KR100905900B1

KR100905900B1 - 콜라겐을 함유한 관절연골 치료용 이중 지지체

Info

Publication number: KR100905900B1
Application number: KR1020070073863A
Authority: KR
Inventors: 조성관; 정병옥; 김운겸
Original assignee: (주)씨네이처
Priority date: 2007-07-24
Filing date: 2007-07-24
Publication date: 2009-07-02
Also published as: KR20090010607A

Abstract

본 발명은 관절연골 치료용 이중 지지체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생분해성 고분자를 포함하는 상부층 및 생분해성 고분자와 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층의 이중층의 구조를 갖는 관절연골 치료용 이중 지지체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 지지체는 세포이식 및 연골재생에 적합한 기계적 강도를 지니고, 간편한 수술과정에 의해 생체 내 이식이 가능하다. 또한, 이중층의 구조를 갖는 이중 지지체가 체내에서 연골층 및 석회화 연골층과 유사한 구조를 형성하고, 특히 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층이 골조직의 재생을 하부에서 자극함으로써 연골의 생성을 더욱 촉진한다.

관절연골, 이중층, 지지체, 인산칼슘계 생체적합성 세라믹, 제대, 양수, 양막

Description

콜라겐을 함유한 관절연골 치료용 이중 지지체{Double Layered Scaffold for Treatment of Articular Cartilage}

일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.

현재까지 알려진 손상된 관절연골 치료방법으로 연골성형술 (chondroplasty), 골연골이식술(osteochondral transplantation), 자기유래연골세포 이식술(autolaugous chondrocyte transplantation) 등이 있다.

연골성형술은 가장 일반적으로 사용되는 방법이며, 그 대표적 방법인 관절경적 시술은 소형카메라가 장착된 관절경(arthroscopy)을 1㎝ 미만의 작은 구멍을 통 해 관절강 내에 삽입하여, TV 모니터를 통해 관절 속을 확대 관찰하면서 진단 및 수술을 동시에 수행하는 방법이다. 그러나 연골성형술은 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.

골연골이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다. 즉, 상기 방법에서 정상조직의 연골은 간단한 관절경적 시술이 기술적으로 어려운 점이 많고, 정상 연골 부위를 희생하는 셈이 되므로, 이러한 공여부에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있다.

최근, 손상된 관절 연골의 치료를 위해 조직 공학에 기초를 둔 새로운 치료법으로서 자기유래 연골세포 이식술이 각광받고 있다. 이 기술은 New York에 있는 Hospital for Joint Disease에서 처음 연구되었고, 스웨덴(Sweden)에 있는 University of Gothenburg와 Sahlgrenska University Hospital에서 발전 되었다.

상기와 같은 자기유래 연골세포 이식술은, 무릎 관절 연골이 손상된 환자의 연골 부위 중 사용이 많지 않은 연골을 채취한 후 연골 세포를 분리하고, 상기 연골 세포를 배양하여 연골 결손 부위를 치료할 만큼의 연골 세포 수를 획득하며, 배양된 연골세포를 환자의 연골 결손 부위에 이식하여 환자의 관절 연골을 복원시키는 방법이다.

상기 방법은 이미 생성된 연골조직을 손상부위에 주입하는 골연골이식술에 비해, 이식된 연골세포가 손상된 부위 내에서 직접 증식하면서 손상부위를 채우게 되므로, 이식된 부위와 정상 부위가 비교적 잘 융합되며, 초자연골을 재생할 가능성 또한 많다. 그러나 연골세포를 채취할 때, 그리고 체외에서 배양된 연골세포를 다시 관절연골손상 부위에 이식할 때 각각 수술이 필요하므로, 결국 2차례에 걸친 수술에 의해 환자의 고통, 후유증 및 경제적 부담이 크며, 시술 과정 또한 복잡하고 까다롭다. 또한, 채취된 연골세포는 대부분은 이미 성장이 다 이루어진 성인으로부터 얻은 것이므로, 채취된 세포의 증식 및 생장이 왕성하지 않아 세포의 체외 배양시 이식에 필요한 만큼의 세포 수를 얻기까지 상당한 기간이 걸리며, 세포가 분화능력을 잃어 아예 증식하지 않는 경우에는 치료 자체가 이루어질 수 없고, 연골세포를 체외에서 배양하기 때문에 세포의 발현형이 변화되곤 하는 문제점이 있다.

상기 방법을 응용하여 자가 유래 골수(bone marrow), 근육, 피부 등의 간엽 조직으로부터 연골세포(chondrocyte)의 전구모세포(precursor cell)인 간엽줄기세 포(mesenchymal stem cell; MSC)를 얻고, 체외에서 증식시켜 고분자와 함께 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 보고된 바 있다. 상기와 같이 성숙한 개체에서 얻은 간엽줄기세포를 이용하여 연골손상을 치료하는 방법은 자기유래연골세포 이식술에 비해, 보다 미분화된 세포를 얻어 체외배양하므로 세포증식력이 다소 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 상기 방법 역시 다양한 연골 손상을 충분히 치료하기에는 여전히 미약한 수준의 세포증식력을 나타내고 있다.

이러한 미약한 세포증식력을 개선하기 위하여, 최근에는 제대혈 유래 줄기세포를 관절연골 손상부위에 주입하는 방법이 연구되고 있다. 그 일례로, 대한민국특허등록 제10-0494265호는 제대혈로부터 분리, 증식 또는 분화한 세포와 배지 및 생체적합성 고분자로 이루어진 관절연골손상 치료용 유연성 주사제 조성물을 개시하고 있다.

또한, 대한민국특허출원 제10-2005-7003964호는 구멍 직경 10㎛이상 500㎛이하, 구멍 길이 20㎛이상 1CM이하의 세로로 긴 형상의 구멍이 병렬적으로 배치되고, 병치된 각 구멍간은 구멍 직경 10㎛이하의 소 구멍으로 연이어 통한 구조를 가지는 조직 재생용의 3차원 다공성 지지체를 제시하고, 이러한 3차원 다공성 지지체에 조직 유래의 세포 또는 전구세포를 배양한 세포 결합체를 개시하고 있다.

그러나, 상기 치료방법은 연골 재생 효과 면에서 아직 미흡한 점이 많고, 실제 관절연골 구조를 고려한 지지체에 대한 연구도 발표된 예가 없다.

발명의 목적은 이중층의 구조를 갖는 이중 지지체가 체내에서 연골층 및 석회화 연골층과 유사한 구조를 형성하고, 특히 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층이 골조직의 재생을 하부에서 자극함으로써 연골의 생성을 더욱 촉진하는 관절연골 치료용 이중 지지체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

생분해성 고분자를 포함하는 상부층; 및

상기 상부층 하부에 위치하며, 생분해성 고분자 및 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층으로 이루어지는 이중층의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체를 제공한다.

본 발명의 이중 지지체는 세포이식 및 연골재생에 적합한 기계적 강도를 지닌다. 또한, 간편한 수술과정에 의해 생체 내 이식이 가능하여 빠르고 효과적으로 연골 생성을 도모할 수 있다. 또한, 이중층의 구조를 갖는 이중 지지체가 체내에서 연골층 및 석회화 연골층과 유사한 구조를 형성하고, 특히 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층이 하부에서 골조직의 재생을 자극함으로써 연골치료효과를 상승시킬 수 있다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명자는 실제 연골구조를 고려한 체내 이식용 지지체를 예의 연구한 결과, 생분해성 고분자 및 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 함유하는 다공성 지지체에, 제대, 양막, 양수로부터 분리, 증식 또는 분화된 세포성분과 배지를 파종한 지지체를 발명한 바 있다. 그러나, 이러한 지지체는 골성분인 인산칼슘계 생체적합성 세라믹이 지지체 전부에 분포되어 실질적으로 하부에서 골조직의 재생을 자극하기 곤란한 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 생분해성 고분자를 포함하는 상부층 및 생분해성 고분자와 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층의 이중층 구조를 갖는 지지체를 제조하고, 이를 손상된 관절연골 부위에 이식해본 결과, 체내에서 연골층 및 석회화 연골층과 유사한 구조를 형성하여 연골생성을 자극하고, 특히 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 함유하는 하부층이 골조직의 재생을 하부에서 자극함에 따라 연골 재생이 현저히 빨라진다는 것을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 관절연골 치료용 지지체는 생분해성 고분자를 포함하는 상부층; 및 상기 상부층 하부에 위치하며, 생분해성 고분자 및 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층으로 이루어지는 이중층의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.

도 1은 관절연골 부위를 H&E 염색한 후 광학현미경으로 관찰한 것이다.

도 1에서 보듯이, 관절연골은 접선층(tangential layer), 전이 층(transitional layer), 방사층(radial layer), 석회화 연골층(calcified cartilage) 및 골층(bone)의 5개의 층으로 구성되어 있으나, 이를 크게 분류하면, 연골층, 석회화 연골층, 골층으로 나눌 수 있다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체는 체내에서 실제 관절연골 구조와 유사하게 연골층 및 석회화 연골층을 조성하여 연골형성을 자극하며, 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하는 하부층은 골조직의 재생을 하부에서 자극하여 연골 재생이 증진된다.

인산칼슘계 생체적합성 세라믹은 생체 적합성(biocompatibility)과 생체친화성(bioaffinity)이 우수한 것으로, 하이드록시 아파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆OH₂), 불소화 아파타이트, 인산삼칼슘(Ca₃(PO₄)₂) , 인산일칼슘(Ca₂P₂O₇), 및 육인산사칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이중 지지체는 생분해성 천연고분자 또는 합성고분자에 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 첨가하여 하부층을 제조한 뒤, 상부층을 이루는 생분해성 천연고분자 또는 합성고분자를 추가하여 제조하며, 단결정 소금을 혼합하여 건조한 후 소금을 물에 용해시켜 내는 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), CO₂가스를 이용하여 고분자를 팽창시키는 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 고분자 용액에 함유되어 있는 용매를 비용매속에 담가 다공성을 만드는 상분리법(thermally induced phase separation technique), 고분자 용액과 물을 혼합하여 유화 용액으로 제조한 후 액체 질소로 냉동시키고 동결건조하는 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method) 등의 기존의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 생분해성 고분자는 일정 기간 후 체내에서 자발적으로 분해되는 것으로, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성 고분자를 말한다. 대표적으로 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(poly(ε-carprolactone)), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리비닐알코올(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 (poly(N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체 (poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer), 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 가능하다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체에 제대, 양수 또는 양막으로부터 분리한 간엽줄기세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 유래한 것으로, 연골세 포(chondrocyte) 또는 골세포(osteocyte)로 분화될 수 있는 전구세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 분화된 연골세포 또는 골세포 중에서 선택된 하나 이상의 세포와 배지를 파종하여, 생체 내에서 상기 세포의 분화 및 증식을 유도하는 것이 바람직하다.

이때, 본 발명의 이중 지지체를 배지에 담근 후 세포성분을 배지에 현탁한 세포현탁액을 파종하거나, 이중 지지체에 세포현탁액을 바로 파종하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

제대, 양수, 또는 양막으로부터 간엽줄기세포를 분리, 증식 또는 배양하는 방법과 간엽줄기세포를 분화시키는 방법은 기존의 공지된 방법 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체의 세포성분 중, 간엽줄기세포는 전형적인 골수의 간질세포(stromal cells)와 달리 다중분화능(multipotent)이 있어서, 적절한 분화 조건 하에서 뼈, 연골, 지방조직, 근육, 건 등과 같은 간엽 조직으로 분화될 수 있다. 또한, 제대, 양막, 양수 유래 간엽줄기세포는 미분화 상태를 유지(self-renewal)하는 능력이 있으므로, 특정한 세포나 조직으로 분화되지 않으면서 적절한 조건하에서 증식할 수 있는 세포이다.

또한, 상기 전구 세포는 상기 간엽줄기세포에서 유래하는 세포 중에서, 간엽줄기세포가 연골세포 또는 골세포로 분화되는 과정 중 얻어질 수 있는 모든 전구세포들과 연골모세포(chondroblast) 및 골모세포(osteoblast) 등을 모두 포함한다.

상기 세포성분은 골수, 근육, 피부 등의 일반간엽조직으로부터 분리된 간엽 줄기세포에서 유래한 세포들에 비해, 더욱 어린 개체로부터 유래한 세포이므로 세포의 증식 및 분화 능력이 훨씬 우수하다.

이러한 세포성분은 출산시 발생하는 부산물인 제대, 양막 또는 양수를 사용하므로, 별도의 시술이 필요한 골수 등의 일반간엽조직 보다 수득하는 것이 용이한 장점이 있다.

또한, 기존의 제대혈로부터 세포를 분리하는 경우, 제대혈은 그 양이 적어 한번에 확보할 수 있는 세포의 양이 많이 않은 단점이 있었으나. 제대 전체, 양막, 양수로부터 세포성분을 분리하는 경우, 다양한 부분에서 더 많은 세포를 확보할 수 있어, 연골부위를 치료하기 위해 확보해야하는 세포의 수를 얻기 위한 배양시간을 단축할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 이중 지지체의 상부층의 부피비율은 전체 관절연골 치료용 이중지지체의 70 내지 80%인 것이 바람직하다. 만약 상부층의 부피비가 상기 범위 미만이면 연골 재생 효과가 미미하고 이와 반대로 부피비가 상기 범위를 초과하면 상대적으로 하부층의 부피비가 감소하여 골조직의 재생을 자극하는 효과가 감소한다.

본 발명의 이중 지지체에 파종되는 배지는, 세포성분을 현탁하기 위한 것으로, DMEM 배지를 비롯하여 McCoys5A 배지(Gibco), Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 일반적으로 사용되는 세포배양용 배지는 모두 가능하며, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 이중 지지체 중 상부층 또는 하부층은 글루코사민 또는 콘드로이친 황산염을 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 글루코사민 또는 콘드로이친 황산염은 관절의 연골 조직의 주요 구성 성분으로서, 관절 조직의 기능과 탄성에서 중요한 역할을 하므로, 연골재생을 더욱 촉진할 수 있다.

또한, 하부층의 하이드록시 아파타이트는 0.001 내지 30 중량% 함유되는 것이 바람직하다. 만약 하이드록시 아파타이트의 함량이 상기 범위 미만이면 그 생리 활성 효과가 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 복합 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않아서 지지체의 기계적 강도가 약해지게 된다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체에 최종 함유되는 세포는 1×10⁶ 내지 5×10⁷개인 것이 연골재생 효율 면에서 바람직하다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체는 실제 연골의 구조와 보다 유사한 연골층 및 석회화 연골층을 인공적으로 조성함으로써 연골 형성을 자극하고, 하부층에 포함된 인산칼슘계 생체적합성 세라믹이 하부에서 골조직 재생을 자극하여, 연골치료효과를 상승시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1 내지 12)

1. 양수, 양막, 및 제대로부터 줄기세포의 분리 및 배양

양수, 양막, 제대는 만삭 정상 산모의 제왕절개 또는 질식 분만 시 산모의 동의 아래 태아로부터 채취하였으며, 채취한 후 24시간 내에 실험에 사용하였다.

보통 임신 말기에는 양수(羊水)의 양이 보통 600mL 내지 1,000mL이다. 이 양수를 출산시 따로 멸균된 병에 분리하여 수거한 후, 이를 저온 원심분리기에서 4℃, 400xg, 10분 정도 분리하여 상층액과 부유 세포 및 단백질을 분리하여, 상층액을 버리고 침강된 고형분을 채취하였다.

채취된 양수 속 고형분, 양막과 제대, 이 세 가지를 각각 적당한 크기로 자른 후, 이 시료를 100 U/L의 페니실린(penicillin, GIBCO, USA)과 100 μg/L의 스트렙토마이신(streptomycin, GIBCO, USA)이 첨가된 DPBS(Ca² ⁺, Mg² ⁺-free dubecco’s phosphate-buffered saline, GIBCO, USA)로 전체를 잘 세척한 다음, 다시 DPBS로 2회 세척하여 시료 속의 혈액 등을 제거하였다.

0.5%의 콜라게나제(collagenase, GIBCO, USA) 에 시료를 넣고 37℃에서 1시간 동안 처리 후, DPBS를 시료의 10배 부피로 희석하여 용액을 분리하였다. 얻은 용액에 10%의 FBS(fetal bovine serum, Hyclone, USA)가 첨가된 low glucose type DMEM (GIBCO, USA)을 5ml 첨가하여 실온에서 300xg의 조건으로 5분간 원심분리하였다.

원심분리 후 상층액을 제거하고 low glucose type DMEM으로 2회 세척하였다. 100U/L의 페니실린, 100ug/L의 스트렙토마이신, 10%의 FBS 및 10ng/ml의 EGF(endothelial growth factor, Peprotech, Israel)가 첨가된 low glucose type DMEM 배지에 분리된 세포를 2 x 10⁴ cells/cm²의 농도가 되도록 조절하여 첨가한 후 37℃, 5% CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

배양 3일 후 배양용기의 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하였고, 매 3일 간격으로 배양액을 교체하여 세포를 얻었다.

도 2는 제대 유래 줄기세포(6th passage)의 현미경 사진이다.

양수, 양막, 제대로부터 추출한 세포들이 거의 동일한 특성을 나타내었고, 이후 실험에서는 제대에서 추출한 세포를 사용하였다.

2. 제대 유래 줄기세포의 특성 분석

역전사 중합효소 연쇄반응과 면역세포화학 염색법을 이용하여 유전자 및 단백질 발현을 분석하고, 성장 속도를 조사하여 골수 유래 중간엽줄기세포와 제대 유래 줄기세포의 특성을 비교, 분석하였다.

사람의 제대(탯줄)로부터 골수 유래 중간엽줄기세포(BM-MSC)와 유사한 특성을 가진 성체줄기세포 분리 결과, 두 종류의 세포가 분리되었다.

이 세포들은 섬유아세포(fibroblast)와 유사한 형태를 나타냈으며, 이 중 한 종류는 1개월 동안 3번의 계대배양을 거치며 분열을 멈추었고, 본 발명에 사용된 다른 한 종류는 세포끼리 그물무늬를 형성하는 형태를 나타냈으며, 4개월 동안 10번의 계대배양을 거치며 27회 분열한 후 분열을 멈추는 특성을 보였다.

역전사 중합효소 연쇄반응해 본 결과, 도 3에서 보듯이, 제대 유래 줄기세포는 PAX-6, SCF, BMP-4, Nestin, ADAM-12, HLA class I 그리고 HLA class II의 DR-α 유전자를 발현하였고, GATA-4와 Brachyury 유전자는 발현하지 않았다. 또한, 5개월 동안 냉동보관 후 해동하여 배양된 제대 유래 줄기세포의 유전자와 단백질 발현양상은 냉동하지 않은 세포의 결과와 동일하였다.

이 같은 연구결과로 미루어 제대 유래 줄기세포와 골수 유래 중간엽줄기세포의 유전자 및 단백질 발현 양상은 유사하나, 분열 및 증식능력에 있어서 제대 유래 줄기세포가 골수 유래 중간엽줄기세포보다 높은 것으로 여겨진다.

따라서 제대 유래 줄기세포는 치료를 목적으로 하는 임상적용에 있어 골수 유래 줄기세포보다 다양하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

3. 관절연골 치료용 이중 지지체 제조 및 기계적 강도 확인

본 발명의 이중 지지체 제조를 위해, 다음과 같이 고분자 물질을 이용하여 제조하고, 그 기계적 강도를 확인하는 실험을 사전에 실행하여 중합체의 기계적 성질을 확인하였다.

고분자를 이루는 성분들의 농도 또는 가감에 따른 기계적 강도를 확인하기 위해, 하이드록시 아파타이트를 최종 30 중량% 또는 15 중량% 함유하면서 각기 다른 농도의 콜라겐, 히알루론산, 인산일칼슘을 함유하는 약산성의 하층용 고분자 수용액과, 콜라겐, 히알루론산과 글루코사민을 함유하는 상층용 고분자 수용액을 각각 제조하였다. 이때 인산일칼슘 또는 글루코사민의 농도는 0.5 중량%, 1.0 중량%, 1.5 중량%, 2.0 중량%이었다.

하층용 용액을 적당한 크기의 몰드(mold)에 붇고 냉동고에 넣어 동결시킨 후 다시 상층용 용액을 위에 붇고 냉동고에 넣어 이중층을 이루도록 하여 완전히 동결시켰다. 동결된 지지체를 동결건조기에 넣어 완전히 건조될 때까지 충분히 건조하여 이중 지지체를 제조하고, 가교결합을 발생시켜 강도를 강화시키고 제품의 살균 소독을 위하여 자외선을 2 내지 4시간 조사시켜 최종적으로 100 내지 400 ㎛의 크기의 미세 다공성이며 이중구조를 가지는 지지체를 제조하였다(도 4 참조).

제조된 이중 지지체의 기계적 강도를 만능재료시험기를 이용하여 측정하고, 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

구분	하부층(중량%)				상부층(중량%)			인장강도 (g/cm²)
구분	콜라겐	히알루론산	하이드록시아파타이트	인산일칼슘	콜라겐	히알루론산	글루코사민	인장강도 (g/cm²)
실시예1	74.5	10	15	0.5	95.5	4	0.5	111.9
실시예2	74.0	10	15	1.0	95.0	4	1.0	126.3
실시예3	73.5	10	15	1.5	94.5	4	1.5	124.4
실시예4	73.0	10	15	2.0	94.0	4	2.0	132.5
실시예5	74.5	10	15	0.5	89.5	10	0.5	155.6
실시예6	74.0	10	15	1.0	89.0	10	1.0	171.9
실시예7	73.5	10	15	1.5	88.5	10	1.5	151.3
실시예8	73.0	10	15	2.0	88.0	10	2.0	138.1
실시예9	59.5	10	30	0.5	95.5	4	0.5	257.5
실시예10	59.0	10	30	1.0	95.0	4	1.0	326.9
실시예11	58.5	10	30	1.5	94.5	4	1.5	257.5
실시예12	58.0	10	30	2.0	94.0	4	2.0	336.9
실시예13	59.5	10	30	0.5	89.5	10	0.5	247.5
실시예14	59.0	10	30	1.0	89.0	10	1.0	388.1
실시예15	58.5	10	30	1.5	88.5	10	1.5	309.4
실시예16	58.0	10	30	2.0	88.0	10	2.0	247.5

상기 표 1에서 보듯이, 하이드록시아파타이트를 30 중량% 첨가한 지지체가 15 중량%보다 더 좋은 인장강도를 나타내었으며, 히알루론산의 농도변화는 인장강도에 큰 영향을 미치지 않는 것을 관찰할 수 있었으며, 일반적으로 조직배양용 지지체로 사용할 수 있다고 알려진 150g/m²이상의 강도를 나타내었다. 반면 상층의 글루코사민 2 중량%를 함유하는 지지체가 강도는 다소 나빠져도 제품의 적용시 모양을 변형하기 좋은 유연성을 가지는 것을 알 수 있었다. 이러한 물질들의 조합으로 연골손상부위의 치료에 적용하기에 적당한 정도의 우수한 강도 및 유연성을 지니는 지지체와 그 혼합 조성을 선택할 수 있었다.

4. 제대 유래 세포성분 및 배지 파종

상기 제조된 이중 지지체 중 하이드록시 아파타이트를 최종 30 중량% 함유하는 실시예 9의 지지체(size:4×4×3 mm)를 선택하여, DMEM 배지에 함침하여 충분히 골고루 적셔지도록 하였고, 이후 1×10⁷개의 세포가 포함된 세포 현탁액을 원심분리로 농축한 뒤 상층액을 버리고 세포 부분만을 다공성 지지체에 파종하였다.

적당량의 배지를 첨가한 후 세포배양기에서 36시간 정도 배양시켜 최종적으로 4×4×3 mm 크기에 세포 1×10⁷ 개가 정착되도록 하여, 본 발명의 관절연골 치료용 지지체를 제조하였다.

(실험예)

(실험예1)

(관절연골 치료효과 확인)

몸무게가 25Kg 정도의 실험용 토끼(뉴질랜드 화이트종)를 체중에 따른 적절한 양의 마취제를 이용하여 마취를 시켜 전신마취가 되었음을 확인하고, 양쪽 하지의 슬관절 부위를 면도한 후, 앙와위 자세를 유지시키면서 반창고로 고정하였다.

양측 슬관절 부위를 베타딘으로 소독하고, 슬개골을 촉지하여 위치를 확인한 후, 슬관절의 위,아래, 슬개골의 내측을 지나는 절개선을 따라 방정중 접근(paramedian approach)으로 슬관절 내에 도달하고, 슬개골을 외측으로 젖히면서 슬관절을 굴곡시켜 관절 내부를 관찰하였다. 특이한 병적 소견이 없음을 확인한 후, 슬개골구 측면 중앙에 펀치를 이용하여 지름 3㎜, 깊이 3㎜의 구멍을 만들었다(도 5 참조). 상기와 같이 연골 손상을 유발한지 3∼4개월 후에 손상 부위를 관찰하여, 연골손상부위가 자연 치유되지 않았음을 확인할 수 있었다.

한편, 연골손상부위에 핀셋을 이용하여 상기에서 제조한 본 발명의 지지체를 연골손상부 위에 이식하였다. 이후 슬개골을 원래 위치로 되돌린 후, 슬개골 주위의 연부 조직을 흡수성 실로 봉합하고, 피부를 비흡수성실로 봉합하였다.

이때 반대 측 다리를 대조군으로 하여 콜라겐으로 제조된 지지체를 이식하였다. 토끼가 마취에서 깨어나는 것을 확인한 후 자유롭게 움직일 수 있도록 허용하고, 수술 후와 그 다음날까지 감염을 막기 위해 항생제를 투여하였다.

8주가 지난 후, 각 토끼로부터 손상 및 치료를 수행하였던 관절연골부위의 절편을 얻어 새로 형성된 연골을 비교하고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에서 보듯이, 본 발명의 이중 지지체를 이식한 후 연골 세포층이 새로 잘 생성된 것을 확인할 수 있었으며, 세포층의 전체적인 모양도 손상부위를 만들기 전하고 비슷하게 잘 치료가 된 것을 알 수 있었다.

본 발명의 이중 지지체를 이식한 경우 원래의 정상연골세포와 거의 같은 형태의 연골세포가 새로 생성되었는데, 현재까지의 보고에서는 보통 12주가 걸리는 연골의 재생이 8주 만에 이루어져 본 발명의 지지체에 의해 연골생성에 촉진이 되는 것을 알 수 있다. 반면 콜라겐으로 제조된 다공성 지지체를 주입한 경우는 세포의 형태가 정상세포에 비해 조잡하며 그 밀도도 낮았다.

본 발명의 관절연골 치료용 이중 지지체는 연골세포 생성효율이 우수하여, 효과적으로 관절연골 손상을 치료할 수 있다.

도 2는 제대 유래 줄기세포(6th passage)의 현미경 사진이다.

도 3은 제대 유래 줄기세포, 해동된 제대 유래 줄기 세포 및 골수 유래 중간엽줄기세포를 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여, 유전자 발현을 비교한 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 관절연골 치료용 이중 지지체의 SEM(Scanning Electronic Microscope) 사진이다.

도 5는 본 발명의 실험예 1에서 인위적으로 토끼 연골손상을 유발한 뒤, 그 부위를 촬영한 사진이다.

도 6은 본 발명의 이중 지지체를 이식한 뒤 8주 후 재생된 연골부위를 촬영한 사진이다.

도 7은 본 발명의 이중 지지체를 이식한 뒤 8주 후 재생된 연골부위를 염색한 후 광학현미경으로 관찰한 것이다.

Claims

생분해성 고분자를 포함하여 성형 제조된 상부층; 및

상기 상부층 하부에 위치하며, 생분해성 고분자 및 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하여 성형 제조된 하부층으로 이루어지는 이중층의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 관절연골 치료용 이중 지지체에,

제대, 양수 또는 양막으로부터 분리한 간엽줄기세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 유래한 것으로, 연골세포(chondrocyte) 또는 골세포(osteocyte)로 분화될 수 있는 전구세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 분화된 연골세포 또는 골세포 중에서 선택된 하나 이상의 세포와 배지를 파종하여,

생체 내에서 상기 세포의 분화 및 증식을 유도하는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는,

콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(poly( ε-carprolactone)), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜 (poly (ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 (poly (N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체 (pol y(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 인산칼슘계 생체적합성 세라믹은,

하이드록시 아파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆OH₂), 불소화 아파타이트, 인산삼칼슘(Ca₃(PO₄)₂), 인산일칼슘(Ca₂P₂O₇) 및 육인산사칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 상부층 또는 하부층은,

글루코사민 또는 콘드로이친 황산염을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 상부층의 부피비율은,

전체 관절연골 치료용 이중 지지체의 70 내지 80 %인 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 하부층은,

하이드록시 아파타이트를 0.001 내지 30 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.
제1항에 있어서, 상기 관절연골 치료용 지지체에는

제대, 양수 또는 양막으로부터 분리한 간엽줄기세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 유래한 것으로, 연골세포(chondrocyte) 또는 골세포(osteocyte)로 분화될 수 있는 전구세포; 또는 상기 간엽줄기세포로부터 분화된 연골세포 또는 골세포 중에서 선택된 세포가 1×10⁶ 내지 5×10⁷개 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 관절연골 치료용 이중 지지체.