CN110373380B - 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用，所述方法包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并依次经过中内胚阶段、肝脏诱导阶段和成熟阶段进行分化培养，得到包含肝细胞、胆管细胞和内皮细胞的不同类型细胞，不同类型细胞有序排列组合构成肝脏类器官。本发明可通过控制不同分化阶段的化合物暴露时间，进行化合物对肝脏毒性效应与肝脏早期发育影响的筛选与评价。同时，本发明可在短时间高通量进行单一或多种化合物的肝脏发育影响与肝脏毒性效应评价，且评价指标简单、直观、多样化，可对许多新合成化合物进行快速初筛，为后续化合物改造、药理学与毒理学机制研究或投入市场使用建立基础。

Description

一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于细胞生物学与环境毒理学交叉领域，涉及一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用。
背景技术
近年来，由于科技进步，新型化合物的合成与植物有效成分的提取越来越便捷高效，但同时这些新兴的单一化合物或混合物也存在潜在的人体健康风险。一方面，新型化合物性质优良，常在开发后迅速投入市场大量使用。另一方面，在投入市场之前，这些化合物往往缺乏严格的健康风险评价数据，是否对人体存在危害尚不清楚。肝脏，是人体内以代谢功能为主的器官，体内产生的和体外摄取的有毒物质都通过肝脏代谢。所以当不恰当的用药或长期暴露存在潜在风险的化合物时，易引起肝脏损伤，危害人体健康。
目前评价化合物肝毒性效应的模型主要分为两类，动物模型与细胞模型，其中评价药物通常采用动物模型。对于动物模型，其优点是可以从整体水平评估ADME四相过程(即吸收、分布、代谢、排泄过程)，并能同时对不同脏器的药理学、毒理学作用进行比对分析；缺点是需要大量实验动物，个体差异及物种差别不能忽略，实验重复性较差，对供试的化合物需求量大，因此不适合进行大规模化合物的初步筛查。对于细胞模型，多采用肝癌细胞系和原代肝细胞作为实验模型。相比动物模型，这类细胞模型有更好的可重复性，能够在短期时间内进行大规模实验。但是由于实验细胞类型为癌细胞系或原代细胞，并不是生理状态下的健康细胞且实验细胞类型单一，还无法进行器官发育过程的研究，所以很大的限制了研究的广度与深度。
发明内容
有鉴于此，本发明利用胚胎干细胞建立了一种肝脏类器官模型解决了以上问题。
首先，基于胚胎干细胞建立的模型拥有常规细胞模型相同的优点，如简单、便捷、易操作、重复性好。其次，胚胎干细胞相比于癌细胞和原代细胞更加接近人体健康的生理状态，能够更加贴近模拟正常人体。再次，胚胎干细胞还具有体外无限增殖与多向分化潜能的两大特性。体外无限增殖即胚胎干细胞可以在体外培养条件下无限的增殖并保持正常核型；多向分化潜能即意味着胚胎干细胞可以在特定诱导条件下分化成人体各个组织器官不同时期的细胞类型，模拟人体不同组织和器官的发育过程。同时3D培养技术的兴起，使胚胎干细胞能够在特定条件下分化成为各种类器官，如脑类器官、肠类器官、肝脏类器官等。由于类器官包含多种类型细胞且不同细胞有序排列组合，所以能够更好的模拟体内真实环境。
由此可见，利用本发明评价化合物的潜在肝毒性效应不仅能够在短时间内高通量进行化合物筛选与评价，并且能够得到非常贴近人体真实情况的实验数据，为后续的机理研究、化合物管控政策制定、新药临床前评估提供充足的数据基础。
本发明的目的是在特定培养条件下，胚胎干细胞分化形成包含多种细胞类型且具有器官组织结构特征的肝脏类器官。在此模型中，暴露单一化合物或混合物，不仅可以研究肝脏胆管发育过程中受到的影响，也可以评价受试物的潜在肝毒性。
为了达到上述目的，一方面，本发明提出一种建立肝脏类器官模型的方法，包括以下步骤：
(1)对胚胎干细胞进行支持培养；
(2)制备细胞球，并依次经过中内胚阶段、肝脏诱导阶段和成熟阶段进行分化培养，得到包含肝细胞、胆管细胞和内皮细胞的不同类型细胞，不同类型细胞有序排列组合构成肝脏类器官。
在一些实施例中，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
在一些实施例中，所述细胞球的制备方法包括将胚胎干细胞消化成单细胞悬液，然后在细胞球形成培养基中进行单细胞接种，优选地，单细胞接种密度为1.8×106cells/mL至5.4×106cells/mL。
在一些实施例中，所述细胞球制备方法的细胞球形成培养基包括：DMEM/F-12培养基、胰岛素、维生素C磷酸酯镁、转铁蛋白、硒酸钠、DNA酶和ROCK1抑制剂Y27632，优选地，各组分的含量为：胰岛素19.4μμg/L、维生素C磷酸酯镁64mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、硒酸钠14μg/L、DNA酶1mg/L和ROCK1抑制剂Y27632 10μM。
在一些实施例中，在中内胚阶段，利用A类型分化培养基与B类型分化培养基诱导人胚胎干细胞分化成为中内胚细胞群，所述A类型分化培养基包括：RPMI-1640培养基、Wnt通路激活剂CHIR99021、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及B27培养基添加物或牛血清蛋白。优选地，各组分的含量为：Wnt通路激活剂CHIR990213μM、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/mL，选择B27培养基添加物且在培养基中占比2vol.％。
在一些实施例中，所述B类型分化培养基包括：RPMI-1640培养基以及B27培养基添加物或牛血清蛋白。优选地，B27培养基添加物在培养基中占比2vol.％。
在一些实施例中，在肝脏诱导阶段，利用C类型分化培养基将处于中内胚阶段的细胞群向肝脏方向分化诱导，所述C类型分化培养基包括：KnockOut DMEM培养基、KnockOut血清替代物(KSR)、GlutaMax培养基添加物、非必需氨基酸(NEAA)、二甲亚砜和2-巯基乙醇。优选地，100mL C类型分化培养基包含20vol.％KnockOut血清替代物(KSR)、1vol.％GlutaMax培养基添加物、1vol.％非必需氨基酸(NEAA)、1vol.％二甲亚砜和0.5vol.％2-巯基乙醇。
在一些实施例中，在成熟阶段，利用D类型分化培养基促进细胞群成熟，所述D类型分化培养基包括：Leibovitz′s L-15培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白示磷酸盐肉汤、GlutaMax培养基添加物、胰岛素-转铁蛋白-硒培养基添加物、L(+)-抗坏血酸钠、氢化可的松琥珀酸酯、益智二肽(Dihexa)和地塞米松。优选地，100mL D类型分化培养基包含8.3vol.％胎牛血清(FBS)、8.3vol.％胰蛋白示磷酸盐肉汤、1vol.％GlutaMax培养基添加物、0.58vol.％胰岛素-转铁蛋白-硒培养基添加物、0.05g L(+)-抗坏血酸钠、48.45μg氢化可的松琥珀酸酯、4.9μg益智二肽(Dihexa)和3.92μg地塞米松。
在一些实施例中，A类型分化培养基持续培养时间为1-2天；B类型分化培养基持续培养时间为2-5天；C类型分化培养基持续培养时间为3-6天；D类型分化培养基持续培养时间为3-5天。优选地，A、B、C和D类型分化培养基持续培养时间分别为1、3、5和2天。
在一些实施例中，四种分化培养基处理细胞时间长短根据不同实验目的进行选择与组合。
另一方面，本发明还提出一种利用所述方法得到的肝脏类器官模型。
在一些实施例中，所述肝脏类器官模型的结构至少包括：管状结构、空泡结构和致密结构。
又一方面，本发明还提出所述肝脏类器官模型在药理学/毒理学评价中的应用，包括以下步骤：
(1)在中内胚阶段、肝脏诱导阶段和成熟阶段中的至少一个阶段加入待测物质以测试其潜在肝脏毒性效应；
(2)通过分析肝脏功能相关的指标筛选或评价所述物质。
在一些实施例中，所述物质包括药物与环境污染物中的一种或多种，优选地，所述物质包括对乙酰氨基酚、双酚类化合物、全氟化合物中的一种或多种。
在一些实施例中，所述指标包括基因表达水平、蛋白表达水平、代谢产物和酶活性中的一种或多种。
在一些实施例中，分析指标的方法包括基因组学、蛋白组学、代谢组学、酶活性检测中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明具备常规细胞模型评价化合物的一般特性，如仅需非常少量的供试化合物，节省时间，节约花费，在使用相对较少的人力情况下也可高通量评价不同化合物的效应；
2、由于本发明是基于人胚胎干细胞的细胞模型，所以可以很大程度贴近健康人体生理状况；
3、本发明通过人胚胎干细胞形成肝脏类器官，可在体外模拟肝脏发育过程。这是其他模型不能替代的。在此过程中，暴露不同化合物，可通过基因表达和蛋白表达等生物学指标来评价化合物是否对肝脏或肝脏发育产生影响；
4、本发明极大程度模拟了肝脏器官和肝脏发育过程，为化合物作用于细胞信号通路、转录调控、特异靶点等更深入的药理学/毒理学研究提供支持。
附图说明
图1A-1E为本发明实施例中不同时间点的肝脏类器官；
图2为本发明实施例中的HE染色后的肝脏类器官石蜡切片；
图3A-3C为本发明实施例中三次独立重复实验基因表达热图；
图4为本发明实施例中暴露6天对乙酰基苯酚的肝脏类器官细胞色素蛋白基因表达热图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
在本发明的一个实施例中，利用本发明的方法评价一种药物(对乙酰氨基酚)的肝毒性效应。
1、人胚胎干细胞的支持培养：
人胚胎干细胞H9在mTeSR1培养基中，生长于Vitronectin包被的培养皿中，当细胞生长覆盖皿底90％面积，克隆传代继续培养。本发明所使用的人胚胎干细胞系(H9)来源于National Stem Cell Bank c/o WiCell Research Institute，系中科院上海生科院生化细胞所干细胞平台提供。
2、制备细胞球：
①人胚胎干细胞H9用TrypLE消化液制成单细胞悬液，按至1.8×106cells/mL至5.4×106cells/mL的任一细胞密度接种于微孔培养板中制备大小均一的三维细胞球。在分化培养前一天单细胞接种细胞球形成培养基，包括DMEM/F-12培养基、胰岛素(19.4μg/L)、维生素C磷酸酯镁(64mg/L)、转铁蛋白(10.7mg/L)、硒酸钠(14μg/L)、ROCK1抑制剂Y27632(10μM)和DNA酶(1mg/L)。
②第0天从微孔培养板中收集细胞球并加入A类型分化培养基，包括RPMI-1640培养基、Wnt通路激活剂CHIR99021(3μM)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，20ng/mL)、B27培养基添加物(2vol.％)。
③第1天将细胞中的A类型培养基更换成B类型培养基，包括RPMI-1640培养基、B27培养基添加物(2vo1.％)。B类型培养基持续作用3天且每天更换新鲜培养基。
④第4天将B类型培养基更换成C类型分化培养基，包括KnockOut DMEM培养基、KnockOut血清替代物(KSR，20vol.％)、GlutaMax培养基添加物(1vol.％)、最小基本培养基(NEAA，1vol.％)、二甲亚砜(1vol.％)、2-巯基乙醇(0.5vol.％)。C类型培养基持续作用5天且每天更换新鲜培养基。第五天开始在C类型培养基中加入对乙酰氨基酚(1nM和100nM)，培养基中加入0.01％二甲亚砜作为对照组。
⑤第9天将C类型培养基更换成D类型分化培养基，包括Leibovitz′s L-15培养基、胎牛血清(FBS，8.3vol.％)、胰蛋白示磷酸盐肉汤(8.3vol.％)、GlutaMax培养基添加物(1％)、胰岛素-转铁蛋白-硒培养基添加物(0.58％)、L(+)-抗坏血酸钠(0.05g)、氢化可的松琥珀酸酯(48.45μg)、益智二肽(Dihexa，4.9μg)、地塞米松(3.92μg)。D类型培养基持续作用2天且每天更换新鲜培养基。D类型培养基中加入对乙酰氨基酚(1nM和100nM)，培养基中加入0.01vol.％二甲亚砜作为对照组。
3、肝毒性效应评价
整个分化过程需要在不同时间点收集样品：中内胚阶段为第1天和第4天、诱导阶段为第9天、成熟阶段为第11天。图1A至1E为不同时间点类器官形态。图1A(第0天)可见大小均一的细胞球；图1B(第1天)和1C(第4天)可见细胞球尺寸增大，并且出现中心较暗四周较浅的中内胚特征；图1D(第9天)和1E(第11天)可见细胞球形成空腔结构，并且出现不同形态的细胞类型；图2为第11天样品的石蜡切片，通过HE染色观察其结构特征，发现切片中有管状组织类似结构(圆圈)、黏膜上皮杯状细胞(右方框)、内皮细胞(左方框)和肝类似细胞(箭头)。图3A-3C为本发明实施例中四次独立重复实验基因表达热图。由图可知，本发明重复性良好，系统稳定。
同时，本发明实施例收集了第9天和11天的样品，即肝毒性阳性药物对乙酰氨基酚(1nM和100nM)连续暴露4天和6天。从热图(附图4)可知，与对照组(0.01vol.％二甲亚砜)相比，处理组细胞色素蛋白相关基因表达水平受到影响，证实对乙酰氨基酚的肝毒性效应。
通过本发明的方法可以确定各种物质，例如环境污染物、新型化合物和天然药物等，具体可以为对乙酰氨基酚、双酚类、全氟化合物、PM2.5、黄酮类化合物等对肝脏的毒性效应和肝脏发育过程的影响影响。
本发明能够短时间并且高通量筛选与评价新型合成药、中药制剂、天然提取药物、新型污染物等单一或多组分样品，为层出不穷的新型化合物提供便捷高效的肝毒性筛选与评价方法。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种建立肝脏类器官模型的方法，包括以下步骤：
(1)对胚胎干细胞进行支持培养，所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞H9；
(2)制备细胞球，并依次经过中内胚阶段、肝脏诱导阶段和成熟阶段进行分化培养，得到包含肝细胞、胆管细胞和内皮细胞的不同类型细胞，不同类型细胞有序排列组合构成肝脏类器官；
所述细胞球的制备方法包括将胚胎干细胞消化成单细胞悬液，然后在细胞球形成培养基中进行单细胞接种，所述细胞球形成培养基包括：DMEM/F-12培养基，胰岛素，维生素C磷酸酯镁，转铁蛋白，硒酸钠，DNA酶和ROCK1抑制剂Y27632；
在中内胚阶段，利用A类型分化培养基与B类型分化培养基诱导人胚胎干细胞分化成为中内胚细胞群，所述A类型分化培养基包括：RPMI-1640培养基，Wnt通路激活剂CHIR99021，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及B27培养基添加物或牛血清蛋白；所述B类型分化培养基包括：RPMI-1640培养基以及B27培养基添加物或牛血清蛋白；
在肝脏诱导阶段，利用C类型分化培养基将处于中内胚阶段的细胞群向肝脏方向分化诱导，所述C类型分化培养基包括：KnockOut DMEM培养基，KnockOut血清替代物(KSR)，GlutaMax培养基添加物，非必需氨基酸(NEAA)，二甲亚砜和2-巯基乙醇；
在成熟阶段，利用D类型分化培养基促进细胞群成熟，所述D类型分化培养基包括：Leibovitz's L-15培养基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白示磷酸盐肉汤，GlutaMax培养基添加物，胰岛素-转铁蛋白-硒培养基添加物，L(+)-抗坏血酸钠，氢化可的松琥珀酸酯，益智二肽(Dihexa)和地塞米松。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，单细胞接种密度为1.8×106cells/mL至5.4×106cells/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞球形成培养基各组分的含量为：胰岛素19.4μg/L，维生素C磷酸酯镁64mg/L，转铁蛋白10.7mg/L，硒酸钠14μg/L，DNA酶1mg/L和ROCK1抑制剂Y27632 10μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述A类型分化培养基各组分的含量为：Wnt通路激活剂CHIR99021 3μM，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/mL，选择B27培养基添加物且在培养基中占比2vol.％；所述B类型分化培养基中B27培养基添加物在培养基中占比2vol.％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，100mL C类型分化培养基包含20vol.％KnockOut血清替代物(KSR)，1vol.％GlutaMax培养基添加物，1vol.％非必需氨基酸(NEAA)，1vol.％二甲亚砜和0.5vol.％2-巯基乙醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，100mL D类型分化培养基包含8.3vol.％胎牛血清(FBS)，8.3vol.％胰蛋白示磷酸盐肉汤，1vol.％GlutaMax培养基添加物，0.58vol.％胰岛素-转铁蛋白-硒培养基添加物，0.05g L(+)-抗坏血酸钠，48.45μg氢化可的松琥珀酸酯，4.9μg益智二肽(Dihexa)和3.92μg地塞米松。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，A类型分化培养基持续培养时间为1-2天；B类型分化培养基持续培养时间为2-5天；C类型分化培养基持续培养时间为3-6天；D类型分化培养基持续培养时间为3-5天。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，四种分化培养基处理细胞时间长短根据不同实验目的进行选择与组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，A、B、C和D类型分化培养基持续培养时间分别为1、3、5和2天。
10.一种利用权利要求1-9中任一项所述方法得到的肝脏类器官模型。
11.根据权利要求10所述的肝脏类器官模型，其中，所述肝脏类器官模型的结构至少包括：管状结构、空泡结构和致密结构。
12.一种根据权利要求10或11所述的肝脏类器官模型在药理学/毒理学评价中的应用，包括以下步骤：
(1)在中内胚阶段、肝脏诱导阶段和成熟阶段中的至少一个阶段加入待测物质以测试其潜在肝脏毒性效应；
(2)通过分析肝脏功能相关的指标筛选或评价所述物质。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述物质包括药物与环境污染物中的一种或多种。
14.根据权利要求12所述的应用，其中，所述物质包括对乙酰氨基酚、双酚类化合物、全氟化合物中的一种或多种。
15.根据权利要求12所述的应用，其中，所述指标包括基因表达水平、蛋白表达水平、代谢产物和酶活性中的一种或多种。
16.根据权利要求12所述的应用，其中，分析指标的方法包括基因组学、蛋白组学、代谢组学、酶活性检测中的一种或多种。
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