CN101448932A - 三维细胞培养 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于培养离体分离的前脂肪细胞的方法，所述方法包括将前脂肪细胞引入到三维支持物基质中，和容许所述细胞在所述支持物基质中体外分化为脂肪细胞。所述基质可以是胶原基质。本方法可以用于研究干细胞的发育，或用于研究脂肪细胞对刺激的响应。本方法提供了这样的系统，由此具有与体内的那些类似生物特征的脂肪细胞能够在体外生长。
Description
发明领域
本发明涉及用于培养脂肪细胞的三维细胞培养系统。本发明还涉及用于培养脂肪细胞和用于在细胞培养中从前脂肪细胞获得脂肪细胞的方法。本发明的方面还涉及用于评估脂肪细胞和其他细胞类型之间的相互作用的方法，和用于评估脂肪细胞对环境刺激的响应的方法。这能够更好地理解参与细胞和组织相互作用的机制，并且在肥胖症、糖尿病、炎症及相关疾病领域中具有暗示。
发明背景
传统上，主要认为脂肪组织是在其他方面惰性的储存物质。近年来，它的功能重要性才引起注意。现已知脂肪细胞参与一定范围的与其他细胞类型的相互作用，以及不同因子的产生和分泌。脂肪与不同的组织，包括心脏、心包、血管周围和肾脏周围的组织、和骨髓相关。它还与淋巴组织相关，并且已知脂肪细胞与淋巴细胞相互作用。它们分泌多种细胞因子和趋化因子，并且被认为参与调节重量，以及在糖尿病和炎症中起作用。
脂肪细胞是大且易碎的细胞，并且在分析过程中很难维持它们的完整。如果它们破裂，它们释放它们的脂肪内容物，所述脂肪内容物能够干扰基于水的生物化学测定。为了最小化破裂，在脂肪细胞处理中需要相当多的专门技术。
培养脂肪细胞的较早期工作集中在组织碎片的外植体培养或创建无限增殖化的细胞系上。这两种方法均具有缺点：外植体迅速变得坏死，从而限制能够进行分析的时间，并且细胞系失去体内脂肪细胞的结构和功能特征。还离体(ex vivo)地分离了脂肪细胞，并以单层生长。此外，由于这些细胞以二维方式增殖，所以它们失去了它们的“正常”结构和功能，并且此外，当脂肪细胞变得完全成熟(含有大脂肪滴)时，它们的密度使得它们浮起脱离该单层，并逐渐失去，从而阻碍分析。低浮力密度意指它们不能按照常规过程如离心法处理。更近期，报告了这样的三维培养系统，其中成熟的离体脂肪细胞在胶原凝胶中与内皮细胞一起共-培养(Aoki等，2003，细胞结构与功能(Cell Struct Funct)28，55)。该论文没有报告它们的培养物的寿命，也没有报告所培养的脂肪细胞用于生物化学分析的适宜性。而且，所述共-培养包括不同数量的前脂肪细胞，该作者将其认为是缺点。此外，Aoki等报告了认为在培养物中存在内皮细胞对脂肪细胞的生长，和对从前脂肪细胞发育为所述细胞是必需的。
WO 2005/121316描述了在支持物基质表面上培养脂肪细胞或前脂肪细胞；有效地，该基质起到二维培养基底的作用。没有公开在该基质中前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。
WO 2004/035102描述了在具有细小泡状结构的颗粒中培养前脂肪细胞，并将这些颗粒注射到体内。没有公开前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，并且没有提及在三维支持物基质中的体外培养。
Hemmrich等，分化(Differentiation)第73卷，2005，第28-35页描述了在二维培养系统中前脂肪细胞的体外分化。
Patel等，组织工程(Tissue Engineer)，第11卷，2005，第1498-1505页描述了细胞支架系统中培养前脂肪细胞。没有观察到向脂肪细胞的分化，而只有细胞死亡或细胞增殖。
Hilliou等，试验细胞研究(Exp Cell Res)，第177卷，1988，第372-381页讨论了3T3前脂肪细胞细胞系的培养。
Von Heimburg等，生物材料(Biomaterials)，第22卷，2001，第429-438页描述了在由定向固化和冻干胶原产生的胶原海绵中培养前脂肪细胞。该公布中没有公开在支持物基质中体外培养和分化前脂肪细胞为脂肪细胞。
Kuberka等，国际人造器官杂志(Int J Artificial Organs)，第25卷，2002，第67-73页描述了创建类似于von Heimburg使用的胶原海绵，但是没有描述在海绵中培养前脂肪细胞。
因此，这些文献均没有公开在三维支持物基质中培养离体的前脂肪细胞，以及它们随后在体外分化为脂肪细胞。本发明人开发了意欲避免，至少部分地避免现有技术问题的新型培养系统和方法。我们提供了这样的系统，其中具有与体内脂肪细胞类似的生物特征的脂肪细胞能够在稳定基底中体外生长，所述基底使得它们能够进行细胞学、生物化学和分子分析。能够使该培养系统接近地模仿内环境。这容许以从前不可能的方法，在体外研究脂肪细胞和其他细胞类型之间的相互作用。例如，这可能在干细胞研究中的具有应用。体内的干细胞通常在包括脂肪细胞的微环境中存在并增殖。然而，因为按照常规非常难于培养它们，所以常常将脂肪细胞排除在干细胞培养系统之外。我们的3D模型能够用于提供具有与体内环境更接近类似的环境的脂肪细胞和其他细胞，并由此为干细胞增殖和分化提供更好的条件。
发明概述
按照本发明的第一方面，提供了体外培养脂肪细胞的方法，所述方法包括：
将前脂肪细胞引入到三维支持物基质中；和
容许所述前脂肪细胞在所述支持物基质中分化为脂肪细胞。
本方法由此容许脂肪细胞在基质中生长，由此减少了在处理和操作易碎脂肪细胞中的问题。此外，三维基质将成熟的脂肪细胞保持在该基质中，以使成熟的细胞不浮起脱离单层。三维基质还为脂肪细胞提供更接近地类似于它们自然环境的环境，以使所述细胞的形式和功能更加接近地类似于“正常”细胞。
所述基质优选地包括胶原基质。I型胶原是优选的，且可以以明胶(变性的I型胶原)的形式提供。备选地，可以使用II型胶原。I型胶原是最优选的物质，尽管我们相信可以替代地使用其他物质。然而，这些物质可能提供不如使用胶原满意的结果。所述基质的目的是为培养的细胞提供三维支持物基质，所述基质允许更小细胞的迁移，但其阻止更大的成熟脂肪细胞的迁移，同时还允许培养基、生长因子、和其他小分子扩散遍及该基质。任何合适的物质可以用于所述基质，尽管本文中指出的物质是优选的。我们相信可以使用的实例物质包括水凝胶类型的物质，诸如藻酸盐或琼脂糖。其他合适的基质物质可以包括Matrigel(RTM)、或从脂肪组织中提取的细胞外基质(ECM)物质。
将前脂肪细胞引入基质中的步骤可以包括将前脂肪细胞接种到处于流体形式的基质前体中，和容许所述基质前体固化形成基质。固化可以包括基质前体等的聚合。
本方法还可以包括从脂肪组织中分离前脂肪细胞，从而引入到所述基质中的步骤。用于这样的分离的技术是已知的，并且可以包括，例如，用例如胶原酶消化脂肪组织，和通过利用例如过滤或离心分离前脂肪细胞和脂肪组织的其他成分。
本方法还可以包括向所述基质中引入一种或多种分化因子的步骤，从而引起前脂肪细胞分化为脂肪细胞。可以在引入前脂肪细胞的同时，或之前或之后，引入所述分化因子。可以将所述因子引入到处于流体形式的基质前体中，并且容许所述前体固化形成所述基质。备选地，可以通过例如使所述基质与包括所述因子的液体溶液接触而将所述因子引入到基质中。
合适的分化因子是本领域已知的，且可以包括，例如，美国专利6,153,432中详述的那些，将其内容引入本文作为参考。特别优选的分化因子包括葡萄糖、环化AMP诱导物、糖皮质素或糖皮质素类似物、胰岛素或胰岛素类似物、和PPARγ激动剂或RXR激动剂之一。最优选的分化因子是异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、和胰岛素之一。
本方法还可以包括用另一种培养基替换基质中的分化因子的步骤。例如，在前脂肪细胞已经进行分化后，可以在标准生长培养基(例如，MEMα培养基)中洗涤所述基质。
可以将另外的细胞类型引入到所述基质中；可以在与前脂肪细胞同时，在分化为脂肪细胞之后，或在引入前脂肪细胞之前，引入这些细胞。优选地，另外的细胞类型不包括内皮细胞。
本方法可以包括从所述基质中释放分化的脂肪细胞的步骤。这可以通过例如消化所述基质(例如，如果所述基质是胶原，则利用胶原酶)和随后回收脂肪细胞而实现。
按照本发明的另一方面，提供了其中存在前脂肪细胞的三维支持物基质，其中所述基质不包含内皮细胞。所述基质还可以包括一种或多种分化因子，从而促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。
本发明还提供了其中存在脂肪细胞的三维支持物基质，所述脂肪细胞是通过前脂肪细胞在所述基质中的分化而获得的。优选地，所述基质也不包括内皮细胞。
按照本发明还提供了研究脂肪细胞对刺激的响应的方法，该方法包括按照本文所述的方法体外培养脂肪细胞；将刺激引入到所述基质中的脂肪细胞中；和确定所述脂肪细胞对所述刺激的响应。
合适的刺激包括药物、药物候选物、小分子、生物活性分子、肽、肽片段、脂肪酸、核酸、生长因子、分化因子、等。确定脂肪细胞响应的步骤可以包括将暴露于刺激的脂肪细胞与以相同方式培养但没有暴露于刺激的脂肪细胞进行比较。
本发明还提供研究脂肪细胞和其他细胞类型之间相互作用的方法，该方法包括按照本文所述的方法体外培养脂肪细胞；将另一种细胞类型引入到所述基质中；和确定所述脂肪细胞与其他细胞类型的相互作用。备选地，本方法可以包括按照本文所述的方法体外培养脂肪细胞，其中所述基质包含另一种细胞类型；和确定所述脂肪细胞与所述其他细胞类型的相互作用。对于这些方法之一或二者，所述其他细胞类型优选地不是内皮细胞。
本发明的又一方面提供了研究干细胞发育的方法，该方法包括将一种或多种干细胞引入到其中存在脂肪细胞的三维支持物基质中；和容许干细胞生长和分化。本方法可以替代地包括按照本文所述的方法体外培养脂肪细胞，其中所述基质包括一种或多种干细胞。在另一种变化中，本方法可以包括将一种或多种干细胞引入到其中存在前脂肪细胞的三维支持物基质中；容许所述前脂肪细胞分化为脂肪细胞；和容许干细胞生长或分化。另外的细胞类型，无论是干细胞或其他细胞，还可以存在于所述基质中。这可以帮助更加接近地模拟体内环境；例如，骨细胞可以用于模拟骨髓。
对于本文中所述的任何或所有方法，可以利用本领域已知的技术监测脂肪细胞的活性或相互作用；例如，通过免疫染色、检测基质中的生物分子、或检测从所述基质分泌到周围培养基中的分子。
附图简述
现将通过仅参考附图的实施例描述本发明的这些和其他方面，其中
图1显示开始分化后第0、7和14天时3D培养物的相差图像。分化是通过细胞中脂质小滴的累积来标记的。
发明详述
开发了这样的三维组织培养系统，其中从大鼠分离而来的前脂肪细胞能够生长和分化。以该方式产生的成熟脂肪细胞显示出这样的形态学和生物化学特征，所述特征与由体内的和离体的脂肪细胞显示的那些相似，而且与由在二维培养中生长的脂肪细胞所表现的那些不同。在我们的3D系统中培养的脂肪细胞保持生存力数周，从而容许研究短期和长期功能。
该系统提供了比传统二维培养系统与活动物更相关的微环境。
它具有若干应用范围，包括但不仅限于：
1.它能够用于单独培养脂肪细胞，并研究它们对环境刺激的响应，所述环境刺激包括生物活性分子和治疗药物；
2.它能够用于研究脂肪细胞和其他细胞类型之间的相互作用；
3.它能够用于模拟干细胞在其中发育的微环境；
4.它起到减少在包括脂肪细胞领域中的研究和开发所需要动物数量的作用。
按照从Cabrero等，2001改进而来的方法从脂肪库中分离前脂肪细胞(糖尿病(Diabetes).2001年8月；50(8)：1883-90)。该程序包括胶原酶处理和过滤，并且每克起始组织产生3-4 x 105数量级的细胞。将前脂肪细胞接种到24-孔组织培养平板中的由培养基中的I型胶原制成的三维凝胶中。在这些条件下，该胶原凝胶逐渐与容器壁粘连，从而最小化收缩。当所述凝胶固定时，前脂肪细胞混悬在该3D凝胶基质中。利用由Cabrero等(2001)所述的分化培养基诱导它们分化为成熟脂肪细胞。一旦所述细胞进行分化，就能够为了最佳维持条件而改变培养基，并且如果需要，将其他细胞类型引入到所述凝胶中。小细胞能够在所述凝胶周围迁移(成熟脂肪细胞由于它们的大尺寸而不能)，并且能够建立起彼此间和与脂肪细胞间的结构和功能关系。
能够通过免疫化学和显微镜方法，或通过生物化学分析与或不与其他细胞一起的脂肪细胞分泌到培养基中的分子，而对它们进行原位研究。备选地，能够通过胶原酶处理从所述凝胶中释放、收集细胞，并对其进行分子分析。
方法
前脂肪细胞的分离
按照动物(科学程序)法(Animal(Scientific Procedure)Act)，1986内部繁殖和抚养动物。通过时间表1的方法处死成年(7-9个月大)雌性Sprague Dawley大鼠(200-350g)。将左侧和右侧腘脂肪库切割下来。改进了由Cabrero和同事(Cabrero等，2001)描述的方法，从而从脂肪组织中分离和分化前脂肪细胞。方法的改进包括利用5ml II型胶原酶(在具有10％牛血清清蛋白的Hanks平衡盐溶液中，4mg/ml)(西格玛-奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd)，英国)在37℃消化30分钟，并且使用200μm的细胞渗滤器去除碎片，并从包含前脂肪细胞的脂肪组织中分离混合的细胞。用无核糖核苷或脱氧核糖核苷并且具有glutaMAX-I(Gibco，Invitrogen有限公司，英国)的极限基本培养基-α(Minimal EssentialMedium-α，MEM-α)培养分离的细胞，所述极限基本培养基-α增补了5％热-失活胎牛血清(HI-FBS)(Gibco，Invitrogen有限公司，英国)和140U/ml青霉素和链霉素(P/S)，通过在2D培养中的分化(通过油红O染色评估的)判定，分离的细胞中的60-70％是前脂肪细胞。
分离后的细胞生存力
如通过流式细胞计数或锥虫蓝排除所评估地，分离的细胞中的大约80％是能存活的。
三维胶原凝胶培养系统
胶原凝胶由在冰上的1.8mg/ml大鼠尾部I型胶原(第一链接有限公司(First Link Ltd)，英国)、5％ MEM x 10(Gibco，Invitrogen有限公司，英国)和5％ MEM-α(含有5％ FBS和140U/ml P/S)组成。将无菌过滤的1mol1-1NaOH溶液的增加量加入到凝胶混合物中，直到观察到指示pH变化的颜色变化(从黄色到深粉色)。将含有1 x 105个能存活细胞的等分试样接种到1ml胶原中，并且为了容易去除胶原凝胶而将其涂布到包含13mm盖玻片的24孔板(Alana Ecology，英国)的孔底部。容许所述凝胶在37℃静置于具有5％ CO2和95％空气的湿润培养箱中15-20分钟。当凝胶固定时，在每个孔中覆盖1ml MEM-α培养基，并将培养物保持在培养箱中。在接种的3小时内，如下文所述地诱导了分化。
前脂肪细胞的分化
通过添加增补了异丁基甲基黄嘌呤(0.5mmol/l)、地塞米松(0.25μmol/l)和胰岛素(10μg/ml)的MEM-α而诱导分化。48小时后，除去诱导培养基，并更换为增补了10μg/ml胰岛素的MEM-α(含有5％FBS和140U/ml P/S)。每两天对培养物进行补充，每次更换50％的培养基。如通过利用标准方法(Bancroft，John和Stevens，1990)对分化的细胞的形态学特征和油红O染色所评估地，认为细胞在第14天分化。利用尼康Microphot-FX显微镜(尼康英国有限公司(Nikon UK limited)，Kingstonupon Thames，英国)观察细胞。
试验结果
结果显示在图1中。这给出了开始分化后第0、7和14天时的3D培养物的相差图像。分化是通过细胞中脂质小滴的累积来标记的。能够看到该方案允许前脂肪细胞分化为脂肪细胞，其在所述三维培养中似乎在形态学上是正常的。
Claims (28)
1.用于在体外培养脂肪细胞的方法，所述方法包括
将离体的前脂肪细胞引入到三维支持物基质中；和
容许所述前脂肪细胞在所述支持物基质中体外分化为脂肪细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述基质是胶原基质。
3.权利要求2的方法，其中所述基质是I型胶原基质。
4.权利要求1的方法，其中所述基质包括水凝胶型物质。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述将前脂肪细胞引入到所述基质中的步骤包括将前脂肪细胞接种到处于流体形式的基质前体中，和容许所述基质前体固化形成所述基质。
6.前述权利要求中任一项的方法，还包括从脂肪组织中分离前脂肪细胞，从而引入到所述基质中的步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述分离步骤包括用胶原酶消化脂肪组织，和将前脂肪细胞和脂肪组织中的其他成分分开。
8.前述权利要求中任一项的方法，其还包括将一种或多种分化因子引入到所述基质中的步骤，从而引起所述前脂肪细胞分化为脂肪细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述分化因子是与引入所述前脂肪细胞同时引入的。
10.权利要求8的方法，其中将所述分化因子引入到处于流体形式的基质前体中，并且容许所述前体固化形成所述基质。
11.权利要求8的方法，其中通过使所述基质与包含所述因子的液体溶液相接触，将所述分化因子引入到所述基质中。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述分化因子包括葡萄糖、环化AMP诱导物、糖皮质素或糖皮质素类似物、胰岛素或胰岛素类似物、和PPARγ激动剂或RXR激动剂之一。
13.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述分化因子包括异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、和胰岛素之一。
14.权利要求8-13中任一项的方法，其还包括用另一种培养基更换所述基质中的分化因子的步骤。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中可以将另外的细胞类型引入到所述基质中。
16.权利要求15的方法，其中所述另外的细胞类型不包括内皮细胞。
17.前述权利要求中任一项的方法，其还包括从所述基质中释放所述分化的脂肪细胞的步骤。
18.其中存在脂肪细胞的三维支持物基质，在所述基质中，所述脂肪细胞是通过离体的前脂肪细胞的体外分化而获得的。
19.权利要求18的方法，其中所述基质不包含内皮细胞。
20.研究脂肪细胞对刺激的响应的方法，所述方法包括按照权利要求1-17中任一项的方法体外培养脂肪细胞；将刺激引入到在基质中的脂肪细胞中；和确定所述脂肪细胞对所述刺激的响应。
21.权利要求20的方法，其中所述刺激是选自包括药物、药物候选物、小分子、生物活性分子、肽、肽片段、脂肪酸、核酸、生长因子、和分化因子的组中的一项。
22.权利要求20或21的方法，其中所述确定所述脂肪细胞响应的步骤包括将暴露于所述刺激的脂肪细胞与以相同方式培养但没有暴露于所述刺激的脂肪细胞进行比较。
23.研究脂肪细胞和其他细胞类型之间相互作用的方法，所述方法包括按照权利要求1-17中任一项的方法体外培养脂肪细胞；将另一种细胞类型引入到所述基质中；和确定所述脂肪细胞与所述其他细胞类型的相互作用。
24.研究脂肪细胞和其他细胞类型之间相互作用的方法，所述方法包括按照权利要求1-17中任一项的方法体外培养脂肪细胞，其中所述基质包含另一种或另外数种细胞类型；和确定所述脂肪细胞与其他细胞类型的相互作用。
25.权利要求23或24的方法，其中所述其他细胞类型不是内皮细胞。
26.研究干细胞发育的方法，所述方法包括按照权利要求1-17中任一项的方法体外培养脂肪细胞，其中所述基质包含一种或多种干细胞。
27.研究干细胞发育的方法，所述方法包括将一种或多种干细胞引入到其中存在前脂肪细胞的三维支持物基质中；容许所述前脂肪细胞分化为脂肪细胞；和容许所述干细胞生长或分化。
28.权利要求26或27中任一项的方法，其中所述基质包含另一种或另外数种细胞类型。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090603 |