CN108525020B - 含细胞的多结构生物膜制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含细胞的多结构生物膜制备方法。该方法可实现多种材料和多结构集成加工，直接利用静电纺丝、细胞电纺丝相复合的工艺制备生物膜。具体步骤为：(1)配制可降解高分子聚合物1，高温蒸汽消毒后冷却，在工位一采用静电纺丝工艺制备出生物膜外层致密结构体；(2)配制可降解高分子聚合物2，高温蒸汽消毒后冷却，在工位二采用静电纺丝工艺制备出生物膜中间层疏松结构体；(3)配制可降解高分子聚合物3，进行高温蒸汽消毒冷却，将细胞悬液加入聚合物3材料里面；在工位三采用细胞电纺丝工艺制备含有细胞的纤维定向排列的生物膜内层结构体。本发明整个制备方法简单易行，对组织缺损快速修复具有重大的现实意义。

Description

含细胞的多结构生物膜制备方法
技术领域
本发明涉及含细胞的多结构生物膜制备方法，属于生物活性膜的制备与组织缺损修复领域。
背景技术
静电纺丝技术制备的生物膜具有如下优点：无数根连续的长纤维交织在一起、单根纤维尺寸为纳米级别；其整体结构具有高空隙率、100％贯通性、高的比表面积、模拟了天然的细胞外基质结构；在生产方面它还提供了优势，易于加工、低成本、可连续加工、产业规模化；在医学领域已得到了广泛的应用。细胞电纺丝技术是将活细胞掺入到材料里面直接进行含细胞的生物膜制备，使细胞均匀地分布在生物膜结构内，有利于组织的均衡生长，缩短了组织的生长时间。
人体组织内的细胞都处于三维空间结构中，接受着周围的信号。该环境为细胞的生长提供了极为有利的条件，均衡的营养和物质能量的交换，使细胞不断增殖和分泌自身的外基质。但是，缺损组织在自身修复时，经常遭受周围组织细胞的入侵，影响了缺损区组织修复的质量并延长了组织修复时间。如何解决这一矛盾，就是在缺损区与周围组织间放置生物膜作为屏障，阻止来自周围组织的细胞向缺损区内生长，选择性引导再生潜能的细胞向缺损区迁移，使细胞能有足够的时间增值、重建组织。
针对静电纺丝技术制备的生物膜及细胞电纺丝技术的优点，本发明将静电纺丝与细胞电纺丝技术相结合制备含细胞的多结构生物膜，该膜即可以屏蔽周围组织细胞的入侵，又可以引导自身缺损组织细胞的生长，同时在生物膜成形时混合了细胞，可促进缺损区组织的修复进度。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题，提供含细胞的多结构生物膜制备方法，利用多工艺复合制备，着力于构建具有多功能性且含有细胞分布的生物膜，为医学上的快速修复提供更为先进的技术支持。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
含细胞的多结构生物膜制备方法，生物膜由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用静电纺丝和细胞电纺丝复合工艺制备，包括以下步骤：
1)称取1.0-1.5克聚乙内酯(PCL)材料，溶解于10-15mLN，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1∶1，V/V)配制成均匀溶液，再经100℃高温蒸汽消毒冷却后将其装入喷头A中备用；
2)称取1.5-2.0克聚乙烯醇(PVA)材料，在搅拌情况下缓缓加入到15-20克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液；
3)称取1.5-2.0克壳聚糖(CS)材料，在搅拌情况下缓缓加入到50-60克的10％的醋酸溶液中，配制成均匀的CS溶液，将配制好的PVA溶液与CS溶液以体积比2∶1混合搅拌均匀，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却后将其装入喷头B中备用；
4)称取1.5-2.0克PVA材料，在搅拌情况下缓缓加入到15-20克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却；
5)第4代人的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的PVA材料搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头C中备用；
6)在喷头A上加载15-18KV的直流电压，针头和无菌不锈钢接收板之间的距离为15-20cm，负极加载在不锈钢板上。将材料以150-180ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝0.5-1个小时，得到具有致密结构的生物膜外层。
7)工作台运动到喷头B，在喷头上加载10-13KV的直流电压，针头和无菌不锈钢接收板之间的距离为10-15cm，负极加载在不锈钢板上。将材料以150-180ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1-2个小时，得到具有疏松结构的生物膜中间层。
8)工作台运动到喷头C，在喷头上加载6-8KV的直流电压，针头和无菌不锈钢接收板之间的距离为8-15cm，在不锈钢板两边放置两铁块，负极加载在不锈钢板铁块上。将材料以150-180ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1-2个小时，得到含有细胞的纤维定向排列的第三层结构生物膜。
所述步骤5)的细胞为骨细胞或骨髓间充质细胞。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
本发明的生物膜，具有三层结构，每层结构由不同的可生物降解材料制备；外层的生物膜为致密结构；中间层的生物膜为疏松结构；内层的生物膜纤维呈定向分布结构，细胞均匀分布在内层生物膜上，加速了组织的修复。该方法具备工艺简单、可控性好及效率高等优点。
附图说明
图1为制备含细胞的多结构生物膜系统示意图。
具体实施方式
本发明的优选实施案例，结合附图详述如下：
如图1所示为制备含细胞的多结构生物膜系统示意图。其中：计算机控制系统1连接控制器2，控制器2连接微量泵3和高压电源4，微量泵3连接喷头A、B、C，高压电源4正极加载在喷头A、B、C上，在工位一、二的时候负极加载在接收板5上，在工位三的时候两铁块6放在接收板5的两边，负极加载在铁块6上。
实施例1
含细胞的多结构生物膜制备方法，生物膜由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用静电纺丝和细胞电纺丝复合工艺制备，包括以下步骤：
1)称取1.2克聚乙内酯材料(PCL)，溶解于12mLN，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1∶1，V/V)配制成均匀溶液，再经100℃高温蒸汽消毒冷却后将其装入喷头A中备用；
2)称取1.7克聚乙烯醇(PVA)材料，在搅拌情况下缓缓加入到17克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液；
3)称取1.5克壳聚糖(CS)材料，在搅拌情况下缓缓加入到50克的10％的醋酸溶液中，配制成均匀的CS溶液，将配制好的PVA溶液与CS溶液以体积比2∶1混合搅拌均匀，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却后将其装入喷头B中备用；
4)称取1.5克PVA材料，在搅拌情况下缓缓加入到15克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却；
5)第4代人的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的PVA材料搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头C中备用；
6)将计算机控制系统、控制器、高压电源、微量泵、接收板、喷头按如图1所示连接好。
7)开启高压电源，在喷头A上加载16KV的直流电压，喷头和无菌不锈钢接收板之间的距离为18cm，负极加载在接收上。将材料以170ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝0.7个小时，得到具有致密结构的生物膜外层。
8)工作台运动到喷头B，在喷头上加载12KV的直流电压，喷头和接收板之间的距离为13cm，负极加载在接收板上。将材料以160ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1.5个小时，得到具有疏松结构的生物膜中间层。
9)工作台运动到喷头C，在喷头上加载7KV的直流电压，喷头和接收板之间的距离为9cm，在接受板两边放置两铁块，负极加载在铁块上。将材料以150-180ul/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1.5个小时，得到含有细胞的纤维定向排列的第三层结构生物膜。
10)生物膜制备结束后，将其放进培养皿中加入培养液再放入培养箱中进行培养。
实施例2
本实例与实例一基本相同，不同之处在于：用电子天秤称取2克的聚氧化乙烯(PEO)颗粒在搅拌情况下缓缓加入到8克的去离子水中，至充分溶胀后升温到60℃左右加速溶解，并保温3小时，制得透明的20％PEO溶液后，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却后将其装入喷头C中备用；
实施例3
本实例与实例1基本相同，不同之处在于：步骤3)所采用的细胞为成纤维细胞。

Claims (2)

1.含细胞的多结构生物膜制备方法，生物膜由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用静电纺丝、细胞电纺丝复合工艺制备，包括以下步骤：
1)称取1.2克聚乙内酯材料(PCL)，溶解于12mL体积比为1∶1的N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷配制成均匀溶液，再经100℃高温蒸汽消毒冷却后将其装入喷头A中备用；
2)称取1.7克聚乙烯醇(PVA)材料，在搅拌情况下缓缓加入到17克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液；
3)称取1.5克壳聚糖(CS)材料，在搅拌情况下缓缓加入到50克的10％的醋酸溶液中，配制成均匀的CS溶液，将配制好的PVA溶液与CS溶液以体积比2∶1混合搅拌均匀，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却后将其装入喷头B中备用；
4)称取1.5克PVA材料，在搅拌情况下缓缓加入到15克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液，再经100℃高温蒸汽消毒、冷却；
5)第4代人的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的PVA材料搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头C中备用；
6)将计算机控制系统、控制器、高压电源、微量泵、接收板、喷头连接好；
7)开启高压电源，在喷头A上加载16KV的直流电压，喷头和无菌不锈钢接收板之间的距离为18cm，负极加载在接收板上，将材料以170μL/min稳定流量由微量泵提供，纺丝0.7个小时，得到具有致密结构的生物膜外层；
8)工作台运动到喷头B，在喷头上加载12KV的直流电压，喷头和接收板之间的距离为13cm，负极加载在接收板上，将材料以160μL/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1.5个小时，得到具有疏松结构的生物膜中间层；
9)工作台运动到喷头C，在喷头上加载7KV的直流电压，喷头和接收板之间的距离为9cm，在接受板两边放置两铁块，负极加载在铁块上，将材料以150-180μL/min稳定流量由微量泵提供，纺丝1.5个小时，得到含有细胞的纤维定向排列的第三层结构生物膜；
10)生物膜制备结束后，将其放进培养皿中加入培养液再放入培养箱中进行培养。
2.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于：所述步骤5)的细胞为骨细胞或骨髓间充质细胞。
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