KR102434403B1 - 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 조성물을 이용한 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드 - Google Patents

동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 조성물을 이용한 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 A) 유리연골(hyaline cartilage)을 준비하는 단계; B) 상기 유리 연골을 동결건조 및 분쇄하여, 동결건조 유리연골 파우더를 제조하는 단계; C) 자가 지방 조직으로부터 지방 조직 추출물을 제조하는 단계; 및 D) 상기 동결건조 유리연골 파우더 및 상기 지방 조직 추출물을 포함하는 연골 재생용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물에 관한 것이다.

Description

동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 조성물을 이용한 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드{MANUFACTURING METHOD OF COMPOSITION FOR CARTILAGE REGENERATION USING LYOPHILIZATION HYALINE CARTILAGE POWDER, COMPOSITION FOR CARTILAGE REGENERATION MANUFACTURED BY THE SAME, MANUFACTURING METHOD OF PATIENT CUSTOMIZED SCAFFOLD FOR CARTILAGE REGENERATION USING THE COMPOSITION FOR CARTILAGE REGENERATION, AND PATIENT CUSTOMIZED SCAFFOLD FOR CARTILAGE REGENERATION}
본 명세서는 2019년 3월 11일에 한국특허청에 제출된 한국 특허 출원 제 10-2019-0027705호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 명세서에 포함된다.
본 명세서는 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 조성물을 이용한 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드에 관한 것이다.
인체에서 뼈와 뼈가 만나는 경첩부위는 유리 연골(hyaline cartilage)로 이루어진 관절 연골(articular cartilage)이 서로 맞닿아 내압력과 인장력을 행사하며, 각 관절은 관절 주머니(synovial capsule)가 활액 (synovial fluid)을 머금고 있어 관절 운동에 의한 마찰력을 감소시키는 형태를 가진다.
관절 연골의 퇴행성 변화의 원인은 아직 규명되어 있지는 않지만, 연골세포 수의 절대적 감소와 연골세포(chondrocytes)에서 일어나는 연골기질 합성과 분해의 불균형이 하나의 원인으로 알려져 있다. 따라서, 관절 연골의 퇴행성 변화는 연골기질의 분해로 인하여 연골 강도와 쿠션으로서의 능력이 감소된다.
기존 세포 치료제들은 이식된 세포가 중력에 의해 한 방향으로 쏠리기 때문에 결손 부위에 균등하게 분포되기 어려운 단점이 있으며, 세포 생착의 어려움이 있어 연골 결손부의 세포 재생을 감소시킨다. 또한, 자가 연골세포 이식술 및 줄기세포 이식술의 경우엔 조직을 추출한 후 배양과정을 거쳐 환자에게 적용되므로 2번의 수술이 필요하며, 약 4주간의 세포 배양기간 또는 조작을 필요로 한다. 아울러, 이식된 세포가 중력에 의해 결손 부위에 균등하게 분포 및 생착 되기 어렵고, 초자연골의 분화가 아닌 섬유연골로의 분화가 유도되어 추후에 연골이 잘 부서지는 현상이 생기는 문제가 있다. 그러므로, 연골 결손부의 세포 재생을 효과적으로 수행할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
KR 특허 공개 공보 10-2017-0012099
본 발명은 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 조성물을 이용한 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법 및 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제공하고자 한다. 나아가, 상기 연골 재생용 조성물을 이용한 연골 재생용 의료 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시상태는, A) 유리연골(hyaline cartilage)을 준비하는 단계; B) 상기 유리 연골을 동결건조 및 분쇄하여, 동결건조 유리연골 파우더를 제조하는 단계; C) 자가 지방 조직으로부터 지방 조직 추출물을 제조하는 단계; 및 D) 상기 동결건조 유리연골 파우더 및 상기 지방 조직 추출물을 포함하는 연골 재생용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시상태는, 상기 제조방법을 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, a) 3D 스캐너를 이용하여, 결손된 연골 부위의 3차원 데이터를 수득하고, 3D 프린터를 이용하여 스캐폴드용 몰드를 제조하는 단계; b) 상기 따른 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물에 피브리노겐을 혼합하여 제1 액을 제조하고, 이를 이용하여 상기 스캐폴드용 몰드 내에 도포하여 제1 층을 형성하는 단계; c) 트롬빈을 포함하는 제2 액을 상기 제1 층 상에 도포하여 제2 층을 형성하는 단계; 및 d) 상기 제1 층 및 상기 제2 층이 반응하여, 연골 재생용 스캐폴드를 형성하는 단계;를 포함하는, 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법을 이용하여 제조된, 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 연골 재생용 조성물이 인체 주입용 주사기에 충전되어 있는 연골재생용 의료 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 연골 재생용 조성물을 결손된 연골 부위에 주입하는 단계를 포함하는, 결손 연골의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 손상 연골 재생을 위한 시술 시 즉석에서 손쉽게 제조하여 적용할 수 있는 장점이 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 동결건조 유리 연골 파우더를 사용하므로, 상온에서 동결건조 유리 연골 파우더를 보관하다가 시술 시 환자로부터 지방조직 유래 기질혈관분획을 수득하여 즉석에서 연골 재생용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드 또는 이를 직접 연골의 결손 부위에 주입하여 연골의 재생을 촉진할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법은 수술실에서 환부의 연골 결손부를 3D 스캐닝하여 바로 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제조할 수 있으므로, 한번의 수술 과정을 통하여 스캐폴드를 이식할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 이해될 수 있다.
도 1은 비교예 1에 따른 유리연골 조직 및 이를 파우더화한 결과에 대한 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에 따른 동결건조된 유리연골 조직 및 파우더화한 결과에 대한 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 비교예 1 및 실시예 1에 따른 유리연골 파우더의 입자 크기를 각각 조절하여 제조한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에 따른 4주 및 12주 이후의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 2 및 비교 실험예에 따른 MRI 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는, A) 유리연골(hyaline cartilage)을 준비하는 단계; B) 상기 유리 연골을 동결건조 및 분쇄하여, 동결건조 유리연골 파우더를 제조하는 단계; C) 자가 지방 조직으로부터 지방 조직 추출물을 제조하는 단계; 및 D) 상기 동결건조 유리연골 파우더 및 상기 지방 조직 추출물을 포함하는 연골 재생용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 유리연골은 시술 대상과 동종 또는 이종의 유리연골로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유리 연골은 시술 대상과 동종의 유리연골로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 연골 시술 대상이 사람인 경우, 사람의 유리연골로부터 추출된 유리연골 파우더를 사용할 수 있다. 또한, 연골 시술 대상이 동물인 경우, 같은 종의 동물의 유리연골로부터 추출된 유리연골 파우더를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 유리연골은 갈비 연골(costal cartilage)로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 연골 재생용 조성물을 이용한 시술 대상이 사람인 경우, 상기 유리연골은 사람의 갈비 연골로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 연골 재생용 조성물을 이용한 시술 대상이 동물인 경우, 상기 유리연골은 시술 대상인 동물과 같은 종의 갈비 연골로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 유리연골은 시중에 판매되는 동종 이계의 늑골 연골(allogenic costal cartilage)을 이용할 수 있다.
상기 동결건조 유리연골 파우더는 유리연골을 동결건조한 후 이를 분쇄하여 수득할 수 있다. 또는 상기 동결건조 유리연골 파우더는 유리연골을 동결건조함과 동시에 분쇄하여 수득할 수 있다. 상기 동결건조는 당업계에서 일반적으로 수행되는 동결건조법을 이용할 수 있다. 또한, 상기 분쇄는 예를 들어 볼밀법을 이용하여 원하는 직경의 입자로 미분화할 수 있다. 상기 유리연골을 분쇄하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니며, 목적하는 직경의 입자를 얻을 수 있는 방법이라면 제한없이 적용될 수 있다.
상기 동결건조 유리연골 파우더는 상기 연골 재생용 조성물이 결손된 연골 조직에 적용되는 경우, 연골 재생용 조성물로부터 유래된 임플란트 또는 스캐폴드의 지지체의 구성 요소가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 동결건조 유리연골 파우더는 생체 접합제에 의하여 서로 결합되어 결손 연골 부위 내에서 임플란트 또는 스캐폴드를 형성할 수 있다.
상기 동결건조 유리연골 파우더는 별도로 온도, 습도 등을 조절하지 않고 보관할 수 있는 장점이 있다. 이와 같은 동결건조 유리연골 파우더를 이용함으로써, 상기 연골 재생용 조성물은 환자로부터 지방 조직 추출물을 추출한 후 즉시 제조하기 수월한 장점이 있다. 즉, 일반적인 유리연골 파우더의 경우에는 저온 조건에서 보관하여야 하므로 보관 비용이 발생할 수 있으며, 또한 지방 조직 추출물과 혼합하기 위하여는 적절한 온도로 상승할 때까지 기다려야 하는 경우가 발생할 수 있다. 이에 반하여, 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물은 동결건조 유리연골 파우더를 사용하므로, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 이점이 있다.
또한, 상기 동결건조 유리연골 파우더는 수분 함량을 최소화하여, 입자 크기의 균일도가 매우 높으며, 입자간 뭉침을 최소화할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 일반적인 유리연골을 미분화하는 경우 유리연골 내의 수분에 의하여 분쇄가 고르게 이루어지지 않을 수 있고, 또한 분쇄된 입자간 뭉침이 발생하여, 이를 이용한 주사기 또는 (3D) 프린터기의 노즐이 막히는 문제가 있을 수 있다. 나아가 일반적인 유리연골 파우더는 뭉친 입자로 인하여, 환부에 적용 시 고른 효과를 발현하지 못하거나, 부작용이 발생할 수도 있다.
상기 동결건조 유리연골 파우더는 연골 재생 관련 성장인자를 배출하여, 상기 지방 조직 추출물이 연골 세포로 분화되는 것을 유도할 수 있다. 나아가, 상기 동결건조 유리연골 파우더에 포함되는 단백질은 환부의 연골 재생이 활발하게 이루어지도록 돕는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 동결건조 유리연골 파우더의 입경은 30 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 동결건조 유리연골 파우더의 평균 입경이 상기 범위 내인 경우 연골 세포의 분화 및 재생이 효과적으로 이루어지는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 동결건조 유리연골 파우더의 농도는 0.005 %(w/v) 내지 0.1 %(w/v)일 수 있다. 즉, 상기 동결건조 유리연골 파우더는 상기 연골 재생용 조성물 1 ㎖ 당 0.005 g 내지 0.1 g으로 포함될 수 있다. 상기 동결건조 유리연골 파우더의 농도는 바람직하게는 0.005 %(w/v) 내지 0.07 %(w/v), 보다 바람직하게는 0.005 %(w/v) 내지 0.03 %(w/v), 가장 바람직하게는 0.007 %(w/v) 내지 0.03 %(w/v)일 수 있다. 상기 동결건조 유리연골 파우더의 농도가 상기 범위 내인 경우, 상기 연골 재생용 조성물을 이용하여 제조된 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제조하여 이식하거나, 상기 연골 재생용 조성물을 환부에 주입하여 임플란트를 형성 시, 연골 세포의 생존성, 연골 세포로의 분화 및 모폴로지가 가장 우수하게 구현될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 지방 조직 추출물은 자가 지방 조직으로부터 분리된 기질혈관분획(stromal vascular fraction)을 포함할 수 있다. 즉, 상기 지방 조직 추출물은 상기 지방조직 유래 기질혈관분획(adipose tissue derived stromal vascular fraction)을 포함할 수 있으며, 이는 지방조직 유래 줄기세포(adipose derived stem cells)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 지방조직 유래 기질혈관분획은 지방조직 유래 줄기세포 외의 다른 세포들(예를 들어, 지방세포, 적혈구세포 및 다른 기질세포, 등) 및 세포외 기질 물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있으며, 보다 바람직하게는 다른 세포들 및 세포외 기질 물질을 전혀 포함하지 않을 수 있다.
상기 지방 조직 추출물은 지방조직 유래 기질혈관분획은 동종 동물 또는 이종 동물의 지방조직으로부터 추출된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 지방 조직 추출물 내의 상기 지방조직 유래 기질 혈관 분획은 동종 동물 또는 이종 동물의 지방조직으로부터 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 지방 조직 추출물은 자가 유래 지방조직으로부터 추출된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 지방 조직 추출물은 시술 대상인 환자 또는 동물의 지방조직을 이용하여 추출된 것일 수 있다. 상기 지방 조직 추출물 (또는 이에 포함된 지방조직 유래 기질혈관분획)은 지방조직으로부터 지방조직 유래 기질혈관분획(SVF)와 세포외기질(ECM) 등을 미세 클러스터(micro or nano SVF/ECM Cluster)의 형태 추출하여 수득할 수 있으며, 필요에 따라 순수한 지방조직 유래 기질혈관분획(SVF)과 세포외기질(ECM)을 따로 분리하여 사용할 수도 있다. 일 예로, Tiss'you사의 Lipocell 키트를 이용하여, 지방조직으로부터 추출된 것 또는 nanofat으로 알려진 지방조직 유래 추출물일 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 지방조직 유래 기질혈관분획은 당 업계에 알려진 방법 및 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 C) 단계는,
C1) 2 ㎜ 내지 3 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터를 이용하여, 자가 지방 조직 내의 섬유질을 제거하는 단계; C2) 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을, 450 ㎛ 내지 550 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터에 순차적으로 통과시킨 후, 이의 여과물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태에 따르면, 상기 C) 단계는,
C1) 2 ㎜ 내지 3 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터를 이용하여, 자가 지방 조직 내의 섬유질을 제거하는 단계; C2) 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을, 450 ㎛ 내지 550 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터에 순차적으로 통과시켜, 자가 지방 조직을 분쇄하는 단계; 및 C3) 상기 분쇄된 자가 지방 조직을 25 ㎛ 내지 75 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제4 필터를 통하여 거른 후, 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
즉, 상기 지방 조직 추출물은 상기 제3 필터를 통과한 여과물을 이용할 수도 있고, 또는 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 이용할 수 있다.
상기 C1) 단계는 공경의 직경이 상대적으로 큰 제1 필터를 이용하여, 추출된 자가 지방 조직 내의 섬유질을 제거하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 C1) 단계에서의 상기 제1 필터는 스테인레스 재질의 시린지 필터일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 필터는 강도 높은 스테일레스 재질의 필터부를 가지고 있어, 상기 자가 지방 조직으로부터 섬유질을 효과적으로 분리시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 C1) 단계는 상기 제1 필터의 양 단에 주사기를 장착한 후, 주사기의 피스톤 운동을 이용하여 추출된 자가 지방 조직을 2회 이상, 구체적으로 2 내지 3회 상기 제1 필터를 통과시키는 것일 수 있다. 상기 C1) 단계의 경우, 1차적으로 자가 지방 조직 내의 섬유질을 걸러내어, 보다 효과적이며 빠른 시간 내에 자가 지방 조직의 분쇄가 이루어지도록 할 수 있다.
상기 C2) 단계는 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을 상기 제2 필터에 통과시켜 자가 지방 조직을 분쇄시키고, 이의 여과물을 상기 제3 필터에 통과시켜 추가적으로 자가 지방 조직을 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 C2) 단계는 필터 백(filter bag)에 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을 주입한 후, 이를 외부 압력을 가하여 필터에 통과시켜, 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을 분쇄하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 C2) 단계는 필터 백(filter bag)에 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을 주입한 후, 외부에서 실리콘 주걱 등과 같은 도구를 이용하여 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직이 제2 및 제3 필터를 순차적으로 통과하도록 하여, 자가 지방 조직이 분쇄되도록 하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 필터 백(filter bag)은 유연한 플라스틱 소재의 밀폐된 주머니 형상의 필터 키트로서, 일측에 주입구가 구비되고 타측에 배출구가 구비되며, 필터로 내부 공간이 분획된 형태일 수 있다.
상기 C2) 단계에서의 제2 필터 및 제3 필터의 일 예는 Tiss'you사의 Lipocell 키트의 필터 백을 변형하여 사용할 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 맞는 필터를 이용할 수 있다.
상기 C2) 단계에서와 같이 점차적으로 공경 직경이 작은 필터를 이용하여 자가 지방 조직을 분쇄하는 경우, 자가 지방 조직을 미분쇄하기 위한 시간을 크게 단축할 수 있으며, 지방 조직 추출물 내의 세포들이 높은 세포 활성을 유지할 수 있다. 구체적으로, 상기 C2) 단계를 이용하는 경우, 물리적인 방법으로 지방 조직을 미분쇄함에도 불구하고, 효과적으로 치료에 효과적인 지방 조직 및 활성 세포 및 활성 단백질을 다량 확보할 수 있는 장점이 있다. 나아가, 상기 C2) 단계를 이용하는 경우, 세포외기질 및 성장인자를 최적의 활성 상태로 수집 가능하며, 또한 (3D) 바이오 프린팅을 수행할 수 있는 물성을 갖도록 할 수 있다.
상기 C3) 단계는 상기 C2) 단계를 통하여 분쇄된 자가 지방 조직을 상기 제4 필터로 여과한 후, 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계일 수 있다. 구체적으로, 상기 C3) 단계는 상기 분쇄된 자가 지방 조직을 25 ㎛ 내지 75 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제4 필터를 통하여 거른 후, 여과물을 제거하고 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계일 수 있다. 구체적으로, 상기 C3) 단계는 상기 제4 필터에 여과된 물질을 버리고 상기 제4 필터에 포집되는 물질을 수득하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 C3) 단계는 C2) 단계를 통하여 분쇄된 자가 지방 조직을 생리 식염수와 혼합한 후, 상기 제4 필터를 이용하여 여과하여, 여과되는 물질을 분리하여 제거한 후, 상기 제4 필터에 포집되는 물질을 지방 조질 추출물로서 이용하는 것일 수 있다. 상기 여과되어 제거되는 물질은 지나치게 미분쇄되어 세포 활성이 떨어지는 지방 조직, 피, 생리 식염수 등을 포함할 수 있으며, 이는 본 발명에서 의도하는 연골 재생 활성을 방해할 수 있으므로 제거될 수 있다.
상기 C3) 단계는 필터 백(filter bag)에 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직 및 생리 식염수를 주입한 후, 상기 제4 필터에 여과되는 물질을 제거하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 C3) 단계는 필터 백(filter bag)에 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직 및 생리 식염수를 주입한 후, 적절한 압력을 가하여 상기 분쇄된 자가 지방 조직을 상기 제4 필터에 여과시키는 것일 수 있다.
상기 C3) 단계에서의 제4 필터의 일 예는 Tiss'you사의 Lipocell 키트의 필터백을 변형하여 사용할 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 맞는 필터를 이용할 수 있다.
본 발명에 따라 제조되는 상기 지방 조직 추출물은 특히 연골 재생에 필요한 성장인자(growth factor), 활성 세포 및 활성 단백질 등을 풍부하게 함유할 수 있다. 나아가, 상기 지방 조직 추출물을 이용한 바이오 프린팅 조성물(예를 들어, 제1 액)은 바이오 프린팅 과정에서 노즐이 막히지 않고, 나아가 적절한 점도를 유지하여 일정한 속도로 분출될 수 있으므로, 정밀한 바이오 프린팅이 요구되는 피부 재생 시트의 제조에 적합할 수 있다.
또한, 상기 지방 조직 추출물은 빠른 시간 내에 성장 인자 활성 세포 및 활성 단백질 등을 최대로 함유하며 추출될 수 있으므로, 보다 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 기질혈관분획의 농도는 상기 연골 재생용 조성물 1 ㎖ 당 105 개 내지 107 개일 수 있다. 상기 기질혈관분획의 함량이 상기 범위 내인 경우, 상기 연골 재생용 조성물을 이용하여 제조된 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제조하여 이식하거나, 상기 연골 재생용 조성물을 환부에 주입하여 임플란트를 형성 시, 연골 분화 능력 및 연골 재생 능력이 크게 향상될 수 있다.
상기 기질혈관분획은 상기 동결건조 유리연골 파우더와 함께 사용됨으로써, 연골 세포로 분화될 수 있다. 이에 따라, 상기 연골 재생용 조성물을 이용하여 제조된 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제조하여 이식하거나, 상기 연골 재생용 조성물을 환부에 주입하여 임플란트를 형성 시, 환부에서 연골 세포로의 분화가 활발하게 유도될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 동결건조 유리연골 파우더 5 ㎎ 내지 100 ㎎ 에 대하여, 상기 기질혈관분획의 개수는 105 내지 107 개일 수 있다. 바람직하게는, 상기 동결건조 유리연골 파우더 5 ㎎ 내지 70 ㎎ 에 대하여, 상기 기질혈관분획의 개수는 105 내지 107 개일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 동결건조 유리연골 파우더 5 ㎎ 내지 30 ㎎ 에 대하여, 상기 기질혈관분획의 개수는 105 내지 107 개일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 D) 단계는 생체용 접합제를 더 포함하여 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 생체용 접합제는 피브린 글루, 젤라틴 글루, 시아노아크릴레이트계 글루 및 폴리우레탄계 글루로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 생체용 접합제는 피브린 글루 및/또는 젤라틴 글루일 수 있으며, 보다 구체적으로 피브린 글루일 수 있다.
상기 생체용 접합제로서 피브린 글루를 적용하는 경우, 상기 연골 재생용 조성물은 생체용 접합제로서 피브리노겐을 포함하고, 트롬빈을 포함하는 별도의 조성물과 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 피브리노겐을 포함하는 상기 연골 재생용 조성물을 스캐폴드를 제조하기 위하여 도포한 후 트롬빈을 포함하는 조성물을 이용하여 스캐폴드로 고형화할 수 있다. 또는, 피브리노겐을 포함하는 상기 연골 재생용 조성물을 결손된 연골 부위에 주입하고, 트롬빈을 포함하는 조성물을 이용하여 이를 고형화하여 결손 영역 내에서 임플란트를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 연골 재생용 조성물은 피브리노겐을 포함하고, 또한 아프로티닌을 더 포함할 수 있다. 상기 아프로티닌(aprotinin)은 췌장에서 분비되는 프로틴분해효소의 억제제로서, 총 58 개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다. 주로 소의 폐에서 추출되며 혈액 속에서는 피브린의 분해를 저지하여, 지혈작용을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 피브리노겐은 상기 연골 재생용 조성물 1 ㎖ 당 65 ㎎ 내지 115 ㎎으로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 아프로티닌은 상기 연골 재생용 조성물 1 ㎖ 당 900 KIU 내지 1,100 KIU(kininogen Inactivator Unit), 구체적으로 1000 KIU로 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 연골 재생용 조성물은 1 ㎖ 당, 105 내지 107 개의 지방조직 유래 기질혈관분획, 5 ㎎ 내지 100 ㎎의 동결건조 유리연골 파우더, 65 ㎎ 내지 115 ㎎의 피브리노겐 및 900 KIU 내지 1,100 KIU의 아프로티닌을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 트롬빈을 포함하는 조성물은 염화칼슘 용액 내에 트롬빈이 분산된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 트롬빈을 포함하는 조성물은 1 ㎖ 당, 400 IU 내지 600 IU의 트롬빈, 5 ㎎ 내지 6.5 ㎎의 염화칼슘을 포함할 수 있다.
상기 연골 재생용 조성물 및 트롬빈을 포함하는 조성물의 용매는 물, 구체적으로는 생리식염수일 수 있다. 또한, 상기 연골 재생용 조성물 내의 피브리노겐과 상기 트롬빈을 포함하는 조성물 내의 트롬빈은 상용의 피브린 글루 키트를 통하여 입수할 수 있다.
본 발명의 다른 실시상태는, 상기 제조방법을 이용하여 제조된 연골 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, a) 3D 스캐너를 이용하여, 결손된 연골 부위의 3차원 데이터를 수득하고, 3D 프린터를 이용하여 스캐폴드용 몰드를 제조하는 단계; b) 상기 따른 연골 재생용 조성물에 피브리노겐을 혼합하여 제1 액을 제조하고, 이를 이용하여 상기 스캐폴드용 몰드 내에 도포하여 제1 층을 형성하는 단계; c) 트롬빈을 포함하는 제2 액을 상기 제1 층 상에 도포하여 제2 층을 형성하는 단계; 및 d) 상기 제1 층 및 상기 제2 층이 반응하여, 연골 재생용 스캐폴드를 형성하는 단계;를 포함하는, 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
a) 단계는 당업계에서 알려진 3D 스캐너 장비 및 3D 프린트 장비를 이용할 수 있다. 또한, 상기 스캐폴드용 몰드는 상기 제1 액 및 제2 액의 도포시 입체적 형태를 고정할 수 있도록 하는 역할을 할 수 있다. 상기 스캐폴드용 몰드는 상기 연골 재생용 스캐폴드 형성 후 제거될 수 있다. 상기 스캐폴드용 몰드는 당 업계에서 일반적으로 사용되는 생체 적합성 고분자를 이용하여 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, b) 단계 및 c) 단계는 잉크젯 프린팅 또는 3D 프린팅을 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, b) 단계 및 c) 단계는 당업계에서 알려진 2 이상의 노즐을 가지는 프린팅 장치를 이용할 수 있으며, 각각의 노즐에서 상기 제1 액 및 제2 액을 각각 토출하여 입체 형상을 만들 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, b) 단계 및 c) 단계는 2회 이상 교대로 반복 수행될 수 있다. 구체적으로, 부피가 큰 연골 재생용 스캐폴드의 형성이 필요한 경우, b) 단계 및 c) 단계가 교대로 수행되어, "제1 층/제2 층/제1 층/제2 층"과 같이 적층된 후 응고하여 연골 재생용 스캐폴드가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, d) 단계는 10분 이내에 완료될 수 있으며, 바람직하게는 5분 이내에 완료될 수 있다. 구체적으로, d) 단계는 3분 내지 7분 동안 반응하여 상기 제1 층 및 상기 제2 층이 반응하여, 연골 재생용 스캐폴드를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명은 피브리노겐 및 피브린으로 구성되는 피브린 글루를 접착제로 사용하며, 이는 히알루론산 접착제 또는 콜라겐 접착제보다 높은 점성을 확보할 수 있으므로, 상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드는 환부와의 우수한 접착력을 가지고, 나아가 높은 강도를 유지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법을 이용하여 제조된, 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 제공한다.
상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드는 전술한 바와 같이, 단시간 내에 결손된 연골 영역에 대응하는 형상으로 제조되어 이식될 수 있다. 상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드는 세포를 위한 배양과정을 필요로 하지 않으며, 이식 후 상기 스캐폴드 내의 지방조직 유래 기질혈관분획은 연골 세포로 분화되며, 상기 동결건조 유리연골 파우더는 연골의 재생을 활성화시키고, 재생된 연골 세포의 생존율을 높일 수 있다.
상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드는 환부에 이식되는 경우, 상기 동결건조 유리연골 파우더로부터 분비되는 초자연골(유리연골) 성장 인자 및 단백질에 의하여 연골(구체적으로는 무릎 연골) 본연의 초자연골이 재생되도록 유도할 수 있다. 이를 통하여, 상기 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드가 환부에 적용되는 경우, 효과적으로 기존의 연골과 동일 또는 유사한 상태로 회복이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 연골 재생용 조성물이 인체 주입용 주사기에 충전되어 있는 연골 재생용 의료 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 연골재생용 의료 키트는 상기 동결건조 유리연골 파우더, 상기 지방조직 유래 기질혈관분획 및 상기 생체용 접합제를 포함하는 연골 재생용 조성물이 주사기에 충전되어 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 연골재생용 의료 키트는 상기 동결건조 유리연골 파우더, 상기 지방조직 유래 기질혈관분획 및 피브리노겐을 포함하는 연골 재생용 조성물이 충전된 제1 주사기; 및 트롬빈을 포함하는 조성물이 충전된 제2 주사기;를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 제1 주사기를 이용하여 결손 연골 부위에 상기 연골 재생용 조성물을 주입한 후, 제2 주사기의 트롬빈을 포함하는 조성물을 주입하여 결손 연골 부위에 임플란트를 형성되도록 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시상태는, 상기 연골 재생용 조성물을 결손된 연골 부위에 주입하는 단계를 포함하는, 결손 연골의 치료 방법을 제공한다. 상기 결손 연골의 치료방법은 전술한 연골재생용 의료 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
기존의 자가 연골세포 이식술 및 줄기세포 이식술의 경우, 환자의 결손된 연골 영역의 조직을 추출하기 위하여 환부를 1차 절개한 후, 상기 조직의 배양 과정을 거쳐 환부에 이식하기 위한 2차 절개가 필요하여 2번의 수술과정이 필요한 문제가 있었다. 이에 반하여, 본 발명에서 제시하는 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드 및 연골재생용 의료 키트를 이용한 결손 연골의 치료 방법은 1차 절개를 통하여 결손된 연골 영역을 확인한 후, 단시간 내에 결손된 연골 영역에 대응하는 스캐폴드를 제조하여 결손된 연골 영역에 이식하거나, 직접 결손 부위에 주입하여 임플란트를 형성할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[비교예 1] - 일반적인 유리연골 파우더의 제조
수득된 유리연골 조직을 별도의 가공 없이 슬라이스 처리한 후, 볼밀을 이용하여 파우더화 하였다.
도 1은 비교예 1에 따른 유리연골 조직 및 이를 파우더화한 결과에 대한 이미지를 나타낸 것이다. 도 1에 따르면 별도의 동결건조를 하지 않은 유리연골을 파우더화하는 경우, 내부 수분에 의하여 뭉침이 발생하는 것을 확인할 수 있다.
[실시예 1] - 동결건조 유리연골 파우더의 제조
수득된 유리연골 조직을 슬라이스 처리한 후, 약 5 bar의 압력, 약 -80 ℃의 온도 및 진공에 가까운 분위기 하에서 동결 건조를 약 12시간 동안 수행한 후, 이를 볼밀을 이용하여 파우더화 하였다.
도 2는 실시예 1에 따른 동결건조된 유리연골 조직 및 파우더화한 결과에 대한 이미지를 나타낸 것이다. 도 2에 따르면, 도 1과 다르게 유리연골 파우더가 뭉치지 않고 매우 미세한 입자로 분쇄된 것을 확인할 수 있다.
즉, 비교예 1과 같이 제조된 유리연골 파우더의 경우 물침 현상으로 인하여 별도의 분산 과정이 필요한 문제가 발생할 수 있고, 프린터기의 노즐의 막힘현상이 발생할 수 있는 문제점이 있으며, 나아가 비교예 1과 같이 제조된 유리연골 파우더는 약 -20 ℃에서 냉동 보관을 하여야 하는 불편함이 존재한다. 이에 반하여 실시예 1과 같이 제조된 동결건조 유리연골 파우더의 경우에는 제조한 후 상온에서 보관하더라도 문제점이 발생하지 않으며, 이를 통하여 환자 치료 시 해동하는 과정을 생략할 수 있어 적용의 용이성이 매우 높다. 나아가, 실시예 1과 같이 제조된 동결건조 유리연골 파우더는 비교예 1과 같이 제조된 유리연골 파우더에 비하여 입자 크기의 균일성이 매우 높은 장점이 있다.
도 3은 비교예 1 및 실시예 1에 따른 유리연골 파우더의 입자 크기를 각각 조절하여 제조한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 따르면, 실시예 1과 같은 동결건조 유리연골 파우더는 비교예 1과 같은 일반적인 유리연골 파우더에 비하여 입자 크기의 균일성이 높은 것을 확인할 수 있다.
[실험예 1] - 동결건조 유리연골 파우더의 생체 적합성 실험
실시예 1과 같이 제조된 유리연골 파우더의 생체 적합성 및 재생 능력을 확인하기 위하여, 실험용 쥐의 진피에 주입한 후, 4주 및 12주 이후 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통하여 동결건조 유리연골 파우더의 세포 적합성 결과를 관찰하였다.
도 4는 실험예 1에 따른 4주 및 12주 이후의 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 4에 따르면, 4주차 이후 이식된 동결건조 유리연골 파우더 주변으로 세포들이 모이는 것을 확인할 수 있었으며, 12주차 이후 동결건조 유리연골 파우더 주변으로 모였던 세포들이 세로운 조직을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 유리연골을 동결건조 하더라도 조직 내에서 염증 반응이나 재생 능력 저하의 부작용이 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] - 연골 재생(Cartilage Regeneration) 여부의 확인을 위한 동물 실험(In vivo 실험)
실험용 비글을 마취한 후, 지방 흡입술을 이용하여 실험용 비글의 복부에서 70 ㎖ 내지 150 ㎖의 흡입물을 추출하고, 약 5분 동안 방치한 후 지방 조직과 함께 섞여 나온 식염수 및 피를 가라앉혀 침전물을 제거하여 자가 지방 조직을 수득하였다.
그리고 나서, 실험체의 지방이 담긴 주사기와 새 주사기를 공경이 2.4 ㎜인 스테인레스 시린지 필터(Adnizer, SKT-AN-2400, BSL)가 포함된 커넥터의 양방향 주입구에 장착하고, 피스톤 운동으로 지방이 필터를 2~3회 통과하도록 하여 자가 지방 조직으로부터 섬유질을 제거하였다.
그리고 나서, 섬유질이 제거된 지방을 공경 직경이 500 ㎛인 PET 필터가 구비된 Filter bag(Adipose tissue processing device, Tiss'you)에 주입하고 실리콘 주걱을 이용해 걸러내었다. 나아가, 공경 직경이 200 ㎛인 PET 필터가 구비된 Filter bag(Adipose tissue processing device, Tiss'you)을 이용하여, 500 ㎛ 필터를 통과한 지방을 같은 방법으로 걸러내었다. 나아가, 200 ㎛ 필터를 통과한 지방을 공경 직경이 50 ㎛인 PET 필터가 구비된 Filter bag(Adipose tissue processing device, Tiss'you)에 동량의 생리 식염수와 함께 주입하고, 생리 식염수와 기타 이물질을 걸러내어 필터에 잔여하는 지방 조직 추출물의 수득하였다.
수득된 지방 조직 추출물과 실시예 1에서 제조된 동결건조 유리연골 파우더 10 ㎎를 생리식염수와 혼합한 후, 4 ℃에서 5 분간 1000 rpm으로 원심분리한 후, 생리 식염수 상층액을 제거하였다. 나아가, 피브리노겐이 혼합된 아프로티닌액 1 ㎖와 혼합 주사기(mix syringe)를 이용해서 혼합하여 제1 액을 준비하고, 트롬빈이 분산된 염화칼슘 용액 1 ㎖를 제2 액으로 준비하였다.
실험용 비글의 무릎 대퇴부 관절구를 노출시키고, 여기에 지름 약 6 ㎜, 깊이 약 2 ㎜ 크기의 결함(defect) 영역을 형성하였다.
스캐폴드용 몰드를 제조하기 위하여, 3D 스캐너를 이용하여 실험용 비글의 결손된 연골 부위의 3차원 데이터를 수득하고, 이를 기초로 3D Bio 3D 프린터(INVIVO, ROKIT)를 사용하여 의료 등급의 PCL(polycaprolactone) 외벽을 출력하였다. 나아가, 상기 제1 액과 상기 제2 액을 각각 3D Bio 3D 프린터(INVIVO, ROKIT)를 이용하여 상기 스캐폴드용 몰드 내에 순차적으로 도포한 후 5분 간 굳혀 연골 재생용 스캐폴드를 제조하였다.
실험용 비글의 결함 영역에 피브린 글루(베리플라스트)를 100 μl를 주입하고, 제조된 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드를 이식한 후 수술 부위를 봉합하였다.
그리고 나서, 8주 후, 및 12주 후 MRI를 이용하여 결함 부위의 연골 재생 여부를 확인하였다. 실험예 2의 비교를 위하여, 동일한 조건으로 실험용 비글의 연골 부위에 결함 영역을 형성한 후 별도의 처리 없이 봉합한 비교 실험예를 함께 수행하였다.
도 5는 실험예 2 및 비교 실험예에 따른 MRI 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 5는 비교 실험예(동결건조 유리연골 파우더(-)) 및 실험예 2(동결건조 유리연골 파우더(+))의 8주차 및 12주차의 MRI 결과를 나타낸 것이다. 8주차 결과의 경우에는 비교 실험예 및 실험예 2 모두에서 뚜렷한 회복 효과가 나타나지 않았으나, 12주차 결과의 경우에는 실험예 2에서 뚜렷한 연골 조직 회복을 확인할 수 있었다.
상기 실험예 2의 결과를 통하여, 본 발명에 따른 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물 및 이를 이용한 연골 재생용 스캐폴드는 우수한 연골 재생 효과가 있음을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. A) 유리연골(hyaline cartilage)을 준비하는 단계;
    B) 상기 유리 연골을 동결건조 및 분쇄하여, 동결건조 유리연골 파우더를 제조하는 단계;
    C) 자가 지방 조직으로부터 지방 조직 추출물을 제조하는 단계; 및
    D) 상기 동결건조 유리연골 파우더 및 상기 지방 조직 추출물을 포함하는 연골 재생용 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 C) 단계는,
    C1) 2 ㎜ 내지 3 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터를 이용하여, 자가 지방 조직 내의 섬유질을 제거하는 단계;
    C2) 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을, 450 ㎛ 내지 550 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터에 순차적으로 통과시킨 후, 이의 여과물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계;를 포함하며,
    상기 동결건조 유리연골 파우더의 농도는 0.005 %(w/v) 내지 0.07 %(w/v)이며,
    상기 동결건조 유리연골 파우더의 입경은 30 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하인,
    동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 지방 조직 추출물은 자가 지방 조직으로부터 분리된 기질혈관분획(stromal vascular fraction)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 C) 단계는,
    C1) 2 ㎜ 내지 3 ㎜의 공경(pore) 직경을 가지는 제1 필터를 이용하여, 자가 지방 조직 내의 섬유질을 제거하는 단계;
    C2) 상기 섬유질이 제거된 자가 지방 조직을, 450 ㎛ 내지 550 ㎛의 공경(pore) 직경을 가지는 제2 필터, 및 150 ㎛ 내지 250 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제3 필터에 순차적으로 통과시켜, 자가 지방 조직을 분쇄하는 단계; 및
    C3) 상기 분쇄된 자가 지방 조직을 25 ㎛ 내지 75 ㎛ 의 공경(pore) 직경을 가지는 제4 필터를 통하여 거른 후, 상기 제4 필터에 포집되는 잔여물을 수집하여, 지방 조직 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 D) 단계는 생체용 접합제를 더 포함하여 혼합하는 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 생체용 접합제는 피브린 글루, 젤라틴 글루, 시아노아크릴레이트계 글루 및 폴리우레탄계 글루로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 청구항 2에 있어서,
    상기 기질혈관분획의 농도는 상기 연골 재생용 조성물 1 ㎖ 당 105 개 내지 107 개인 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 유리연골은 시술 대상과 동종의 유리연골로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 유리연골은 갈비 연골(costal cartilage)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 청구항 1, 2, 4 내지 6, 및 청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 따른 제조방법을 이용하여 제조된 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물.
  13. a) 3D 스캐너를 이용하여, 결손된 연골 부위의 3차원 데이터를 수득하고, 3D 프린터를 이용하여 스캐폴드용 몰드를 제조하는 단계;
    b) 청구항 12에 따른 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물에 피브리노겐을 혼합하여 제1 액을 제조하고, 이를 이용하여 상기 스캐폴드용 몰드 내에 도포하여 제1 층을 형성하는 단계;
    c) 트롬빈을 포함하는 제2 액을 상기 제1 층 상에 도포하여 제2 층을 형성하는 단계; 및
    d) 상기 제1 층 및 상기 제2 층이 반응하여, 연골 재생용 스캐폴드를 형성하는 단계;를 포함하는, 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드의 제조방법.
  14. 청구항 13에 따른 제조방법을 이용하여 제조된, 환자 맞춤형 연골 재생용 스캐폴드.
  15. 청구항 12에 따른 동결건조 유리연골 파우더를 이용한 연골 재생용 조성물이 인체 주입용 주사기에 충전되어 있는 연골재생용 의료 키트.
  16. 삭제
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