KR101507589B1 - 전기방사된 젤라틴/bcp와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법 - Google Patents
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Abstract
전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법이 개시되어 있다. 본 발명은, (a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조하는 단계; (b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조하는 단계; (c) 가교제를 준비하는 단계; (d) 상기 키토산 하이드로젤 층에 상기 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 위치시킨 후에 상기 가교제로 가교시키는 단계; 및 (e) 상기 키토산 하이드로젤 층과 전기방사된 젤라틴/BCP의 합성층을 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 골 조직 재생시 최소한의 영향을 주고 골 출혈시 효과적인 지혈작용을 할 수 있도록 한 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법에 관한 것이다.
출혈은 수술중 발생하는 가장 흔한 장애물중 하나이다. 많은 혈액 손실은 정상적인 신체 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 출혈을 안정시키는 것이 매우 중요하다. 지혈을 하려면 혈액 응고제나 거즈, 지혈 클램프와 같은 혈관 폐색 장치를 사용해야 한다. 이러한 유형의 지혈제는 응고 인자를 서서히 활성화 하거나, 절단시킨 혈관이 축소하는 성질을 활용한다. 이미 수많은 지혈제가 연조직 출혈 적용을 위해 개발되었으나, 골 출혈에는 적용할 수 없다. 이것은 골 출혈시 혈액의 흐름이 안정적으로 혈전을 형성시키는 것을 방해하고, 골 조직 자체가 이 조건을 통해 구조를 유지하기 때문이다. 골 왁스를 이용한 적용 방법을 확보하였지만, 몇몇 연구 결과로 골 재생에 부정적인 영향을 주는 것으로 확인되었다. 따라서, 지혈 작용과 함께 골 재생에 최소한으로 영향을 주는 뼈 지혈제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 골 조직 재생시 최소한의 영향을 주고 골 출혈시 효과적인 지혈작용을 제공할 수 있도록 한 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생체적합성이 우수한 골 지혈제를 제조할 수 있도록 한 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법은,
(a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조하는 단계; (b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조하는 단계; (c) 가교제를 준비하는 단계; (d) 상기 키토산 하이드로젤 층에 상기 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 위치시킨 후에 상기 가교제로 가교시키는 단계; 및 (e) 상기 키토산 하이드로젤 층과 전기방사된 젤라틴/BCP의 합성층을 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조하는 단계는,
1% 아세트산에 2% w/v의 키토산을 용해시킨 뒤, 여과하여 불순물을 제거하고, 상온에서 4시간동안 보관, 그 후 4℃에서 8시간, -20℃에서 8시간동안 냉각시킨 뒤, 48시간동안 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 동결건조된 키토산은 얼음을 제거하고 거품구조로 만들어 주는 것을 특징으로 한다.
상기 (b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조하는 단계는,
15% w/v 젤라틴과 50 w/w 이상인산칼슘(BCP: Biphasic Calcium Phosphate) 분말을 2,2,2-트리플루오르에탄올 (TFE, 99.0%)에 용해시키고, 24시간동안 교반시켜 균일하게 만드는 단계; 및 상기 젤라틴/BCP 용액을 전기방사시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (c) 가교제를 준비하는 단계는,
80% 에탄올에 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC)와 N-Hydroxyl succinimide (NHS)을 5:2 몰랄 비율로 녹이는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (e) 동결건조시키는 단계는,
100% 에탄올에서 30분, 50% 알코올에서 30분동안 세정한 뒤 -70℃에서 24시간동안 동결건조시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 골 조직 재생시 최소한의 영향을 주고, 골 출혈시 효과적인 지혈 작용을 제공할 수 있는 생체적합성을 가지는 지혈제를 만들 수 있는 효과가 있다.
도 1은 동결건조된 키토산 하이드로젤과 전자방사된 젤라틴/BCP 매트로 합성 뼈 지혈제를 만드는 과정을 보여주는 그래프이다.
도 2는 (A)키토산 하이드로젤의 횡단면 이미지, (B)젤라틴/BCP 전자방사 매트의 표면 이미지, (C)키토산 하이드로젤과 젤라틴/BCP 합성물의 횡단면 이미지, (D)키토산 하이드로젤의 확대이미지, (E)젤라틴/BCP층의 확대이미지이고, 에너지 분광분석(EDS) 그래프를 도시하고 있다.
도 3은 키토산-젤라틴/BCP 지혈제와 젤라틴 전자방사 매트에 MC3T3-E1 세포를 (A)1일, (B)3일, (C)5일, (D)7일간 배양한 후 세포증식을 MTT 법으로 분석한 그래프와 공초점현미경(Confocal) 이미지이다.
도 4는 항 응고처리된 쥐의 혈액을 이용한 키토산-젤라틴/BCP 지혈제의 혈액 흡수도를 나타낸 그래프로서, (A)혈액 흡수시킨 키토산-젤라틴/BCP 지혈제의 횡단면 이미지, (B)키토산 하이드로젤 층, (C)젤라틴/BCP 매트 부분을 확대한 이미지이다.
도 5는 마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-CT)를 이용해 수술 1주(A, B), 3주(C, D)후의 쥐 두개골을 3D로 재구성한 이미지와 골 부피분율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 H&E 염색을 통하여 수술 1주, 3주 후의(A)지혈처리 하지 않은 결함부, (B)지혈처리한 결함부, (C)지혈제를 이식한 결함부를 관찰한 조직 염색 이미지이다.
도 2는 (A)키토산 하이드로젤의 횡단면 이미지, (B)젤라틴/BCP 전자방사 매트의 표면 이미지, (C)키토산 하이드로젤과 젤라틴/BCP 합성물의 횡단면 이미지, (D)키토산 하이드로젤의 확대이미지, (E)젤라틴/BCP층의 확대이미지이고, 에너지 분광분석(EDS) 그래프를 도시하고 있다.
도 3은 키토산-젤라틴/BCP 지혈제와 젤라틴 전자방사 매트에 MC3T3-E1 세포를 (A)1일, (B)3일, (C)5일, (D)7일간 배양한 후 세포증식을 MTT 법으로 분석한 그래프와 공초점현미경(Confocal) 이미지이다.
도 4는 항 응고처리된 쥐의 혈액을 이용한 키토산-젤라틴/BCP 지혈제의 혈액 흡수도를 나타낸 그래프로서, (A)혈액 흡수시킨 키토산-젤라틴/BCP 지혈제의 횡단면 이미지, (B)키토산 하이드로젤 층, (C)젤라틴/BCP 매트 부분을 확대한 이미지이다.
도 5는 마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-CT)를 이용해 수술 1주(A, B), 3주(C, D)후의 쥐 두개골을 3D로 재구성한 이미지와 골 부피분율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 H&E 염색을 통하여 수술 1주, 3주 후의(A)지혈처리 하지 않은 결함부, (B)지혈처리한 결함부, (C)지혈제를 이식한 결함부를 관찰한 조직 염색 이미지이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법은 다음과 같다.
(a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조한다.
1% 아세트산에 2% w/v의 키토산을 용해시킨 뒤, 여과하여 불순물을 제거하고, 상온에서 4시간동안 보관, 그 후 4℃에서 8시간, -20℃에서 8시간동안 냉각시킨 뒤, 48시간동안 동결건조시켜 다공성 구조를 가지는 키토산 하이드로젤 층을 제조한다. 이때, 동결건조된 키토산은 얼음을 제거하고 거품구조로 만들어 준다.
(b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조한다.
15% w/v 젤라틴과 50 w/w 이상인산칼슘(BCP: Biphasic Calcium Phosphate) 분말을 2,2,2-트리플루오르에탄올 (TFE, 99.0%)에 용해시키고, 24시간동안 교반시켜 균일하게 만든 뒤, 전기방사하여 젤라틴/BCP 전기방사 매트를 제조한다.
(c) 가교제를 준비한다.
80% 에탄올에 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC)와 N-Hydroxyl succinimide (NHS)을 5:2 몰랄 비율로 녹인 가교제를 준비한다.
(d) 상기 키토산 하이드로젤 층에 상기 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 위치시킨 후에 상기 가교제로 가교시킨다.
(e) 상기 키토산 하이드로젤 층과 전기방사된 젤라틴/BCP의 합성층을 동결건조시킨다.
가교 후, 100% 에탄올에서 30분, 50% 알코올에서 30분동안 세정한 뒤 -70℃에서 24시간동안 동결건조시킨다.
재료의 특성은 주사전자 현미경(SEM)을 이용해 도 2에 도시되어 있다.
도 2는 (A)키토산 하이드로젤의 횡단면 이미지, (B)젤라틴/BCP 전자방사 매트의 표면 이미지, (C)키토산 하이드로젤과 젤라틴/BCP 합성물의 횡단면 이미지, (D)키토산 하이드로젤의 확대이미지, (E)젤라틴/BCP층의 확대이미지이고, 에너지 분광분석(EDS) 그래프를 도시하고 있다.
하이드로젤의 기공 크기는 직경 126±35.72 m로 측정되었고, 전자방사된 섬유는 평균 14.2553±7.92m로두께가 균일하지 않은데 이것은 BCP 분말을 포함하고 있기 때문이다.
지혈제의 세포에 대한 적합성은 MC3T3-E1 세포를 7일간 배양한 후 MTT 분석 그래프를 통해 도 3에 도시하였다. 도 3의 (A) 내지 (D)의 사진은 세포를 1, 3, 5, 7일간 배양한 후 FITC와 DAPI 염색하여 공초점현미경으로 관찰한 이미지이다.
5분마다 키토산-젤라틴/BCP 뼈 지혈제의 혈액 흡수량을 측정하여 도 4에 도시하였다. 젤라틴/BCP 층의 혈액 여과 활동은 H&E 염색시킨 지혈제(A)를 통해 관찰할 수 있다. 여과된 적혈구중 적은 양이 키토산 하이드로젤 층(B)에 있는 것을 볼 수 있지만, 대부분 전자방사 매트 층(C)에 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 수술 후 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT)를 이용해 재구성한 이미지와 골 면적비율을 나타낸 그래프이다. 1주동안 지혈제를 이식한(A) 두개골과 지혈처리를 한(B) 이미지에서 골 재생에 약간의 효과를 가지는것을 볼 수 있다. 3주동안 지혈제를 이식한(C) 두개골과 지혈 처리를 한(D)이미지를 통해 합성 지혈제 사용이 골 재생에 더 나은 효과를 주는 것을 알 수 있다.
이 결과로 키토산 하이드로젤과 젤라틴/BCP 전기방사 매트 조성의 뼈 지혈제는 골 재생에 부정적인 영향을 주지 않고, 오히려 더 나은 효과를 주는 것을 알 수 있다. 골 부피분율(도 5)와 이식 후 조직염색 이미지(도 6)을 보면 지혈제를 이식한 두개골에서 더 많은 골 재생이 이루어진 것을 볼 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당기술분야의 숙련된 당업자는 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (6)
- (a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조하는 단계;
(b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조하는 단계;
(c) 80% 에탄올에 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC)와 N-Hydroxyl succinimide (NHS)을 5:2 몰랄 비율로 녹인 가교제를 준비하는 단계;
(d) 상기 키토산 하이드로젤 층에 상기 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 위치시킨 후에 상기 가교제로 가교시키는 단계; 및
(e) 상기 키토산 하이드로젤 층과 전기방사된 젤라틴/BCP의 합성층을 동결건조시키는 단계;를 포함하고,
상기 (a) 다공성 구조를 갖는 키토산 하이드로젤 층을 제조하는 단계는, 1% 아세트산에 2% w/v의 키토산을 용해시킨 뒤 여과하여 불순물을 제거하는 단계; 및 상온에서 4시간동안 보관한 후 4℃에서 8시간, -20℃에서 8시간동안 냉각시킨 뒤, 키토산을 48시간동안 동결건조시키는 단계를 포함하며,
상기 (b) 전기방사된 젤라틴/BCP 매트를 제조하는 단계는, 15% w/v 젤라틴과 50 w/w 이상인산칼슘(BCP: Biphasic Calcium Phosphate) 분말을 2,2,2-트리플루오르에탄올 (TFE, 99.0%)에 용해시키고, 24시간동안 교반시켜 균일하게 만드는 단계; 및 상기 젤라틴/BCP 용액을 전기방사시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 동결건조된 키토산은 얼음을 제거하고 거품구조로 만들어 주는 것을 특징으로 하는 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 (e) 동결건조시키는 단계는,
100% 에탄올에서 30분, 50% 알코올에서 30분동안 세정한 뒤 -70℃에서 24시간동안 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 전기방사된 젤라틴/BCP와 키토산 하이드로젤 조성의 골 지혈제 제조방법.
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| KR20220010831A (ko) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 주식회사 테라시온 바이오메디칼 | 국소 지혈 파우더 조성물 및 이의 제조방법 |
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