CN113710293A

CN113710293A - 使用冻干透明软骨粉生产软骨再生用组合物的方法、使用该方法生产的软骨再生用组合物、使用软骨再生用组合物生产患者定制的软骨再生用支架的方法和患者定制的软骨再生用支架

Info

Publication number: CN113710293A
Application number: CN202080028996.0A
Authority: CN
Inventors: 柳石焕
Original assignee: ROKIT Inc
Current assignee: ROKIT Inc; Rokit Healthcare Inc
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2021-11-26
Also published as: KR102434403B1; JP7319382B2; US20220175535A1; EP3939625A1; JP2022526240A; WO2020184974A1; EP3939625A4; KR20200108795A

Abstract

本发明涉及使用冻干透明软骨粉生产软骨再生用组合物的方法，和使用所述方法生产的软骨再生用组合物，所述方法包括：A)制备透明软骨的步骤；B)将透明软骨冻干并粉碎和生产冻干透明软骨粉的步骤；C)从自体脂肪组织产生脂肪组织提取物的步骤；和D)产生包含冻干透明软骨粉和脂肪组织提取物的软骨再生用组合物的步骤。

Description

使用冻干透明软骨粉生产软骨再生用组合物的方法、使用该方法生产的软骨再生用组合物、使用软骨再生用组合物生产患者定制的软骨再生用支架的方法和患者定制的软骨再生用支架

技术领域

本申请要求于2019年3月11日提交的韩国专利申请第10-2019-0027705号的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

本说明书涉及使用冻干透明软骨粉制备软骨再生用组合物的方法、通过所述方法制备的软骨再生用组合物、使用软骨再生用组合物生产患者定制的软骨再生用支架的方法、和患者定制的软骨再生用支架。

背景技术

在人体骨骼相接的铰链部分，由透明软骨组成的关节软骨相互接触并产生内压和拉力，并且在每个关节中都有容纳有滑液的滑液囊，以减少关节运动引起的摩擦。

尽管尚未确定关节软骨退行性变化的原因，但已知软骨细胞数量的绝对减少和软骨细胞中发生的软骨基质的合成和分解之间的失衡是原因之一。因此，由于软骨基质的分解，关节软骨的退行性变化降低了软骨强度和关节软骨的缓冲能力。

由于植入的细胞因重力而向一个方向倾斜，所以传统的细胞治疗剂难以在受损区域均匀分布，并且由于细胞植入困难，缺陷软骨区域中的细胞再生减少。另外，在自体软骨细胞和干细胞移植的情况下，由于提取组织然后在培养后施用于患者，所以需要两次手术，并且需要约4周的细胞培养或操作。此外，由于重力，移植的细胞难以均匀分布并移植到受损区域，并且存在诱导分化为纤维软骨而不是透明软骨的问题，导致软骨容易被破坏的现象。因此，有必要开发可以有效进行缺陷软骨区域的细胞再生的方法。

[相关领域文献]

[专利文献]

(专利文献1)韩国公开专利申请第10-2017-0012099号

发明内容

[技术问题]

本发明旨在提供使用冻干透明软骨粉制备软骨再生用组合物的方法、通过所述方法制备的软骨再生用组合物、使用软骨再生用组合物生产患者定制的软骨再生用支架的方法、和患者定制的软骨再生用支架。此外，本发明旨在提供使用软骨再生用组合物的软骨再生用医药盒。

[技术方案]

本发明一方面提供了使用冻干透明软骨粉制备软骨再生用组合物的方法，其包括：A)制备透明软骨；B)通过将透明软骨冻干并粉碎来制备冻干透明软骨粉；C)从自体脂肪组织制备脂肪组织提取物；和D)制备包含冻干透明软骨粉和脂肪组织提取物的软骨再生用组合物。

本发明的另一方面提供了通过上述方法制备的软骨再生用组合物。

本发明的又一方面提供了生产患者定制的软骨再生用支架的方法，包括：a)使用3D扫描仪获取缺陷软骨区域的3D数据，并使用3D打印机形成支架模具；b)通过将纤维蛋白原与使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物混合来制备第一液体，并通过用第一液体涂覆支架模具内部形成第一层；c)通过用包含凝血酶的第二液体涂覆第一层来形成第二层；和d)通过使第一层与第二层反应形成软骨再生用支架。

本发明的又一方面提供了患者定制的软骨再生用支架，其由用于生产患者定制的软骨再生用支架的方法生产。

本发明的又一方面提供了软骨再生用医药盒，其中软骨再生用组合物被装入人体注射用注射器中。

本发明的又一方面提供了治疗缺陷软骨的方法，其包括将软骨再生用组合物注射到缺陷软骨区域。

[有益效果]

根据本发明的软骨再生用组合物可以容易且立即地制备并施用于产生缺陷软骨的程序。特别地，由于本发明的软骨再生用组合物使用冻干透明软骨粉，因此可以在存储冻干透明软骨粉的同时通过在手术中从患者获得脂肪组织来源的基质血管成分而立即制备软骨再生用组合物。

根据本发明的软骨再生用组合物可以使用患者定制的软骨再生用支架或通过直接注射到缺陷软骨区域来促进软骨再生。

根据生产患者定制的软骨再生用支架的方法，由于可以在手术室中通过对病灶的软骨缺陷进行3D扫描来立即生产患者定制的软骨再生用支架，因此可以通过一次手术植入支架。

本发明的其他目的和优点可通过以下本发明的详细说明、权利要求和附图得到更清楚的理解。

附图说明

图1是显示根据对比例1的透明软骨组织及其粉化结果的一组图像。

图2是显示根据实施例1的冻干透明软骨组织及其粉化结果的一组图像。

图3是显示根据对比例1和实施例1通过调整透明软骨粉的粒径制备的结果的一组图像。

图4显示了根据实验例1的4周和12周后的结果。

图5显示了根据实验例2和对比实验例的MRI结果。

具体实施方式

在本发明中，当一个构件设置在另一个构件“上”时，第一构件与第二构件接触，或者第三构件插入在这两个构件之间。

在本发明中，当一个部分“包含”组分时，除非另有特别说明，否则可以进一步包含另一组分，而不是排除其它组分。

以下，将详细描述本发明。

根据本发明的一个实施方案，透明软骨可以来源于相对于治疗目标的同源或异源透明软骨。透明软骨优选来源于同源透明软骨。特别地，当软骨治疗目标是人时，可以使用从人透明软骨提取的透明软骨粉。另外，当软骨治疗对象是动物时，可以使用从同一物种动物的透明软骨提取的透明软骨粉。

根据本发明的一个实施方案，透明软骨可以来源于肋软骨。特别地，当使用软骨再生用组合物的治疗目标是人时，透明软骨可以来源于人肋软骨。此外，当使用软骨再生用组合物的治疗目标是动物时，透明软骨可以来源于与治疗目标动物相同物种的肋软骨。例如，透明软骨可以使用市售的同种异体肋软骨。

冻干透明软骨粉可以通过将透明软骨冷冻干燥然后将冻干透明软骨粉碎来获得。另外，冻干透明软骨粉可以通过将透明软骨同时冷冻干燥并粉碎来获得。冷冻干燥可以使用本领域通常进行的冷冻干燥方法。此外，粉碎可用于使用例如球磨法将冻干透明软骨微粉化为具有期望直径的颗粒。粉碎透明软骨的方法没有限制，并且可以不受限制地应用可以获得具有期望粒径的颗粒的任何方法。

冻干透明软骨粉可以是植入物的组分或支架的支持物，当将软骨再生用组合物应用于缺陷软骨组织时，所述植入物或支架来源于软骨再生用组合物。具体地，冻干透明软骨粉颗粒可以通过生物粘合剂彼此结合，从而在缺陷软骨区域形成植入物或支架。

冻干透明软骨粉的优点是无需单独调节温度或湿度即可保存。通过使用冻干透明软骨粉，软骨再生用组合物具有在从患者提取脂肪组织提取物后立即容易制备的优点。即，普通透明软骨粉由于在低温条件下保存，因此可能需要保存成本，另外，为了与脂肪组织提取物混合，可能存在需要等到温度升高到适当温度的情况。另一方面，由于根据本发明的软骨再生用组合物使用冻干透明软骨粉，因此具有解决了上述问题的优点。

此外，冻干透明软骨粉具有非常高的粒径均匀性并且通过最小化水含量使颗粒之间的团聚最小化。例如，当一般透明软骨微粉化时，由于透明软骨中的水，可能无法均匀粉碎，并且由于粉碎颗粒之间的团聚，可能会堵塞注射器或3D打印机的喷嘴。此外，由于团聚颗粒，普通透明软骨粉在施用于病灶时可能无法均匀地表现出效果，或者具有副作用。

冻干透明软骨粉可释放软骨再生相关生长因子，诱导脂肪组织提取物向软骨细胞分化。此外，冻干透明软骨粉中包含的蛋白质可有助于促进病灶中的软骨再生。

根据本发明的一个实施方案，冻干透明软骨粉的粒径可以为30μm或更大且300μm或更小。当冻干透明软骨粉的平均粒径在上述范围内时，软骨细胞的分化和再生有效地进行。

根据本发明的一个实施方案，冻干透明软骨粉的浓度可以为0.005％至0.1％(w/v)。即，每1mL软骨再生用组合物可以包含0.005至0.1g的冻干透明软骨粉。冻干透明软骨粉的浓度优选为0.005％至0.07％(w/v)，更优选为0.005％至0.03％(w/v)，最优选为0.007％至0.03％(w/v)。当冻干透明软骨粉的浓度在上述范围内时，在植入使用该软骨再生用组合物产生的患者定制的软骨再生用支架的情况下，或在通过将软骨再生用组合物注射到病灶中来形成植入物的情况下，软骨细胞的生存能力以及软骨细胞的分化和形态可以最出色地表现出来。

根据本发明的一个实施方案，脂肪组织提取物可以包含从自体脂肪组织分离的基质血管成分。即，脂肪组织提取物可以包含脂肪组织来源的基质血管成分，其可以包含脂肪组织来源的干细胞。优选地，脂肪组织来源的基质血管成分可以基本上不包含除脂肪组织来源的干细胞之外的其它细胞(例如，脂肪细胞、红细胞、其它基质细胞等)和细胞外基质(ECM)材料，并且更优选地，可以既不包含其它细胞也不包含ECM材料。

脂肪组织提取物中的脂肪组织来源的基质血管成分可以从同源或异源动物中的脂肪组织提取。具体地，脂肪组织提取物中的脂肪组织来源的基质血管成分可以从同源或异源动物的脂肪组织提取。优选地，脂肪组织提取物可以从自体脂肪组织提取。更具体地，可以使用治疗目标(即患者或动物)的脂肪组织来提取脂肪组织提取物。脂肪组织提取物(或其中包含的脂肪组织来源的基质血管成分)可以通过从脂肪组织中形状提取微或纳米SVF/ECM簇如脂肪组织来源的基质血管成分(SVF)和ECM来获得，并且根据需要，可以分离和使用纯脂肪组织来源的基质血管成分(SVF)和ECM。在一个实例中，通过使用Lipocell试剂盒(Tiss'you)，脂肪组织提取物可以是从脂肪组织中获得的提取物或称为纳米脂肪(Nanofat)的脂肪组织来源的提取物。然而，可以使用本领域已知的方法和提取试剂盒获得脂肪组织来源的基质血管成分，但本发明不限于此。

根据本发明的一个实施方案，步骤C)可以包括：

C1)使用孔径为2至3mm的第一过滤器去除自体脂肪组织中的纤维；和C2)通过将无纤维自体脂肪组织依次通过孔径为450至550μm的第二过滤器和孔径为150至250μm的第三过滤器过滤得到脂肪组织提取物。

根据本发明的另一个实施方案，步骤C)可以包括：

C1)使用孔径为2至3mm的第一过滤器去除自体脂肪组织中的纤维；C2)将无纤维自体脂肪组织依次通过孔径为450至550μm的第二过滤器和孔径为150至250μm的第三过滤器过滤并且将所述自体脂肪组织粉碎；和C3)通过将粉碎的自体脂肪组织通过孔径为25至75μm的第四过滤器过滤然后收集由所述第四过滤器收集的残留物来得到脂肪组织提取物。

即，可以将通过第三过滤器的滤液或由第四过滤器收集的残留物用作脂肪组织提取物。

在步骤C1)中，可以使用孔径相对较大的第一过滤器去除提取的自体脂肪组织中的纤维。具体地，步骤C1)中的第一过滤器可以是不锈钢制成的注射器过滤器。具体地，第一过滤器可以具有由高强度不锈钢制成的过滤器部件，以有效地将纤维与自体脂肪组织分离。更具体地，在步骤C1)中，可以在第一过滤器的两端安装注射器，并且可以利用注射器的活塞运动使提取的自体脂肪组织通过第一过滤器两次或更多次，具体是两次或三次。在步骤C1)中，主要通过过滤自体脂肪组织中的纤维，可以在短时间内更有效地粉碎自体脂肪组织。

步骤C2)可以包括通过经第二过滤器过滤无纤维自体脂肪组织来粉碎自体脂肪组织，并且另外通过经第三过滤器过滤所得滤液来粉碎自体脂肪组织。

根据本发明的一个实施方案，在步骤C2)中，可以将无纤维自体脂肪组织注入滤袋中，并且可以通过施加外力使无纤维自体脂肪组织经过滤器过滤来粉碎无纤维自体脂肪组织。具体地，在步骤C2)中，可以将无纤维自体脂肪组织注入滤袋中，并且可以通过从外部使用工具例如硅胶刮刀将无纤维自体脂肪组织依次经第二过滤器和第三过滤器过滤来粉碎自体脂肪组织。

在本说明书中，滤袋是由柔性塑料材料制成的封闭袋状过滤器套件，并且可以包括在一侧的入口和在另一侧的出口，其内部空间可以由过滤器隔开。

在步骤C2)中，第二过滤器和第三过滤器的实例可以通过对Tiss’you生产的Lipocell试剂盒的滤袋的改良来使用。然而，本发明不限于上述实例，并且可以使用适合于本发明目的的过滤器。

如在步骤C2)，当使用孔径逐渐减小的过滤器粉碎自体脂肪组织时，自体脂肪组织微粉化的时间可以大大减少，并且脂肪组织提取物中的细胞可以保持高细胞活性。具体地，当使用步骤C2)时，虽然通过物理方法将脂肪组织微粉化，但具有确保在治疗中有效的大量脂肪组织、活性细胞和活性蛋白质的优点。此外，当使用步骤C2)时，可以收集处于最佳活性状态的ECM和生长因子，并且还具有能够进行3D生物打印的物理特性。

步骤C3)可以是通过将根据步骤C2)粉碎的自体脂肪组织经第四过滤器过滤并收集由第四过滤器收集的残留物来得到脂肪组织提取物。具体地，在步骤C3)中，可以通过经孔径为25至75μm的第四过滤器过滤粉碎的自体脂肪组织、除去滤液并且收集由第四过滤器收集的残留物来得到脂肪组织提取物。具体地，在步骤C3)中，可以将由第四过滤器得到的滤液丢弃，并且得到由第四过滤器捕获的物质。具体地，在步骤C3)中，可以将通过步骤C2)粉碎的自体脂肪组织与生理盐水混合、并使用第四滤器过滤，可以分离并除去滤液，并且可以将由第四滤器捕获的物质用作粗脂肪提取物。通过过滤除去的物质可以包含过度微粉化且细胞活性降低的脂肪组织、血液和生理盐水，这些物质可能由于干扰本发明中意图的软骨再生活性而被去除。

在步骤C3)中，可以将无纤维自体脂肪组织和生理盐水注入滤袋中，然后可以去除通过第四过滤器过滤的物质。具体地，在步骤C3)中，可以将无纤维自体脂肪组织和生理盐水注入滤袋中，粉碎的自体脂肪组织可以通过施加适当的压力经第四过滤器过滤。

步骤C3)中的第四过滤器的一个实例可以通过改良Tiss’you生产的Lipocell试剂盒的滤袋来使用。然而，本发明不限于此，并且可以使用适合本发明目的的过滤器。

根据本发明制备的脂肪组织提取物可以特别地包含大量软骨再生所需的生长因子、活性细胞和活性蛋白质。此外，由于使用脂肪组织提取物的生物打印组合物(例如，第一液体)可以保持为具有合适的粘度并且在生物打印中以恒定速率打印而不会堵塞喷嘴，因此其可以适用于需要精确生物打印的皮肤再生片的形成。

此外，由于可以在短时间内获得具有最大量的生长因子、活性细胞和活性蛋白质的脂肪组织提取物，从而能够进行更有效的治疗。

根据本发明的一个实施方案，基质血管成分的细胞浓度可以为每1mL软骨再生用组合物中10⁵至10⁷个。当基质血管成分的细胞浓度在上述范围内时，在植入使用该软骨再生用组合物产生的患者定制的软骨再生用支架的情况下，或在通过将软骨再生用组合物注射到病灶中来形成植入物的情况下，软骨分化能力和软骨再生能力可大幅提高。

基质血管成分可以与冻干透明软骨粉一起使用，从而分化成软骨细胞。因此，在植入使用该软骨再生用组合物产生的患者定制的软骨再生用支架的情况下，或在通过将软骨再生用组合物注射到病灶中来形成植入物的情况下，可以积极地诱导在病灶内向软骨细胞的分化。

根据本发明的一个实施方案，对于5至100mg冻干透明软骨粉，基质血管成分的总细胞数可以为10⁵至10⁷个。优选地，对于5至70mg冻干透明软骨粉，基质血管成分的总细胞数可以为10⁵至10⁷个。更优选地，对于5至30mg冻干透明软骨粉，基质血管成分的总细胞数可以为10⁵至10⁷个。

根据本发明的一个实施方案，在步骤D)中，可以额外混合生物粘合剂。

根据本发明的一个实施方案，生物粘合剂可以包含选自由以下组成的组的至少一种：纤维蛋白胶、明胶胶、氰基丙烯酸酯基胶和聚氨酯基胶。具体地，生物粘合剂可以是纤维蛋白胶和/或明胶胶，并且更具体地，可以是纤维蛋白胶。

当施用纤维蛋白胶作为生物粘合剂时，软骨再生用组合物包含纤维蛋白原作为生物粘合剂，并且可以与包含凝血酶的单独组合物一起使用。具体地，为了产生支架，可以施用包含纤维蛋白原的软骨再生用组合物，然后使用含凝血酶的组合物固化成支架。此外，可以将包含纤维蛋白原的软骨再生用组合物注入缺陷软骨区域，并使用含凝血酶的组合物固化，从而在缺陷区域形成植入物。

根据本发明的一个实施方案，软骨再生用组合物可以包含纤维蛋白原，并且还包含抑肽酶。抑肽酶是由胰腺分泌的蛋白酶的抑制剂，其是由总共58个氨基酸组成的多肽。已知抑肽酶通常从牛肺中提取，防止血液中的纤维蛋白降解并起到止血作用。

根据本发明的一个实施方案，每ml软骨再生用组合物可以包含65至115mg的纤维蛋白原。

根据本发明的一个实施方案，每1mL软骨再生用组合物可以包含900至1100激肽原灭活因子单位(Kininogen Inactivator Unit，KIU)、并且具体地是1000KIU的抑肽酶。

具体地，根据本发明的一个实施方案，软骨再生用组合物每1mL可以包含10⁵至10⁷个脂肪组织来源的基质血管成分的细胞、5至100mg冻干透明软骨粉、65至115mg纤维蛋白原和900至1100KIU的抑肽酶。

根据本发明的一个实施方案，含凝血酶的组合物可以包含氯化钙溶液中的凝血酶。具体地，含凝血酶的组合物每1mL可以包含400至600IU的凝血酶和5至6.5mg的氯化钙。

软骨再生用组合物和含凝血酶的组合物的溶剂可以是水，具体地，生理盐水。此外，软骨再生用组合物中的纤维蛋白原和含凝血酶的组合物中的凝血酶可以从商业纤维蛋白胶试剂盒获得。

本发明的另一方面提供了使用上述制备方法制备的软骨再生用组合物。

本发明的又一方面提供了生产患者定制的软骨再生用支架的方法，其包括：a)使用3D扫描仪获取缺陷软骨区域的3D数据，并使用3D打印机形成支架模具；b)通过将纤维蛋白原与使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物混合来制备第一液体，并通过用第一液体涂覆支架模具内部形成第一层；c)通过用包含凝血酶的第二液体涂覆第一层来形成第二层；和d)通过使第一层与第二层反应形成软骨再生用支架。

在步骤a)中，可以使用本领域已知的3D扫描仪和3D打印机。此外，当施用第一液体和第二液体时，支架模具可以用于固定3D形状。可以在产生软骨再生用支架后去除支架模具。支架模具可以使用本领域中通常使用的生物相容性聚合物形成。

根据本发明的一个实施方案，步骤b)和c)可以使用喷墨打印或3D打印来实施。具体地，步骤b)和c)可以使用本领域已知的具有两个或更多个喷嘴的打印装置，并且可以通过从各自的喷嘴排出第一液体和第二液体来产生3D形状。

根据本发明的一个实施方案，步骤b)和c)可以交替进行两次或更多次。具体地，当需要形成大体积的软骨再生用支架时，可以交替进行步骤b)和c)，以便以“第一层/第二层/第一层/第二层”的顺序堆叠层，并且固化这些层，从而形成软骨再生用支架。

根据本发明的一个实施方案，步骤d)可以在10分钟内完成，并且优选地，在5分钟内完成。具体地，在步骤d)中，可以通过使第一层与第二层反应3至7分钟来形成软骨再生用支架。

本发明可以使用由纤维蛋白原和纤维蛋白组成的纤维蛋白胶作为粘合剂，其可以确保比透明质酸粘合剂或胶原粘合剂更高的粘度，因此，患者定制的软骨再生用支架可以对病灶具有优异的粘附强度并保持高强度。

本发明的又一方面提供了患者定制的软骨再生用支架，其使用生产患者定制的软骨再生用支架的方法产生。

如上所述，可以通过在短时间内形成为对应于缺陷软骨区域的形状来植入患者定制的软骨再生用支架。患者定制的软骨再生用支架不需要细胞培养过程，并且植入后支架内脂肪组织来源的基质血管成分分化为软骨细胞，冻干透明软骨粉可以激活软骨再生并提高再生软骨细胞的存活率。

当患者定制的软骨再生用支架被植入病灶时，可以通过从冻干透明软骨粉释放的透明软骨生长因子和蛋白质诱导软骨的内在透明软骨(具体是膝关节软骨)的再生。因此，当患者定制的软骨再生用支架被施用于病灶时，其可以有效地恢复到与常规软骨相同或相似的状态。

本发明的又一方面提供了软骨再生用医药盒，其中软骨再生用组合物被装入人体注射用注射器中。具体地，在软骨再生用医药盒中，包含冻干透明软骨粉、脂肪组织来源的基质血管成分和生物粘合剂的软骨再生用组合物被装入注射器中。

此外，软骨再生用医药盒可以包括第一注射器，其中填充有包含冻干透明软骨粉、脂肪组织来源的基质血管成分和纤维蛋白原的软骨再生用组合物；和第二注射器，其中填充有含凝血酶的组合物。如上所述，在使用第一注射器将软骨再生用组合物注射到缺陷软骨区域之后，可以注射第二注射器中的含凝血酶的组合物以在缺陷软骨区域形成植入物。

本发明的又一方面提供了治疗缺陷软骨的方法，其包括将软骨再生用组合物注射到缺陷软骨区域中。可以使用上述软骨再生用医药盒来进行治疗缺陷软骨的方法。

在传统自体软骨细胞移植和干细胞移植的情况下，为了提取患者缺陷软骨细胞区域的组织，在第一次切开病灶后，需要第二次切开以便经由组织培养过程植入病灶，并且因此需要两次外科手术。相反，使用本发明公开的患者定制的软骨再生用支架和软骨再生用医药盒来治疗缺陷软骨的方法具有在短时间内植入对应缺陷软骨区域的支架的优点，或在通过第一次切开确认缺陷软骨区域之后，通过将组合物直接注射到缺陷区域来形成植入物的优点。

在下文中，将参考实施例详细描述本发明以帮助理解本发明。然而，根据本发明的实施例可以以多种不同的形式进行修改，并且应认为本发明的范围不限于以下实施例。提供本发明的实施例是为了向本领域普通技术人员更完整地解释本发明。

[对比例1]-普通透明软骨粉的制备

将获得的透明软骨组织在不进行单独处理的情况下切片，然后使用球磨机粉化。

图1是显示根据对比例1的透明软骨组织及其粉化结果的一组图像。参照图1，当对未单独冻干的透明软骨进行粉化时，可以确认由于内部水而发生团聚。

[实施例1]——冻干透明软骨粉的制备

在将获得的透明软骨组织切片后，在接近真空的气氛中，在约5巴的压力、约-80℃的温度下冷冻干燥约12小时，并且使用球磨机粉化。

图2是显示根据实施例1的冻干透明软骨组织及其粉化结果的一组图像。参照图2，不同于图1，可以证实透明软骨粉被微粉化成非常细的颗粒而没有团聚。

即，可能存在的问题在于，如对比例1中制备的透明软骨粉由于团聚而需要单独的分散过程并且可能堵塞打印机喷嘴。另外，如对比例1中制备的透明软骨粉需要在约-20℃冷冻，这很不方便。另一方面，如实施例1中制备的冻干透明软骨粉即使在制备后保存在室温下也没有问题，因此，由于在治疗中可以省略解冻过程，因此冻干透明软骨粉非常容易施用。因此，与如对比例1中制备的透明软骨粉相比，如实施例1中制备的冻干透明软骨粉具有粒径均匀性非常高的优点。

图3是显示根据对比例1和实施例1通过调整透明软骨粉的粒径制备的结果的一组图像。参照图3，可以证实，如实施例1中的冻干透明软骨粉比如对比例1中的普通透明软骨粉具有更高的粒径均匀性。

[实验例1]——冻干透明软骨粉的生物相容性实验

为确认如实施例1中制备的透明软骨粉的生物相容性和再生能力，在注入实验室小鼠的真皮后，4周和12周后，通过苏木精和伊红(H&E)染色观察冻干透明软骨粉的细胞相容性结果。

图4显示了根据实验例1的4周和12周后的结果。具体地，参照图4，4周后，可以证实细胞集中在植入的冻干透明软骨粉周围，并且12周后，细胞集中在冻干透明软骨粉形成的新组织周围。因此，可以证实，尽管透明软骨是冻干的，但是没有诸如炎症或组织再生能力降低的副作用。

[实验例2]–用于确认软骨再生的动物实验(体内实验)

如下来获得自体脂肪组织：在麻醉后使用吸脂术从实验室比格犬腹部提取70至150mL抽吸物，将抽吸物静置约5分钟，然后除去盐水和与脂肪组织一起提取的来自血液的沉淀物。

随后，将装有实验对象脂肪的注射器和新鲜注射器安装在带有孔径为2.4mm的不锈钢注射器过滤器(Adnizer,SKT-AN-2400,BSL)的连接器的双向入口中，通过活塞运动使脂肪通过过滤器两次或三次来从自体脂肪组织中去除纤维。

随后，将无纤维脂肪注入包含孔径为500μm的PET过滤器的滤袋(脂肪组织处理装置，Tiss’you)中，并使用硅胶刮刀过滤。此外，使用包含孔径为200μm的PET过滤器的滤袋(脂肪组织处理装置，Tiss’you)以相同方式过滤通过了500μm过滤器的脂肪。然后，将通过了200μm过滤器的脂肪注入包含孔径为50μm的PET过滤器和相同量生理盐水的滤袋(脂肪组织处理装置，Tiss’you)中，并且过滤生理盐水和其它杂质，从而获得残留在过滤器上的脂肪组织提取物。

将得到的脂肪组织提取物和10mg的实施例1中制备的冻干透明软骨粉与生理盐水混合，4℃下以1000rpm离心5分钟以除去生理盐水上清液。此外，通过使用混合注射器将所得溶液与1mL混有纤维蛋白原的抑肽酶溶液混合制备第一液体，并且制备1mL分散有凝血酶的氯化钙溶液作为第二液体。

使实验比格犬膝关节股骨髁外露，形成直径为6mm、深度为约2mm的缺陷区域。

为了形成支架模具，使用3D扫描仪获取实验比格犬缺陷软骨区域的3D数据，并在此基础上使用3D Bio 3D打印机(INVIVO,ROKIT)打印医用级聚己内酯(PCL)外壁。进而，使用3D Bio 3D打印机(INVIVO,ROKIT)将第一液体和第二液体依次施用在支架模具中，固化5分钟，从而产生软骨再生用支架。

将100μL的纤维蛋白胶(Beriplast)注入实验比格犬的缺陷区域，并植入制备的患者定制的软骨再生用支架，然后缝合手术区域。

之后，在8周和12周后，使用MRI检查缺陷区域的软骨再生。为了与实验例2进行比较，还用在相同条件下在实验比格犬的软骨区域中形成缺陷区域然后在没有单独处理的情况下缝合的对比实验例中进行了检查。

图5显示了根据实验例2和对比实验例的MRI结果。具体地，图5显示了对比实验例(冻干透明软骨粉(-))和实验例2(冻干透明软骨粉(+))在第8周和第12周的MRI结果。虽然在第8周的结果中对比实验例和实验例2都没有表现出明显的恢复效果，但在第12周的结果中，实验例2显示出明显的软骨组织恢复。

由实验例2的结果可以确认，根据本发明的使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物和使用其的软骨再生用支架具有优异的软骨再生效果。

如上所述，随着说明书的具体部分已经详细描述，然而本领域技术人员清楚，该具体技术仅仅是优选实施方案，并且说明书的范围不限于此。因此，说明书的实质范围将由所附权利要求及其等同物来定义。

Claims

1.一种使用冻干透明软骨粉制备软骨再生用组合物的方法，包括：

A)制备透明软骨；

B)通过将所述透明软骨冻干并粉碎来制备冻干透明软骨粉；

C)从自体脂肪组织制备脂肪组织提取物；和

D)制备包含所述冻干透明软骨粉和所述脂肪组织提取物的软骨再生用组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织提取物包含从所述自体脂肪组织分离的基质血管成分。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤C)包括：C1)使用孔径为2至3mm的第一过滤器去除所述自体脂肪组织中的纤维；和C2)通过将无纤维自体脂肪组织依次通过孔径为450至550μm的第二过滤器和孔径为150至250μm的第三过滤器过滤得到所述脂肪组织提取物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤C)包括：C1)使用孔径为2至3mm的第一过滤器去除所述自体脂肪组织中的纤维；C2)将无纤维自体脂肪组织依次通过孔径为450至550μm的第二过滤器和孔径为150至250μm的第三过滤器过滤并且将所述自体脂肪组织粉碎；和C3)通过将粉碎的自体脂肪组织通过孔径为25至75μm的第四过滤器过滤然后收集由所述第四过滤器收集的残留物来得到所述脂肪组织提取物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤D)中，额外添加生物粘合剂并混合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物粘合剂包括选自由以下组成的组的至少一种：纤维蛋白胶、明胶胶、氰基丙烯酸酯基胶和聚氨酯基胶。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述冻干透明软骨粉的浓度为0.005％至0.1％(w/v)。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述基质血管成分的细胞浓度为每1mL所述软骨再生用组合物中10⁵至10⁷个。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明软骨来源于与治疗目标相同物种的透明软骨。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明软骨来源于肋软骨。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述冻干透明软骨粉的粒径为30μm或更大且300μm或更小。

12.一种使用根据权利要求1至11中任一项所述的方法制备的使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物。

13.一种生产患者定制的软骨再生用支架的方法，包括：

a)使用3D扫描仪获取缺陷软骨区域的3D数据，并使用3D打印机形成支架模具；b)通过将纤维蛋白原与权利要求12所述的使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物混合来制备第一液体，并通过用所述第一液体涂覆所述支架模具的内部来形成第一层；c)通过用包含凝血酶的第二液体涂覆所述第一层来形成第二层；和d)通过使所述第一层与所述第二层反应来形成软骨再生用支架。

14.一种通过权利要求13所述的方法生产的患者定制的软骨再生用支架。

15.一种软骨再生用医药盒，其中权利要求12所述的使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物被装入人体注射用注射器中。

16.一种治疗缺陷软骨的方法，包括：

将权利要求12所述的使用冻干透明软骨粉的软骨再生用组合物注射到缺陷软骨区域。