1的比例用细胞培养基稀释。将DMEM中10％明胶溶液(v/v)在37℃下孵育30分钟后用0.22μm孔径的注射器过滤器过滤，然后用1％(v/v)转谷氨酰胺酶(100μ/g，Ajinomoto)进行交联。通过混合DMEM和I型胶原溶液(10mg/ml，在0.1％乙酸中)获得胶原凝胶，并用1M NaOH(Sigma)将pH调节至7.4。将HepG2细胞与上述水凝胶混合，并在37℃下在细胞培养箱中培养。但此模型中使用的水凝胶支架材料成分均较为单一，难以模拟肝细胞在体内复杂的生长环境。

本发明提供的组织工程肝脏模型是在肝脏去细胞化的基础上进行的。肝脏去细胞化的研究使从整体器官通过表面活性剂灌注器官而获得组织特异性的细胞外基质成为可能。肝脏特异性的细胞外基质不仅仅给细胞提供支架，也调节了细胞的粘附、迁移、分化、增殖和存活进程，并且影响不同细胞间的作用。本发明的肝脏去细胞化方法与传统的去细胞方法不同，传统方法是将细胞组织浸入到不同的液体中获得去细胞的组织，而本发明的去细胞化方法是在整体肝脏器官中去细胞支架，但维持了整体的血管网络床(也称血管网络系统)，成为去细胞的肝脏生物基质支架。这些血管网络系统不仅为目标类型的细胞通过传统路径植入提供可能，也为植入的细胞提供了三维的生长环境。通过含氧培养基连续灌注，去细胞的肝脏生物基质支架不仅可以提供足够的空间使一定量的细胞种植到整个器官中，且细胞可以在没有氧气和养份限制的条件下在该环境中存活增殖并发挥自身的功能。本发明提供了肝细胞的自然微环境、循环灌注培养体系，以及去细胞的肝脏生物基质支架共同形成优异的肝细胞培养系统。在此基础上，本发明构建了组织工程肝脏模型，并可将其用于制备肝脏疾病模型，研究肝脏疾病的发生与发展机制；还可将其用于药理学研究、药物开发和曝露于体外的化合物的机制及毒理学研究，不但节约了成本和时间，还降低了药物开发和临床试验对人潜在的危害性；通过加入内皮细胞和肝实质细胞进行血管重建及再细胞化得到的完整的组织工程肝脏器官模型还可用于严重肝衰竭患者的肝脏移植，提供有功能的肝脏替代物。

本发明旨在提供一种介于微组织与体内之间的可用于器官水平研究的肝脏模型——组织工程肝脏模型。在模型构建中，需要重点解决两方面技术，一是有适合的支架材料，二是有适合的种子细胞，通过适当高效的方法，构建出能够重现复杂的生物和生物化学相关微环境，为肝细胞或肝样细胞提供更接近于体内细胞的微环境，提高肝细胞或肝样细胞的功能，使其成为适用于药物、中草药、化合物、化学品、化妆品等物质的肝毒性安全性评测筛选的组织工程肝脏模型。

常规可选用的支架生物材料，如纳米纤维支架、三维聚苯乙烯薄膜、多孔支架、胶原水凝胶支架、Matrigel等难以构建复杂的生物和生物化学相关微环境。发明人分析得知：细胞外基质(ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质的主要成分包括纤维蛋白、整合素蛋白、多糖类、金属基质蛋白酶等。由于去细胞的肝脏生物基质支架维持了完整的血管网络床，因此肝脏生物基质支架能作为一种特殊的天然生物支架材料，适于在体外培养中为细胞提供良好的微环境，提高细胞的功能，使体外培养的细胞状态更接近体内。

发明人努力寻找适于作为肝细胞模型的骨架材料的细胞外基质，最终发现，专利公开号US008802081B2提供了一种成熟的去细胞化方法，是从新鲜肝脏中脱去细胞保留肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分。发明人尝试以该文献方法获得的生物材料作为本发明组织工程肝脏模型构建中的肝脏生物基质支架(Liver BiomatrixScaffold,LBS)，并使用肝脏实质细胞和非实质细胞进行再细胞化，获得去细胞的肝脏生物基质支架，并确证其是天然生物材料，含有大部分肝特异性ECM成分、基质结合细胞因子和生长因子，并保留了完整的血管网络。当将正常的成年大鼠或人肝细胞接种在肝脏生物基质支架上时，成体实质细胞(是指具有肝功能的细胞，正常的成年大鼠或人的肝细胞)能够快速附着于LBS，并能在肝脏生物基质支架上保持其活力和功能超过8周。因此，本发明中，选择去细胞的肝脏生物基质支架作为组织工程肝脏模型的支架材料。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、获得肝脏生物基质支架(LBS)

肝脏生物基质支架(LBS)的获得方法参照US008802081B2。具体实验可包括以下步骤：

1.先将雄性SD大鼠(180-220g)腹腔注射氯胺酮-甲苯噻嗪进行麻醉，随后剪开腹腔，分离出肝脏门静脉，用22号导管(383407，BD，USA)插入门静脉以提供灌注入口。

2.灌注PBS(磷酸盐缓冲液)15分钟，将血液从肝脏中移除。

3.用含有36U/L的磷脂酶A的21％去氧胆酸钠(Fisher，Pittsburgh，PA，USA)溶液去除血浆和核膜，灌注约30分钟至1小时或直到肝组织变得透明。

4.用3.4M NaCl缓冲液灌注30分钟，用PBS冲洗肝脏15分钟以除去之前的缓冲液，然后用100mL DNase(1mg/100mL；Fisher)和RNase(5mg/100mL；Sigma Aldrich)灌注以除去任何残余的核酸，得到肝脏生物基质支架粗品(LBS粗品)。

5.用PBS冲洗LBS粗品1小时，以除去任何残留的盐和核酸酶，保留肝中叶，所有血管结构完整，重约3克左右；最后使用钴-60γ辐照器(军事医学院辐射中心，北京)使用1.5Mradγ辐射剂量对进行灭菌，得到肝脏生物基质支架(LBS)。

SD大鼠肝脏去细胞前、后的形貌如图1所示，经过数小时的序贯PLA2/SDC溶液、3.4M高盐溶液灌注并经PBS液体洗涤后，可见大鼠肝脏的颜色由红色逐渐变化黄色、白色，最后变为透明色(分别见图1的A幅-D幅)，整个过程呈均匀去细胞化，没有观察到未去细胞的组织或细胞残存。大体上肝脏细胞及血液等其他细胞经灌注后基本消失殆尽，只留下无色或白色的细胞外基质成分。肉眼观察肝脏包膜保留完整，脉管结构清晰，灌注过程中没有管道漏或肝脏破裂的情况(见D幅)，表明原位序列灌注的方法能有效去除肝脏的细胞，保留细胞外基质。

以上为参照US008802081B2方法实施的实验操作。商业使用时，可对符合相关规定来源的肝脏做去细胞处理来获得肝脏生物基质支架(LBS)材料。

利用蛋白质组学的方法对LBS进行测定，确证其中还保留有基质结合细胞因子和生长因子(包括转录辅助调节因子hcfc1，膜联蛋白家族等)，表明LBS还可以为细胞提供更接近于体内的微环境。

实施例2、用肝样细胞构建组织工程肝脏器官模型——用于肝脏替代物、药物评价、体外肝功能研究模型

本实施例利用hESCs或iPSCs来源的肝样细胞对去细胞肝脏生物基质支架进行再细胞化构建组织工程肝脏器官模型。人的胚胎干细胞(human embryonic stem cells，

hESCs)由于具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，能在体内、外被诱导分化为机体内几乎所有的细胞类型，因此成为构建体外组织工程肝脏器官模型的理想种子细胞。人的诱导多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells，iPSCs)，采用不同的诱导分化方案，将其诱导分化成肝样细胞。这些诱导分化来的细胞具有肝细胞相似的形态及肝细胞的功能，因此也可作为构建体外组织工程肝脏器官模型的种子细胞。

1)将肝脏生物基质支架(用实施例1方法得到)用无血清肝细胞培养基(HM，Gibco)以3ml/min开始循环灌注，进行过夜预处理。

2)取对数生长期的基质胶(matrigel，BD 354230)上培养的hES或iPSCs来源的肝样细胞，用TrypLE(Gibco)37℃消化10-20min，37℃消化7min，加入人胚胎干细胞培养基(mTeSR，Stemcell)终止消化，用lml枪头轻轻刮吹克隆，将细胞吹打至脱落，收集至离心管中，离心后弃上清用HM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，用HM培养基将hES或iPSCs来源的肝样细胞稀释至浓度为10000个细胞/mL(500-100000个细胞/mL均可)，得到肝样细胞液；

3)步骤2)得到的hES或iPSCs来源的肝样细胞的再细胞化：将步骤2)得到的肝样细胞液以9ml/min分3次灌注至每个肝脏生物基质支架中，总共灌注3000万个肝样细胞，灌注速率是基于成年大鼠静止期间肝脏血流速度(85mL/min/Kg)选择的。

4)再细胞化完成后一天，开始每天用HM培养基继续灌注进行换液培养，7天换液培养后完成了组织工程肝脏器官模型的构建。

本实施例使用hESCs或iPSCs来源的肝样细胞构建组织工程肝脏器官模型，其优势为hESCs或iPSCs是具有高度自我更新和分化潜能的干细胞，应用不同细胞因子组合诱导分化为人肝细胞样细胞，获得的细胞具有成熟肝细胞相似的功能，如糖原储存、尿素合成、白蛋白分泌等，也具有细胞色素酶P450(CYP450)的活性，可用于药物筛查、人源化肝脏小鼠模型的构建，甚至可能作为有功能的肝脏替代物，为肝脏移植提供来源。

实施例3、用HepG2细胞构建组织工程肝脏器官模型——用于药物评价，体外肝功能研究模型

本实施例利用HepG2细胞灌注入肝脏生物基质支架LBS中构建组织工程肝脏器官模型，HepG2细胞为人肝癌细胞系，来源于人的肝癌组织，是研究药物代谢酶最常用的一种细胞株，因为其具备人肝细胞基本功能如白蛋白和尿素的表达及具有人肝细胞的I、II相药物代谢酶，并且可以体外无限扩增，易于操作和获取，可用于对肝功能及初步药物筛选及与肝细胞代谢相关的肝脏疾病的研究。包括以下步骤：

1)将肝脏生物基质支架(用实施例1方法得到)用无血清的DMEM培养基以3ml/min开始循环灌注，进行过夜预处理。

2)取对数生长期的二维培养(平面培养)的HepG2细胞(人肝癌细胞系，来源于ATCC)，用0.25％(0.05-1％均可)(V/V)胰酶消化处理1min(0.5-2min均可)，用含10％(8-15％均可)(V/V)胎牛血清(购自Gibco)的DMEM培养基(购自Gibco)终止消化，将细胞吹打至脱落，收集至离心管中，离心后弃上清用DMEM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，用DMEM培养基将HepG2细胞稀释至浓度为10000个细胞/mL(500-100000个细胞/mL均可)，得到HepG2细胞液；

3)步骤2)得到的人肝癌细胞系HepG2的再细胞化：将步骤2)得到的HepG2细胞液以9ml/min分3次灌注至每个肝脏生物基质支架中，总共灌注3000万个HepG2细胞，灌注速率是基于成年大鼠静止期间肝脏血流速度(85mL/min/Kg)选择的。

4)再细胞化完成后一天，每天用DMEM培养基继续灌注进行常规换液培养，7天换液培养后完成了组织工程肝脏器官模型的构建。

再细胞化的组织工程肝脏器官模型过程形态如图2所示，其中A幅是去细胞肝脏生物基质支架放入生物反应器中准备再细胞化之前的准备状态；B幅是指加入细胞再细胞成功后的培养状态；C幅是指选取的去细胞肝脏生物基质支架在体外的状态；D幅是指再细胞化后组织工程肝脏器官模型在体外的大体形貌。可以看出，随着细胞灌注进入去细胞肝脏生物基质支架，肝脏生物基质支架由白色透明状态变为微黄色，表明细胞整合进入了肝脏生物基质支架内，形成了组织工程肝脏器官模型，用于药物评价，体外肝功能研究模型。

本实施例使用HepG2细胞构建组织工程肝脏器官模型，是因为HepG2细胞可大量扩增，且能够保持较高的稳定性，较使用肝样细胞更易大批量获取，用于初步药物评价、体外肝功能的研究更为经济和科学。

实施例4、用HepG2细胞同时灌注高脂培养基组织工程脂肪肝疾病模型——用于药物评价与疾病研究模型

用HepG2细胞同时灌注高脂培养基组织工程脂肪肝疾病模型的方法，包括以下步骤：

1)取对数生长期的二维(2D)培养的HepG2细胞(来源于ATCC)，用0.25％(0.05-1％均可)(V/V)胰酶消化处理1min(0.5-2min均可)，用含10％(8-15％均可)(V/V)胎牛血清(购自Gibco)的DMEM培养基(购自Gibco)终止消化，将细胞吹打至脱落，收集至离心管中，离心后弃上清用DMEM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，用DMEM培养基将HepG2细胞稀释至浓度为10000个细胞/mL(500-100000个细胞/mL均可)，得到HepG2细胞液；

2)将肝脏生物基质支架用无血清的DMEM培养基以3ml/min开始循环灌注，进行过夜预处理。

3)步骤1)得到的人肝细胞癌系HepG2的再细胞化：第二天将步骤1)得到的HepG2细胞液每个支架以9ml/min分3次灌注至每个步骤2)预处理后的肝脏生物基质支架中，总共灌注3000万个HepG2细胞，灌注速率是基于成年大鼠静止期间肝脏血流速度(85mL/min/Kg)选择的。

2)再细胞化完成后一天，用高脂培养基继续灌注5天进行换液，并进行形貌表征和肝细胞相关功能检测，5天后肝脏生物基质支架上的HepG2细胞功能可达到稳态。将培养5天收获得到的组织工程肝脏疾病模型作为药物等评测的组织工程脂肪肝疾病模型。高脂培养基的配制方法为：分别将油酸和棕榈酸(Sigma-Aldrich，USA)溶于100％乙醇至1mmol/L；然后将33.3μL油酸及16.7μL棕榈酸混匀后加入10μL NaOH，随后加入800μL DMEM混合，置于60℃的超声波浴中30分钟；最后，加入3.1mL不含脂肪酸的BSA培养基，并用浓盐酸调节至pH7.4。将制备的FFA添加到100mL含有10％胎牛血清的DMEM中。

本实施例使用HepG2细胞结合高脂培养基构建组织工程肝脏疾病模型，其优势为易于操作和获取，且相对成本较低，可用于初步非酒精性脂肪性肝病的药物评价及发病机制的研究。

实施例5、用HepG2和HUVEC细胞构建有血管的组织工程肝脏器官模型——用于药物肝毒性安全性评价

HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，具有干细胞的潜能，体外培养可成血管样管腔结构，可用于组织工程中血管的重建研究、血管再生与内皮细胞及其它类型细胞相互作用等方面的研究。用HepG2和HUVEC细胞构建有血管的组织工程肝脏器官模型的方法，包括以下步骤：

1)将肝脏生物基质支架用无血清的DMEM培养基以3ml/min开始循环灌注，进行过夜预处理。

2)取对数生长期的二维(2D)培养的HepG2细胞和HUVEC细胞(来源于ATCC)，分别用0.25％(0.05-1％均可)(V/V)胰酶消化处理1min(0.5-2min均可)，用含10％(8-15％均可)(V/V)胎牛血清(购自Gibco)的DMEM培养基(购自Gibco)终止消化，将细胞吹打至脱落，收集至离心管中，离心后弃上清用DMEM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，用DMEM培养基将HepG2细胞稀释至浓度为10000个细胞/mL(500-100000个细胞/mL均可)，DMEM培养基将HUVEC细胞稀释至浓度为5000个细胞/mL(500-100000个细胞/mL均可)，分别得到HepG2细胞液和HUVEC细胞液；

3)人肝癌细胞系HepG2的再细胞化：将步骤2)得到的HepG2细胞液和HUVEC细胞液以9ml/min分3次灌注至每个步骤1)预处理后的肝脏生物基质支架中，总共灌注2000万个HepG2细胞和1000万个HUVEC细胞，灌注速率是基于成年大鼠静止期间肝脏血流速度(85mL/min/Kg)选择的。

5)再细胞化完成的后一天，每天用DMEM培养基继续灌注进行换液，并进行形貌表征和肝细胞相关功能检测，5天后HepG2细胞和HUVEC细胞可在肝脏生物基质支架上粘附，肝细胞功能可达到稳态，HUVEC细胞也会自行迁移到肝脏生物基质支架的管腔结构中。将培养5天收获得到的再细胞化及再血管化的有序的细胞支架聚集体作为组织工程肝脏器官模型。

本实施例使用HepG2和HUVEC细胞构建组织工程肝脏器官模型，其中HUVEC细胞为肝相关细胞，不仅可以构建出血管管腔为肝实质细胞提供支持作用，提高肝细胞的功能，使肝细胞能够更加灵敏地反映药物代谢产生的毒性，而且可以检测肝毒性药物对内皮细胞的毒性影响。

检测例1、采用HE染色法观察细胞在肝脏生物基质支架内的分布情况

针对实施例3获得的组织工程肝脏器官模型，培养5天后，取再细胞化的组织工程肝脏器官模型，依次进行固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。染色后照片如图3所示，A幅是对整肝切片进行全貌扫描，可见细胞分散分布在整个支架中；B幅是局部放大的图片，可见肝细胞在全肝中均匀分布，生长状态良好。

用检测例1相同的方法对实施例2和实施例5得到的组织工程肝脏器官模型进行HE染色，结果可见细胞分散分布在整个支架中，肝细胞在全肝中均匀分布，生长状态良好。

检测例2、组织工程肝脏器官模型中肝细胞分泌白蛋白与尿素能力的测定

培养结束后，收集实施例3的培养上清液，同时收集二维培养的HepG2细胞培养上清，用human albumin ELISA试剂盒(购自Bethyl)检测组织工程肝脏器官模型中肝细胞(HepG2细胞)分泌的白蛋白量，用QuantiChrom Urea Assay Kit(尿素检测试剂盒，购自BioAssay Systems)检测培养上清中的尿素含量。

检测结果如图4所示，A幅是组织工程肝脏器官模型和普通的2D培养的细胞上清进行Albumin检测的结果，可见组织工程肝脏器官模型的培养上清在培养头5天内处于一种上升的趋势，从第5天开始处于一种相对平稳的状态；B幅的尿素表达趋势基本同白蛋白的趋势。以上结果说明HepG2细胞经与LBS混合三维培养后形成的组织工程肝脏器官模型分泌白蛋白能力显著增强，初步表明经三维混合培养的HepG2细胞在肝功能方面增强，表明本发明组织工程肝脏器官模型培养的肝细胞具有较强的肝功能。

用检测例2相同的方法对实施例2和实施例5得到的组织工程肝脏器官模型的白蛋白分泌量、尿素分泌量进行检测，结果分泌水平较二维培养均明显提高，表明经三维混合培养的HepG2细胞在肝细胞功能方面明显增强。

检测例3、组织工程肝脏疾病模型的脂质合成量的检测

针对实施例4中的组织工程脂肪肝疾病模型，培养8天后，进行固定，冷冻切片，室温回温，蒸馏水浸洗，使用油红O工作液进行脂滴染色。

染色后照片如图5所示，与正常组织工程肝脏(TE)器官模型相比，组织工程肝脏疾病模型(即组织工程脂肪肝(TEF))的肝细胞中含有大量脂滴，证明疾病模型构建成功。

检测例4、RT-PCR检测组织工程肝脏器官模型药物代谢酶和药物转运体基因(肝功能相关基因)的表达水平

RT-PCR检测实施例3和实施例5中的组织工程肝脏器官模型(分别为H-recell，E/H-recell)药物代谢酶和药物转运体基因(肝功能相关基因)的表达水平，方法为：用RNeasyMini Kit试剂盒(购自QIAGEN)提取肝细胞总RNA，用GoldScript反转录试剂盒(购自TOYOBO)合成cDNA，以GAPDH为内参基因，RT-PCR检测Ⅰ相药物代谢酶，Ⅱ相药物代谢酶和药物转运体基因的mRNA水平，引物序列如表1所示。

表1引物序列

检测结果如图6所示，实施例3的组织工程肝脏器官模型与二维培养的细胞相比，各项基因表达水平升高，HepG2三维细胞模型(即组织工程肝脏器官模型)较HepG2二维细胞模型的肝细胞功能明显改善，而加入HUVEC细胞共培养的实施例5的有血管的组织工程肝脏器官模型具有更高的药物代谢Ⅰ相酶、Ⅱ相酶、药物转运体基因的表达水平，说明所构建的组织功能肝脏器官模型可用于药物等肝毒性安全性评测，此模型不仅能检测药物对肝细胞的毒性作用，也可以检测出药物经肝脏的代谢产物对肝细胞的毒性，表明该模型可用于药物的肝毒性评价。

用检测例4相同的方法对实施例2得到的组织工程肝脏器官模型的肝功能相关基因表达量进行检测，结果基因表达水平较二维培养明显提高，与实施例3相当，表明经三维混合培养的HepG2细胞在肝细胞功能方面明显增强。

检测例5、检测曲格列酮(TRO)对组织工程肝脏器官模型的细胞毒性

针对实施例3和实施例5中的组织工程肝脏器官模型(分别为肝细胞组，肝细胞及内皮细胞组)再细胞化第5天后，在培养基中加入40μM曲格列酮，循环灌注5天，每天取培养基上清，备用。二维培养细胞作为对照。对加入曲格列酮的培养上清进行LDH检测。LDH是反应细胞凋亡的指标，结果如图7所示。

图7结果显示肝细胞组及肝细胞及内皮细胞组两组的LDH较二维培养细胞组都显著升高，尤其是肝细胞及内皮细胞组，表明本发明的组织工程肝脏器官模型可用于药物肝毒性的评测。

用检测例5相同的方法检测曲格列酮对实施例2得到的组织工程肝脏器官模型的细胞毒性，结果LDH较二维培养显著升高，表明本发明的组织工程肝脏器官模型可用于药物肝毒性的评测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (4)

1.一种构建组织工程肝脏模型的方法，所述组织工程肝脏模型为组织工程肝脏疾病模型，包括肝脏生物基质支架的获得和对肝脏生物基质支架进行再细胞化；

所述肝脏生物基质支架用以下方法获得：将取自SD大鼠血液流尽的肝脏器官用含PLA2的1% SDC溶液灌注至肝脏透明，洗尽肝脏中残留的SDC，得到去细胞的肝脏即为肝脏生物基质支架；具体为：雄性SD大鼠进行麻醉后，剪开腹腔，分离出肝脏门静脉，用导管插入门静脉作为灌注入口；灌注PBS，将血液从肝脏中移除；灌注含有36 U/L的磷脂酶A的21％去氧胆酸钠溶液去除血浆和核膜，灌注直到肝组织变得透明；用3.4 M NaCl缓冲液灌注30分钟，用PBS冲洗肝脏15分钟，然后用DNase和RNase灌注除去残余的核酸，得到肝脏生物基质支架粗品，简称LBS粗品；用PBS冲洗LBS粗品除去残留的盐和核酸酶，保留肝中叶，所有血管结构完整，最后使用钴-60γ辐照器进行灭菌，得到肝脏生物基质支架；

对肝脏生物基质支架进行再细胞化具体为：将肝脏生物基质支架用无血清的培养基以循环灌注至平衡后，用培养基将肝样种子细胞稀释至浓度为500-100000个细胞/mL，得到肝样种子细胞液，将肝样种子细胞液灌注至肝脏生物基质支架中；用高脂培养基继续灌注进行换液培养，换液培养3-10天，得到组织工程肝脏疾病模型；其中所述肝样种子细胞为人肝细胞癌系HepG2。

2.由权利要求1所述的方法构建获得的组织工程肝脏疾病模型。

3.根据权利要求2所述的组织工程肝脏疾病模型，其中所述疾病选自非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病、病毒性肝炎。

4.权利要求2或3所述的组织工程肝脏疾病模型在构建肝脏相关疾病模型中的应用；或在评价肝脏相关疾病的发病机理中应用；或在评价治疗和/或预防肝脏相关疾病药物有效性中的应用；或在治疗和/或预防肝脏相关疾病药物的药理学、体外机制及毒理学的评价中的应用；所述肝脏相关疾病选自非酒精性脂肪性肝病、遗传代谢性肝病、病毒性肝炎。

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