CN103736153A

CN103736153A - 单层及双层聚己内酯基引导组织再生膜及其制备方法

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Publication number: CN103736153A
Application number: CN201310745877.9A
Authority: CN
Inventors: 石锐; 田伟; 张立群; 薛佳佳; 陈大福
Original assignee: TRAUMA ORTHOPAEDICS INST BEJING; Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: TRAUMA ORTHOPAEDICS INST BEJING; Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明涉及单层及双层聚己内酯基引导组织再生材料及其制备方法。它是以聚己内酯和其他可降解脂肪族聚酯为主要原材料通过静电纺丝的方法制备单层引导组织再生膜，或以聚己内酯和可降解脂肪族聚酯、可降解天然高分子材料及生物活性粒子为主要原材料,通过层层静电纺丝的方法制备成具有致密层和疏松层结构的双层引导组织再生膜。本发明膜材料具有优异的生物相容性、机械性能和与组织修复进程一致的降解性能，能有效的阻止成纤维细胞等向组织缺损处的长入，同时促进组织的再生修复，不必二次手术取出。

Description

单层及双层聚己内酯基引导组织再生膜及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种可降解引导组织再生膜材料及其制备方法。尤其涉及一种由聚己内酯为主要构成的基体材料通过静电纺丝技术或静电纺丝技术与冷冻干燥技术结合制备的多孔引导组织再生膜。

背景技术

引导组织再生(Guide Tissue Regeneration,GTR)技术是80年代末90年代初发展起来的一项新技术。其原理是利用膜的物理屏障功能将病损区与周围组织隔离,创造一个相对封闭的组织环境,从而使成骨细胞优先迁移、生长。GTR的应用为牙周病的治疗、牙种植区骨量不足及其它骨缺损的修复、骨折的愈合提供了一个新的有效途径。

目前GTR膜材料可分为不可吸收和可吸收两大类。不可吸收引导组织再生膜主要由聚四氟乙烯材料制备，主要代表产品为聚四氟乙烯膜虽然具有良好的力学强度，但不能自行降解,需二次手术去除，增加病人的痛苦及手术费用，且细胞亲和性差,易导致伤口裂开,膜早期暴露,影响伤口的愈合。因此,对可吸收膜材料的开发和研究便成为GTR技术发展的重要方向。

目前应用最为普遍的GTR膜以天然材料胶原为主，代表产品为瑞士Geistlich公司生产的

和美国Zimmer公司生产的

分别以猪皮胶原及牛跟腱胶原制备。其中也是目前临床应用的金标准。天然胶原GTR膜虽然具有良好的生物相容性，但其力学强度相对较弱，降解较快，植入后易造成早期降解塌陷。为了增强及延长降解时间，通常需要加厚膜的厚度，这就为种植和修复提供了不利。此外，天然材料制备的GTR膜还存在产品质量受原料来源限制，价格昂贵等缺陷。

为了克服天然胶原材料制备的GTR膜存在的缺陷，一些人工合成可降解材料制备的GTR产品也相继问世，主要商品化产品主要有Guidor、Resolut、Vicryl、Atrisorb、Epi-Guide以及Vivosorb，这些产品的材料都是聚乳酸，而由于聚乳酸降解产物为酸性，容易导致周围组织的炎症反应。

聚己内酯是FDA认证的生物材料，在临床上有大量的应用，由于PCL的生物相容性与PLA、PGA类似，但降解速度相对较慢，不会产生组织内大量酸的堆积从而引发明显的炎症发应，因此我们选择PCL作为主要基体材料制备引导组织再生膜。但目前未见以PCL作为主要基体材料的GTR引导组织再生膜产品。

通过静电纺丝技术制备的膜材料，其纤维直径在几十纳米到几微米之间，无规排列，且纤维间搭桥孔径通常小于纤维细胞的直径，因此静电纺丝技术非常适合制备引导组织再生膜。通过静电纺丝技术将PCL作为主要基体材料制备GTR膜的相关研究也很少，Fang Yang等在其研究中利用静电纺丝制备了PCL/纳米羟基磷灰石复合材料膜，但只涉及了PCL与纳米羟基磷灰石两种材料的共混，且只制备了单层膜，而目前的发展趋势是制备双层或多层结构的GTR膜，不同结构层发挥不同的功能性。一般需要阻挡纤维组织细胞透过的屏蔽层以及具有良好的附着能力、且能对成骨细胞的粘附增殖有一定作用的疏松层。本发明的内容在以PCL为主要基体材料制备单层膜的基础上，还通过改变静电纺丝的条件以及通过在静电纺丝膜上浇注及冷冻干燥的手段，制备出新型的含致密层及疏松层的GTR膜。

一种引导组织再生膜，其特征为：以聚己内酯作为主要基体材料，具有单层或双层多孔结构；

(1)单层膜以纯聚己内酯或聚己内酯与可降解脂肪族聚酯共混作为基体材料，其中聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的质量比为50/50-100/0，结构特征为具有无规排列的纳米至微米级纤维结构，平均孔径为2-6μm，纤维直径为200nm-1200nm，膜厚度为50-500μm；

(2)双层膜由致密层和疏松层构成；

1)致密层材料为纯聚己内酯或聚己内酯与可降解脂肪族聚酯共混材料，其中聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的质量比为50/50-100/0，结构特征为具有无规或网格状排列的纳米至微米级纤维结构，平均孔径为2-6μm，纤维直径为200nm-1200nm，膜厚度为25-250μm；

2)疏松层材料为纯聚己内酯与无机生物活性粒子的共混材料，或聚己内酯与可降解天然高分子材料和无机生物活性粒子制备的共混复合材料，并采用交联剂对可降解天然高分子材料进行交联；其中聚己内酯与可降解天然高分子材料的质量比为10/90-100/0，无机生物活性粒子与聚合物的质量比为0/100-50/100；疏松层结构特征为平均孔径5-100μm，纤维直径为200nm-7μm，厚度为25-250μm。

其中可降解脂肪族聚酯包括：聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物其中的一种或一种以上混合物。其中可降解天然高分子材料包括：Ⅰ型胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素中的一种或一种以上混合物；

其中无机生物活性粒子包括：颗粒尺寸为1-100nm的羟基磷灰石粒子、磷酸钙系生物活性玻璃粒子、磷酸三钙生物陶瓷粒子或碳酸钙粒子中的一种或几种。

其中交联剂包括：甲醛、戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种。

当制备单层引导组织再生膜含有如下步骤：

(1)将聚己内酯溶于有机溶剂中，室温磁力搅拌12-24h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液A；

(2)将可降解脂肪族聚酯溶于有机溶剂中，室温磁力搅拌12-24h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液B；

(3)按一定体积比例将溶液A与溶液B混合，室温磁力搅拌12h，得到聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的总质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液C，溶液C中聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的质量比50/50-100/0；

(4)用溶液C进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为100-600rpm，纺丝液流动速率为0.5-10mL/h,电压7-20kV，接收距离8-30cm，纺丝0.5-30h,得到厚度50-500μm的电纺丝纤维膜；

(5)静电纺丝结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置2-7天，包装消毒。

当制备双层引导组织再生膜含有如下步骤：

(3)将可降解天然高分子材料溶于有机溶剂中，室温磁力搅拌12-24h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液C；

(4)按一定体积比例将溶液A与溶液B混合，室温磁力搅拌12h，得到聚己内酯和可降解脂肪族聚酯的总质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液D，溶液D中聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的质量比50/50-100/0；

(5)在溶液D中加入一定量的生物活性粒子，超声30min‐2h，室温下磁力搅拌12h，得到聚合物的总质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液E，聚合物为聚己内酯和可降解脂肪族聚酯其中无机生物活性粒子与聚合物的质量比为0/100-50/100；

(6)按一定体积比例将溶液A与溶液C混合，室温磁力搅拌12h，得到聚合物质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液F，溶液F中聚己内酯与可降解天然高分子材料的质量比为10/90-100/0；

(7)在溶液F中加入一定量的生物活性粒子，超声30min‐2h，室温下磁力搅拌12h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液G，其中无机生物活性粒子与聚合物的质量比为0/100-50/100；

(8)用溶液D进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为100-600rpm，纺丝液流动速率为0.5-10mL/h,电压7-20kV，接收距离8-30cm，纺丝0.5-15h,得到厚度25-250μm的致密层膜；

(9)在致密层膜的基础上，用溶液E或溶液G进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为100-600rpm，纺丝液流动速率为0.5-10mL/h,电压7-20kV，接收距离8-30cm，纺丝0.5-15h,得到厚度25-250μm的疏松层膜；

(10)静电纺丝结束后，将电纺丝纤维膜浸泡在浓度为0.01%-3%的交联剂乙醇溶液中交联30min-12h，浸泡结束后在去离子水中浸洗5-10次，将纺丝膜在通风橱中室温放置2-7天，包装消毒。

制备双层引导组织再生膜另一种方法含有如下步骤：

(1)将聚己内酯溶于有机溶剂中，室温磁力搅拌6-24h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液A；将可降解脂肪族聚酯溶于有机溶剂中，室温磁力搅拌6-24h，得到质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液B；按一定体积比例将溶液A与溶液B充分混合，室温磁力搅拌12h，得到聚合物质量浓度为0.04-0.2g/mL的溶液C，溶液C中聚己内酯与可降解脂肪族聚酯的质量比50/50-100/0；用溶液C进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为100-600rpm，纺丝液流动速率为0.5-10mL/h,电压7-20kV，接收距离8-30cm，纺丝0.5-30h,得到厚度25-250μm的致密层膜；

(2)将致密层膜铺在平底容器底部，将疏松层的组成材料溶解于有机溶剂中，然后浇铸在致密层膜的表面，将其在-60℃--20℃下冷冻6-12h后，放入真空干燥器中真空干燥4-12h，即得双层引导组织再生膜。

所述的有机溶剂为六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、N,N’-二甲基甲酰胺中的一种或几种混合溶剂。

附图说明

图1是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层引导组织再生膜的宏观图。

图2是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜纺丝纤维SEM照片。

图3是本发明以纯聚己内酯静电纺丝制备的单层纤维膜对成纤维细胞的体外屏蔽作用效果图（在细胞培养液中屏蔽7天后，纤维膜未接触细胞一侧的SEM图）。

图4是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的水接触角示意图。

图5是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的降解30天后的SEM图。

图6是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜在PBS缓冲溶液中（a）降解前和(b)降解后的力学性能（应力-应变曲线），表明降解前材料有良好的手术可操作性和力学强度，降解30天后，材料仍保持较高力学性能，能够起到在体内引导组织再生和保证力学支撑的作用。

图7是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的细胞毒性结果柱状图（细胞毒性检测采用L929细胞，RGR表示细胞的相对增殖率）。

图8是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的细胞毒性实验中，细胞在材料的浸提液中生长24h时的状态,表明材料的浸提液对细胞的生长和形貌没有影响。

图9是L929细胞在本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜上生长不同时间时的O.D值，表明随着时间的延长，细胞可以在材料上粘附增殖。

图10是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的生物相容性能——L929小鼠成纤维细胞在纤维膜上增殖3,5,7天的SEM细胞形貌图。

图11是本发明方法所制备的纯聚己内酯单层膜的兔子体内埋植不同时间后的组织切片图，表明材料在体内具有很好的生物相容性，不会引起明显的免疫反应，无炎症反应和感染的现象发生。

图12是本发明以聚己内酯与聚乳酸共混静电纺丝制备的单层纤维膜照片。

图13是本发明以聚己内酯为致密层，聚己内酯和明胶5：5共混为疏松层制备的双层纤维膜照片(a为致密层一侧，b为疏松层一侧)。

图14是本发明以聚己内酯为致密层，聚己内酯和明胶5:5共混，纳米羟基磷灰石与聚合物质量比为20%为疏松层制备的双层纤维膜照片(a为致密层一侧，b为疏松层一侧)。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明,但本发明并不限于这些实例。

实施例1

1、将聚己内酯溶于DCM/DMF=6：4的混合有机溶剂中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为4%的纺丝液；

2、室温进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为500rpm，纺丝液流动速率为8mL/h,电压8kV，接收距离17cm，纺丝3h,得到厚度300μm左右的电纺丝纤维膜。

3、将得到的纤维膜置于室温下通风橱中干燥72h，使残余溶剂充分挥发。

实施例2

1、将聚己内酯溶于DCM/DMF=5：5的混合有机溶剂中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为20%的纺丝液；

2、室温进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率为1mL/h,电压12kV，接收距离15cm，纺丝20h,得到厚度250μm左右的电纺丝纤维膜。

实施例3

1、将聚己内酯溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为10%的溶液A；

2、将聚乳酸溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为10%的溶液B；

3、将溶液A与溶液B混合，磁力搅拌6h,得到聚己内酯与聚乳酸的质量比1:1，聚合物浓度为10%的纺丝液C；

4、室温用溶液C进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为200rpm，纺丝液流动速率为10mL/h,电压12kV，接收距离15cm，纺丝2h,得到厚度250μm左右的电纺丝纤维膜。

5、将得到的纤维膜置于室温下通风橱中干燥72h，使残余溶剂充分挥发。

实施例4

1、将聚己内酯溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为6%的溶液A；

2、将胶原溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为6%的溶液B；

3、将溶液A与溶液B混合，磁力搅拌6h,得到胶原与聚己内酯的质量比1:1，聚合物浓度为6%的纺丝液C；

4、室温用纺丝液C进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为200rpm，纺丝液流动速率2mL/h，电压12kV，接收距离20cm，纺丝10h,得到厚度250μm左右的单层引导组织再生膜；

实施例5

1、将聚己内酯溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为8%的溶液A；

2、将明胶溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为8%的溶液B；

3、将溶液A与溶液B混合，磁力搅拌6h,得到明胶与聚己内酯的质量比3:7，聚合物浓度为8%的纺丝液C；

4、将聚己内酯溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为10%的纺丝液D；

5、室温用纺丝液C进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为200rpm，纺丝液流动速率1mL/h，电压11kV，接收距离20cm，纺丝10h，得到厚度150μm左右的电纺丝疏松层膜；

6、更换纺丝液D继续进行静电纺丝于步骤5所纺的纤维膜上，纺丝条件为滚筒转动速率为400rpm，纺丝液流动速率为2mL/h,电压12kV，接收距离15cm，纺丝5h,得到总厚度300μm左右的双层引导组织再生膜。

7、将纺丝纤维膜置于浓度为0.5%的京尼平的乙醇溶液中,使明胶发生交联，交联反应30min后，将膜在去离子水中浸洗10次，洗去未反应的京尼平及乙醇溶剂。

8、将得到的纤维膜置于室温下通风橱中干燥72h，使残余溶剂充分挥发。

实施例6

2、将聚乳酸溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到浓度为6%的溶液B；

3、将壳聚糖溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h，得到浓度为6%的溶液C；

4、将溶液A与溶液B混合，磁力搅拌12h,得到聚乳酸与聚己内酯的质量比4:6，聚合物浓度为6%的纺丝液D；

5、将溶液A与溶液C混合，磁力搅拌12h,得到壳聚糖与聚己内酯的质量比5:5，聚合物浓度为6%的纺丝液E；

6、室温用纺丝液D进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率4mL/h，电压12kV，接收距离18cm，纺丝5h，得到厚度250μm左右的电纺丝致密层膜；

7、更换纺丝液E继续进行静电纺丝于步骤6所纺的纤维膜上，纺丝条件为滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率为2mL/h,电压12kV，接收距离18cm，纺丝10h,得到总厚度500μm左右的双层膜。

实施例7

2、将明胶溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h，得到浓度为6%的溶液B；

3、将溶液A与溶液B混合，并加入纳米羟基磷灰石，超声30min,磁力搅拌12h,得到明胶与聚己内酯的质量比5:5，聚合物浓度为6%，纳米羟基磷灰石与聚合物质量比为20%的纺丝液C；

4、室温用纺丝液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率1.5mL/h，电压12kV，接收距离18cm，纺丝10h，得到厚度200μm左右的电纺丝致密层膜；

5、更换纺丝液C继续进行静电纺丝于步骤4所纺的纤维膜上，纺丝条件为滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率为3mL/h,电压12kV，接收距离18cm，纺丝5h,得到总厚度为400μm左右的双层引导组织再生膜。

6、将得到的纤维膜置于室温下通风橱中干燥72h，使残余溶剂充分挥发。

实施例8

1、将聚己内酯溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到聚己内酯浓度为8%的溶液A；

2、将聚羟基乙酸溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h,得到聚羟基乙酸浓度为8%的溶液B；

3、将壳聚糖溶于六氟异丙醇中，室温磁力搅拌12h，得到壳聚糖浓度为8%的溶液C；

4、将溶液A与B混合，磁力搅拌12h,得到聚羟基乙酸与聚己内酯的质量比2:8，聚合物浓度为8%的纺丝液D；

5、将溶液A与溶液C混合，并加入一定质量的生物活性玻璃,磁力搅拌12h,得到壳聚糖与聚己内酯的质量比4:6，聚合物浓度为8%，生物活性玻璃与聚合物的质量比为30%的纺丝液E；

6、室温用纺丝液D进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率2mL/h，电压12kV，接收距离18cm，纺丝5h，得到厚度150μm左右的电纺丝致密层膜；

7、更换纺丝液E继续进行静电纺丝于步骤6所纺的纤维膜上，纺丝条件为滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率为1mL/h,电压12kV，接收距离18cm，纺丝10h,得到总厚度为300μm左右的双层引导组织再生膜。

实施例9

1、将聚己内酯溶于DCM/DMF=5：5的混合有机溶剂中，室温磁力搅拌12h,得到聚己内酯浓度为10%的纺丝液；

2、室温进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒转动速率为300rpm，纺丝液流动速率为4mL/h,电压12kV，接收距离15cm，纺丝4h,得到厚度200μm左右的电纺丝纤维膜。

4、将上述纤维膜平铺于培养皿底部，在其上浇铸浓度为20%（w/w）的明胶水溶液,-40℃冷冻干燥12h，得到厚度为1000μm的双层膜。

Claims

1.一种引导组织再生膜，其特征为：以聚己内酯作为主要基体材料，具有单层或双层多孔结构；

(2)双层膜由致密层和疏松层构成；

2.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜，其中可降解脂肪族聚酯包括：聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物其中的一种或一种以上混合物。

3.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜，其中可降解天然高分子材料包括：Ⅰ型胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素中的一种或一种以上混合物。

4.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜，其中无机生物活性粒子包括：颗粒尺寸为1-100nm的羟基磷灰石粒子、磷酸钙系生物活性玻璃粒子、磷酸三钙生物陶瓷粒子或碳酸钙粒子中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜，其中交联剂包括：甲醛、戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜的制备方法，其特征在于制备单层引导组织再生膜含有如下步骤：

7.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜的制备方法，其特征在于制备双层引导组织再生膜含有如下步骤：

8.根据权利要求1所述的一种引导组织再生膜的制备方法，其特征在于制备双层引导组织再生膜含有如下步骤：

9.根据权利要求6,7,8任意一种引导组织再生膜的制备方法，其特征在于其中所述的有机溶剂为六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、N,N’-二甲基甲酰胺中的一种或几种混合溶剂。