KR100539371B1 - 인체 세포의 체외배양 방법 - Google Patents

인체 세포의 체외배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체에서 채취한 전구세포(stem cell)를 인체에 이식할 수 있는 고체 소재로서 각 입자의 크기가 20 ~ 250㎛이고 내부에 미세기포를 갖는 스펀지 구조의 입자로 이루어진 배양용 배지에 배양함으로써 상기 배양용 배지를 배양된 전구세포와 함께 인체 내에 주입할 수 있도록 하여 상기 배양용 배지가 인체 내에 주입하는 전구세포의 전달체로 사용할 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법에 관한 것이다.

Description

인체 세포의 체외배양 방법 {In vitro cultured human preadipocyte for human soft tissue volume replacement with injectable material as a scaffold}
본 발명은 전구세포를 체외에서 배양하여 신체 부위에 주사로서 이식할 수 있도록 배양하는 인체 세포의 체외배양 방법에 관한 것이며, 상세히는 미세기포 구조를 가지며 주사바늘을 통과할 수 있는 크기의 안전성이 입증된 스펀지 구조의 고체 입자로 배양용 배지를 구성하여 인체에서 채취한 전구세포를 배양함으로써 이를 인체내에 주사제로서 주입할 수 있도록 하는 인체 세포의 체외 배양 방법에 관한 것이다.
신체의 부피 대체는 인체의 연부조직 결손과 미용목적으로 신체의 연부조직을 증대시키거나 피부의 주름제거와 같은 목적을 위해 시술되었다.
연부 조직의 증대에 관한 기존의 방법들은 연부조직 증대를 원하는 부위에 직접 절개를 가하고 자가 피부지방조직이나 지방조직을 이식하는 방법; 동종진피, 동종 혹은 이종 콜라겐, 인공합성물질, 자가 지방조직을 잘게 부수어 굵은 주사바늘로 주입하는 방법들이 있다.
그러나 이러한 방법들 중 전자의 방법, 즉 연부조직 증대부위에 절개를 하는 것은 공 여부나 수술부위 두 군데 모두에 절개 흉이 크게 남게 되는 등 미용상으로 적합하지 못하여 거의 사용되지 않고 있으며, 후자의 방법 중 동종진피, 동종 또는 이종 콜라겐, 인공 합성물질을 주입하는 방법은 영구적이지 못하여 1년 이내 흡수되어 지속적으로 주입해야 하는 단점이 있고, 재료비용이 매우 비싸 소량의 증대에 주로 사용하며 다량의 주입에는 거의 사용하지 못하고 있다.
주사로서 자가 지방을 직접 이식하는 것 역시 흡수율이 매우 높고 채취량이 많이 필요한 경우 지방이 적은 사람은 같은 양 이상을 공 여부에서 채취해야 하기 때문에 공 여부의 형태변형을 초래하고 많은 양을 얻기 위한 공 여부를 찾기 어려워 시행이 불가능하였다.
특히 최근 지방이식에 영구적인 볼륨을 유지시키는 것은 지방세포가 아닌 지방전구세포라는 것이 밝혀지면서 지방전구세포의 배양이 연부조직의 결손의 치료에 중요 열쇠가 되고 있다.
본 발명은 연부조직의 결손치료나 미용 목적으로 체내에 주입되는 생체물질을 경제적으로 대량 확보할 수 있고, 주사로서 체내 주입이 가능함으로써 부피 대체 수술을 용이하게 하고 안전하게 할 수 있도록 할 목적으로 안출된 것이다.또한, 본 발명은 종래의 부피 대체 수술에서 많은 지방세포를 얻기 위해서 공 여부를 길게 절개하는 데 따른 절개 흉과 변형, 공 여부 확보의 제한성, 수술 부위에 절개 흉이 많이 남아 미용을 해치는 문제점, 주입된 재료에 있어서도 1년 이내에 흡수되는 문제와 많은 양의 볼륨 증대시 고가의 주입재료가 많이 사용되는 등의 제 문제점을 해소할 목적을 갖는다.
이를 위하여 본 발명은 체외에서 배양 증식하여 대량의 전구세포를 얻을 수 있는 방법을 제시하고, 동시에 배양용 배지도 전구세포와 함께 체내에 주입 가능하도록 하여 배양용 배지가 세포 전달체로서의 작용을 할 수 있도록 하며, 체내 주입시 주사에 의해 주입 가능하도록 하는 전구세포의 체외 배양 방법을 제시하고자 한다. 본 발명은 인체에서 채취한 전구세포(stem cell)를 인체에 이식할 수 있는 고체 소재로서 각 입자의 크기가 20 ~ 250㎛, 바람직하게는 20 ~ 100㎛이고, 내부에 미세기포를 갖는 스펀지 구조의 입자로 이루어진 배양용 배지에 배양함으로써 상기 배양용 배지를 배양된 전구세포와 함께 주사제로서 인체 내에 주입할 수 있는 상태로 체외배양 하는 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법이다.
상기에서 인체로부터 채취하는 전구세포는 겨드랑이나 배꼽주위, 엉덩이 부위에서 1cm 정도의 작은 절개로 소량의 지방을 채취하여 배양하기 때문에 공 여부의 절개 흉의 단점을 극복할 수 있다.
스펀지 구조는 세포의 배양에 매우 유용한 구조로서 일반적인 세포배양에 사용되고 있다.
고체소재의 스펀지 구조는 각 입자의 크기가 20-250㎛로 제한됨으로써 주사바늘을 통과할 수 있고, 대식세포에 의해 탐식 당하지 않는 크기가 된다.
고체 소재의 스펀지구조로 적용 가능한 소재로서 키토산 스펀지가루 및 폴리 에틸린(polyethylene), PTFE 입자( polytetrafluoroethyelene), PLGA입자(DL-lactic-co-glycolic acid),동종진피조직 가루 등이 있다.
이들 고체 소재는 삼 차원적 세포배양시 지지구조물(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier) 역할을 수행하는 것으로 생체 외 배양조건하에서 배양이 이루어지고, 배양된 세포는 세포지지구조물 내로 주입되고 인체에 주사가능한 상태로 배양액, 세럼, 식염수 등의 액체와 혼합된다.
키토산은 N-acetylglucoseamine이라는 기본구조가 반복되어 이루어진 구조물로 생체 적합성, 생분해성, 지혈작용, 상처 치유능 등이 밝혀지면서 생체 의학에 이용되어 약물운반체, 항암제, 지혈제, 상처 치유물질로 이용되고 있다.
이러한 미세기포를 가진 스펀지구조는 생체 분해 정도의 조절이 용이하고 세포의 친화성이 높아 세포 지지구조물로 보다 적합한 특성이 있다.
이 밖에도 폴리 에틸린(polyethylene)중 POREX회사에서 제작한 메드포어는 다공성 폴리에틸린으로 판이나 블록의 형태로 연골이나 뼈의 대체물질로 사용하는 것으로 이를 미세가루로 제작하여 키토산 스펀지 가루 대용으로 사용할 수 있다.
PTFE 입자(폴리테트라플루오르에틸렌,polytetrafluoroethyelene)는 외과용 인조혈관으로 주로 사용하고 있고, GORE 회사에서 expanded PTFE를 제작하였는데 이는 매우 작은 미세구멍으로 이루어져 이 역시 판이나 블록의 형태로 인체에 삽입하여 사용하고 있으며, 이 미세구멍으로 조직이나 혈관이 자라 들어갈 수 있게 한 것으로 이 역시 미세가루로 제작하여 키토산 스펀지 가루 대용으로 사용할 수 있다.
PLGA입자(DL-lactic-co-glycolic acid)는 PLA(DL-lactic-co acid)와 함께 혼합물로 인체의 삽입물로 사용되고 있으며 형태는 스펀지 구조의 판으로 제작하여 사용되고 있고, 이 또한, 미세가루로 제작하여 키토산 스펀지 가루 대용으로 사용할 수 있다.동종 진피조직은 인간 사체의 피부조직을 분리하여 면역성을 없애는 과정을 거친 제품으로서 진피의 섬유성 미세구조가 그대로 보존되어 있고 인체에 이식되어 연부조직 대체를 위한 소재로서 다양하게 사용되고 있다. 이중 건조된 미세 분말 형태로서 액체와 혼합하면 주사로서 이식되는 제품도 사용되고 있다. 대표적인 상품으로서 미국 Life Cell사의 Cymetra가 있다.
동종진피조직의 판 형태(Life Cell사의 Alloderm)에는 여러 가지 세포의 배양과 이식이 시도되어왔으나 주사를 위한 분말 형태에는 어떠한 형태의 세포도 배양하여 이식하려는 시도가 없었다.상기에서, 고체소재는 배양용 배지(culture mateial)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)로서 체내에 이식 가능한 물질이고, 배양용 소재가 단기적 부피 효과가 있고 배양의 용이성과 생존확률이 높다는 측면에서 고체 스펀지 가루에 배양하여 주사하는 것이 가장 유리한 조건을 제공한다.
그러나 과정의 단순화라는 측면으로 볼 때 고체 지지물에서 배양 및 이동 매개체를 이용하지 않고 경우에 따라 지방전구세포를 채취하고, 이를 배양하거나 배양과정 없이 잘게 썰어 인체에 부피 대체 목적으로 직접 주사 이식하는 방법도 충분히 강구될 수 있다.
상기한 방법은 예외적인 것으로 고체 입자가 아닌 상태의 평면 또는 3차원 체외 배양된 지방 전구세포의 부피 대체용 인체 주사 이식을 통하여 단기적 부피효과보다는 지방전구세포가 지방세포로 분화되어 부피가 증대되는 장기적 효과를 얻고자 하는 경우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 적용가능한 세포로 지방전구세포(preadipocyte)와, 연골모세포(chondroblast), 골 모세포(osteoblast)가 있다.
지방전구세포(preadipocyte)는 지방세포의 전단계 세포로 알려져 있으며 성장, 분화하여 지방세포로 된다.
지방이식과정에서 지방세포는 없어지고 실제로 살아남는 것은 지방전구세포에서 분화된 지방세포이기 때문에 이식시 가장 중요한 세포이다.
최근 지방전구세포를 적절한 환경으로 만들어 주면 골세포나 연골세포로 분화하는 특징을 가진 모세포로서의 기능이 있음이 알려지면서 더욱 중요시되고 있다.
연골 모세포(chondroblast)는 성장, 분화하여 연골세포로 되는 특징이 있으며 인체에서 필요한 곳은 매우 많지만 얻을 수 있는 양이 매우 제한되어 있고 공 여부에서 소량만을 얻어 사용해야 공 여부의 합병증을 일으키지 않는다는 점이 문제가 되고 있었다.
그러한 의미에서 소량을 얻어 삼차원 증식하여 인체에 이식 후 다량 부피의 연골을 얻을 수 있다면 인체의 부피 증대뿐만 아니라 인체에 필요한 기관, 즉 재건에 필요한 관절의 연골이나 귀 연골, 코 연골을 만들 수 있다는 장점이 있다.
골 모세포(osteoblast)는 인체에 뼈를 생성하는 모세포로 이를 공 여부에서 소량 얻은 후 배양, 증식하여 세포 지지구조물에 주입 후 인체에 다시 이식하면 다량의 뼈를 얻을 수 있다.
이상에서와 같은 본 발명은 볼륨을 유지시키기 위해 필요한 세포를 인체로부터 채취하여 대량으로 주사제로서 인체에 주입할 수 있는 형태로 배양 증식시키는 방법으로서 종래의 단순 배양 주사의 경우 부피 증가 효과가 미흡하여 볼륨을 대치하는 데 어려움이 있었으나 세포를 배양한 공간(배지) 자체를 세포와 함께 이식함으로써 세포의 생존율을 극대화할 수 있는 장점을 갖는다.
즉, 주사로서 배양된 세포만을 이식하는 시도는 지방세포는 아니더라도 시도되어왔는데 지방전구세포의 경우는 세포의 부피가 커져 지방세포가 되기 위해서는 세포가 자랄 수 있는 공간이 필요하며, 본 발명은 인체에 주입하는 세포를 삼차원 배지에 의해 배양하고, 배지와 함께 배양된 세포를 인체에 주입함으로써 가장 효과적인 볼륨의 증대 수술이 가능해진다.
또한, 본 발명은 볼륨증대를 위한 가장 좋은 방법으로서 지방세포가 아닌 지방전구세포를 배양하여 삼 차원적 공간에서 성장 분화할 수 있는 틀, 다시 말하면 지지구조물 안에 주입하여 주사제로서 인체 내에 이식하는 환경을 제공함을 특징적인 구성으로 하는 것이다.
이러한 지지구조물의 형태 역시 많은 연구를 통하여 얻어진 성과로서 미세기포구조를 가진 스펀지 구조가 사용된 것이며, 성장과 분화가 필요한 세포에 가장 적절한 영양공급을 해줄 수 있는 것이다.
일반적으로 세포배양에 많이 사용되는 연골 모세포와 골 모세포의 경우에는 세포배양시 큰 영양이 필요하지 않았지만 지방전구세포의 경우에는 세포배양시 큰 영양이 필요하여 삼 차원적으로 배양하기 위해서는 이러한 미세기포를 가진 스펀지 구조가 더욱 절실히 요구된다.
삭제
이상의 구성에 의한 본 발명은 가장 간단한 형태로서 지방전구세포를 채취하고, 이를 배양하거나 배양과정 없이 잘게 썰어 인체에 부피 대체 목적으로 직접 주사 이식하는 방법뿐만 아니라 키토산 스펀지가루 및 폴리 에틸린(polyethylene), PTFE입자(polytetrafluoroethyelene), PLGA입자(DL-lactic-co-glycolic acid),동종(인간)진피조직과 같은 지지구조물을 사용하고, 지지구조물의 형태를 가는 주사바늘로 주입할 수 있는 미세 기포구조의 형태로 한 후 여기에 배양된 지방전구세포를 분주하여 미세 기포구조를 가진 지지물과 지방전구세포를 함께 주사형태로 주입할 수 있도록 하는 새로운 형태의 부피 대체 방법이 가능함으로써 고체 입자가 아닌 상태의 평면 또는 3차원 체외 배양된 지방 전구세포의 부피 대체용 인체 주사 이식을 통하여 단기적 부피효과보다는 지방전구세포가 지방세포로 분화되어 부피가 증대되는 장기적 효과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 지방전구세포 또는 연골세포를 체내 이식 후 부피증가 효과에 대한 다양한 실험과 정확히 그 부피증가 비율을 계산하여 이용함으로써 여러 가지 미용상 효과를 창출할 수 있는 효과도 있으며, 기존의 미용상 효과 면에서 절개 흉이라는 최대의 단점을 보완할 수 있고, 시술이 용이하며, 경제적인 시술을 달성할 수 있다.
삭제

Claims (10)

  1. 지방전구세포(preadipocyte), 연골 모세포(chondroblast), 골 모세포(osteoblast)와 같은 전구세포(stem cell)를 인체에서 채취하여 이를 배양용 배지(culture material)에 체외배양 함에 있어서, 상기 배양용 배지(culture material)는 고체 소재로서 각 입자의 크기가 20 ~ 100㎛이고 내부에 미세기포를 갖는 스펀지 구조의 입자로 구성함으로써 상기한 배양용 배지가 전구세포의 배양용 배지를 구성하면서 동시에 주사제로서 인체 내에 주입되는 세포 전달체(cell carrier)를 구성하도록 한 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 키토산 스펀지 가루인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법.
  6. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 동종진피조직 가루인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법.
  7. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 다공성 폴리에틸린(Poyethylene) 가루인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 PTFE(polytetrafluoroethyelene) 가루인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양 방법.
  9. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material)이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 PLGA입자(DL-lactic-co-glycolic acid) 분말인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양방법.
  10. 제1항에 있어서, 배양용 배지(culture material) 이며 동시에 세포 전달체(cell carrier)를 구성하는 미세기포를 갖는 스펀지구조의 입자는 PLA(DL-lactic-co acid) 분말인 것을 특징으로 하는 인체 세포의 체외배양방법.
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