CN108379664A - 一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法。本制备方法，包括：一、将可降解蛋白与柠檬酸溶液混合低温冷冻后进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体经高温交联得到多孔海绵支架；二、将生物可降解纤维与第一溶剂混合后，得到得到生物可降解纤维溶液，生物可降解纤维溶液与第二溶剂混合并在多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层；三、将表面附有纳米纤维层的多孔海绵支架通过交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架。本发明解决胶原凝胶支架的力学性能较差，且在组织培养过程中胶原凝胶支架容易酶解，和胶原凝胶支架构建全层皮肤模型的培养周期较长的技术缺陷。

Description

一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官组织，可阻挡外来物质侵入，保护水分以及温度调节与感知。人体皮肤主要由表皮和真皮双层组成，其中，表皮具有多层致密的细胞以起到屏障功能，真皮主要由成纤维细胞、胶原纤维和弹性纤维组成，具有一定的机械强度与弹性。
皮肤损伤处理细菌和病原体容易入侵，引起感染，严重可导致死亡。近30年来，对皮肤损伤修复开展了大量研究，特别是支架研究方面，并有多种产品上市，如Apligraft，Dermagraft等，利用组织工程皮肤对皮肤损伤进行修复，减少了自体皮肤移植的二次伤害和治疗材料受限的问题。
随着动物保护意识的增强，以动物为对象的体内测试逐渐被体外测试所替代。组织工程皮肤成为皮肤科学研究和化学品安全毒理与功效评价的有效手段，商业化的产品Episkin、Epiderm、skinEthic和Phenion等，经过欧洲替代方法研究中心验证的Episkin已用于替代传统的动物体内皮肤的刺激性、腐蚀性实验等。
理想的组织工程皮肤应该包含表皮层和真皮层，且两层形成一个整体。目前构建成功的全层皮肤多数采用胶原凝胶支架和多孔海绵支架。但是，胶原凝支架的胶力学性能较差，且在组织培养过程中胶原支架容易酶解。多孔海绵支架力学性能较好，高孔隙率，可长时间进行组织培养，提供了组织培养三维环境，但利用多孔海绵结构支架构建全层皮肤模型，培养周期较长，一般需真皮层细胞增殖一段时间后，再接种表皮细胞，方可让表皮细胞只粘附在多孔海绵支架表面增殖生长，进而分化，得到与人体皮肤组织结构与功能一致的全层皮肤模型。
因此，制备一种允许表皮层与真皮层的细胞短时间内接种，组织培养周期短，可较快构建细胞共培养体系、生物相容性好、成本低和力学性能较强的全层皮肤构建支架是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法能有效解决目前胶原凝胶支架的力学性能较差，且在组织培养过程中胶原凝胶支架容易酶解，以及多孔海绵结构支架构建全层皮肤模型的培养周期较长的技术缺陷。
本发明公开了一种用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，包括：
步骤一、将可降解蛋白与柠檬酸溶液混合低温冷冻后进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体经高温交联得到多孔海绵支架；
步骤二、将生物可降解纤维与第一溶剂混合后，得到得到生物可降解纤维溶液，所述生物可降解纤维溶液与第二溶剂混合并在所述多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层；
步骤三、将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架通过交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架。
作为优选，所述可降解蛋白为明胶、胶原、丝蛋白、弹性蛋白和纤维蛋白中的一种或多种。
更为优选，所述可降解蛋白为明胶。
更为优选，所述明胶的分子量在40000～50000之间。
更为优选，所述步骤一具体为称取明胶粉末与柠檬酸溶解于去离子水中，搅拌均匀后，置于模具中，放入-20℃冰箱，冷冻干燥后，置于烘箱进行热交联。
具体的，所述明胶的固含量为10-15％，所述柠檬酸的固含量为0.1-1％；在-20℃条件下进行冷冻干燥，在140℃烘箱交联2-4h。
作为优选，所述生物可降解纤维为明胶、胶原、丝蛋白、聚乳酸、聚氨基酸和聚己内酯中的一种或多种。
其中，所述步骤二的第一溶剂为乙酸乙酯、乙酸和水的混合溶液，所述步骤二具体为将生物可降解纤维与乙酸乙酯、乙酸和水的混合溶液混合后，得到生物可降解纤维溶液，所述生物可降解纤维溶液与第二溶剂混合并在所述多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层，优选的，水为去离子水。
具体的，步骤二具体为：称取明胶粉末与柠檬酸溶解于乙酸、乙酸乙酯和去离子水的混合溶液中，乙酸、乙酸乙酯和去离子水的体积配比为21:14:10的溶液中，其中，明胶粉末的固含量为10％，柠檬酸的固含量为1％，得到纳米纤维溶液，将纳米纤维溶液装入带针头的注射器中；将注射器安装到微量注射泵上，针头连接正极，镀金的多孔海绵支架平放于金属接收板上，金属接收板连接负极，金属接收板与针头设置垂直距离，调节注射泵流速，在高压电场下，进行静电纺丝；优选的，金属接收板与针头垂直距离为10cm，调节注射泵流速为0.2-1ml/h，高压电场为10-12kV，纺丝时间为5-10min。
更为优选，所述生物可降解纤维为明胶。
作为优选，所述步骤三的交联处理具体为高温热交联处理或/和化学交联处理。
作为优选，所述高温交联反应具体为在步骤三中将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架在高温条件下进行交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架，其中，所述第二溶剂为柠檬酸溶液。
优选的，步骤三为将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架在烘箱交联得到双层复合明胶支架。优选的，将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架在140℃烘箱交联2-4h得到用于构建全层皮肤的双层复合支架。
作为优选，所述化学交联反应具体为在步骤三中将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架进行交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架，其中，所述第二溶剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)乙醇溶液的混合溶液。
具体的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)为含0.2M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
具体的，所述化学交联反应具体为在步骤三中将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架进行交联反应2-4h后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架，其中，所述第二溶剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)乙醇溶液的混合溶液。
作为优选，步骤一还包括对多孔海绵支架的表面进行镀金处理。
作为优选，步骤一具体为：将具有可降解蛋白与柠檬酸溶液混合置于模具中进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体在高温交联得到多孔海绵支架，所述模具具体为聚二甲基硅氧烷的固化模具。
具体的，所述聚二甲基硅氧烷的固化模具为中间镂空的PDMS模具，优选为环形PDMS模具。
具体的，聚二甲基硅氧烷的固化模具的具体制备方法如下：将液态聚二甲基硅氧烷(PDMS)和固化剂以5：1的质量比例混合，搅拌混匀得到PDMS混合液，称取10g的PDMS混合液完全覆盖于底面积为125cm2的圆形皿中，真空抽去气泡后放入80℃烘箱固化聚二甲基硅氧烷(PDMS)，再用12cm直径的圆形打孔器打孔，再用8cm直径的圆形打孔器打孔，获得环状PDMS模具，最后用最后用等离子表面处理器进行表面改性处理备用。
需要说明的是，环状PDMS模具不是唯一的铸模方式，环状PDMS模具是为了提高制备过程中的可操作性，以及有利于对多孔海绵支架厚度进行定量，而且较为便宜。环状PDMS模具可换为无细胞毒性的所有固状材料，中间镂空的形状也无任何要求。
具体的，多孔海绵支架设置在环状PDMS模具上，在多孔海绵支架的表面镀金，得到镀金的多孔海绵支架。
所述纳米纤维通过静电纺丝和交联反应的方法附着于所述多孔海绵支架的表面，形成纳米纤维层，纳米纤维层较薄且孔径较小，表皮细胞粘附在其表面增殖生长、分化形成表皮层，多孔海绵支架作为真皮层细胞迁移和增殖的支架，两层之间紧密结合，形成用于构建全层皮肤的双层复合支架，多孔海绵层与纳米纤维层均采用可生物降解的材料制备。
具体的，明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具有同源性。胶原具有棒状三股螺旋结构，当其部分水解制备明胶的过程中，胶原的这种三螺旋结构发生部分分离和断裂。明胶的氨基酸组成与胶原相似，但因预处理的差异，组成成分也可能不同。不同规格的明胶分子量一般为15000～250000Da。明胶是一种天然的高分子材料，其结构与生物体组织结构相似，因此具有良好的生物相容性和生物可降解性。明胶作为一种天然的水溶性的生物可降解高分子材料，其优点就是降解产物易被吸收而不产生炎症反应。
本发明还提供了一种用于构建全层皮肤的双层复合支架，包括所述用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法制得的用于构建全层皮肤的双层复合支架。
本发明发现，现有的全层皮肤组织构建材料大多为多孔结构支架，因此，现有的多孔结构支架进行皮肤组织构建需要真皮层细胞增殖生长，分泌细胞外基质填充孔洞，形成一定的屏障后，才能再接种表皮细胞，使得多孔海绵结构支架构建全层皮肤模型的培养周期较长，如在传统的多孔结构支架同时接种真皮层细胞和表皮细胞，这会容易造成表皮细胞与真皮细胞混合与多孔结构上，且表皮细胞容易团状增殖生长，与体内表皮细胞增殖生长、分化情况不一致。
本发明的目的针对现有技术多孔结构支架的力学性能较差，且在组织培养过程中多孔结构支架容易被酶解，以及多孔结构支架构建全层皮肤模型的培养周期较长的技术缺陷。
因此，本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，包括：步骤一、将具有可降解蛋白与柠檬酸溶液混合低温冷冻后进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体经高温交联得到多孔海绵支架；步骤二、将生物可降解纤维在所述多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层；步骤三、将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架通过交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架。其中，柠檬酸溶液的溶剂为水。将可降解蛋白与柠檬酸溶液混合后进行真空冷冻干燥，使得可降解蛋白与柠檬酸溶液的混合溶液因真空干燥的缘故而发生冰晶，使原本所占有的空间变成孔洞，从图1和图2可知，多孔海绵支架为多孔结构，该结构有利于营养物质的交换和细胞间通讯，为细胞增殖生长提供了三维生长环境，提供了一个与体内真皮层细胞生长空间环境相近的结构空间，且多孔海绵支架经过多孔海绵前体在高温条件下交联反应得到，可以延长多孔海绵支架的酶解时间，有利于长时间的组织细胞培养，进行如自然衰老等需长时间进行组织培养的研究，同时，可降解蛋白还具有良好生物相容性。纳米纤维通过静电纺丝和高温交联的方法附着于多孔海绵支架的表面，采用静电纺丝技术在强电场中进行喷射纺丝制得纳米级别的纳米纤维层，从图3可知，交联得到的纳米纤维层的孔径小，表皮细胞极易粘附在上面，可形成一定的屏障，避免真皮细胞与表皮细胞的混合增殖生长，而且纳米纤维层与体内细胞外基质的微观结构相近，其生物相容性好，有一定的机械力学性能，在人造皮肤模型构建中，可以快速地使得表皮细胞贴附在纳米纤维层增殖生长，因此，纳米纤维层能防止表皮细胞与真皮细胞混合增殖于多孔海绵支架中，避免表皮细胞易成团生长，与体内表皮细胞生长情况不相一致的技术缺陷。在使用本发明的双层复合支架时，纳米纤维层接种表皮细胞，多孔海绵支架一侧接种真皮层细胞，因此可以同时接种两种细胞进行全层皮肤的组织构建，大大节省全层皮肤模型的培养周期。而现有的多孔海绵结构支架需要真皮层细胞增殖生长，分泌细胞外基质填充孔洞，形成一定的屏障后，才能再接种表皮细胞，本发明的双层复合支架无需等待真皮层细胞增殖生长，形成一定的屏障后，再接种表皮细胞这一过程。
综上所述，本发明的用于构建全层皮肤的双层复合支架能让表皮层与真皮层细胞短时间内接种，组织培养周期短，可较快构建细胞共培养体系，为生物相容性好、成本低和力学性能较强的全层皮肤构建支架，本发明用于制备与人体皮肤组织结构和功能相近的全层皮肤，应用于人体皮肤修复、化学品安全毒理功效检测和皮肤疾病模型研究等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的截面结构图；
图2为本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的多孔海绵支架的结构表面图；
图3为本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的纳米纤维的结构表面图；
图4为人角质细胞同时接种于本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的多孔海绵支架(S1)和本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架的纳米纤维层(S2)一天和三天后的扫面电镜图像；
图5为角质细胞接种于现有技术的多孔支架(S1)与本发明提供的用于构建全层皮肤的双层复合支架(S2)1天与3天后的细胞空间分布图像，蓝色为细胞核，绿色为细胞骨架，标尺为200um。
具体实施方式
本发明提供了一种用于构建全层皮肤的双层复合支架及其制备方法，用于解决现有的胶原凝胶支架的力学性能较差，且在组织培养过程中胶原凝胶支架容易酶解，以及多孔海绵结构支架构建全层皮肤模型的培养周期较长的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本具体实施例公开了一种用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，包括：
步骤一、将可降解蛋白与柠檬酸溶液混合低温冷冻后进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体经高温交联得到多孔海绵支架；
步骤二、将生物可降解纤维在多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层；
步骤三、将表面附有纳米纤维层的多孔海绵支架通过交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架。
其中，可降解蛋白包括明胶、胶原、丝蛋白、弹性蛋白和纤维蛋白中的一种或多种。
其中，生物可降解纤维包括明胶、胶原、丝蛋白、聚乳酸、聚氨基酸和聚己内酯中的一种或多种，优选的，生物可降解纤维包括明胶。
其中，步骤三的交联处理具体为高温热交联处理或/和化学交联处理。
其中，化学交联处理具体为利用交联剂的交联处理，所述交联剂为柠檬酸溶液。
其中，化学交联处理具体为利用交联剂的交联处理，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)乙醇溶液的混合溶液。
其中，步骤一还包括对多孔海绵支架的表面进行镀金处理。
其中，步骤一具体为：将具有可降解蛋白与柠檬酸溶液混合置于模具中进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体在高温交联得到多孔海绵支架，模具具体为聚二甲基硅氧烷的固化模具。
其中，以下实施例的原料为市售或自制。
实施例1
本发明实施例的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法具体如下：
(1)将液态聚二甲基硅氧烷(PDMS)和固化剂以5：1的质量比例混合，搅拌混匀，称取10g完全覆盖于底面积为125cm2的圆形皿中，真空抽去气泡后放入80℃烘箱固化聚二甲基硅氧烷(PDMS)，再用12cm直径的圆形打孔器打孔，再用8cm直径的圆形打孔器打孔，获得环状PDMS，最后用等离子体表面处理器进行表面改性备用，形成模具。
(2)称取一定质量的明胶与柠檬酸溶解于去离子水，其中，明胶的固含量为1％，柠檬酸的固含量为0.1％，在室温下用磁力搅拌器搅拌均匀，得到明胶溶液，将明胶溶液加入的PDMS环中。
(3)在-20℃条件下，将明胶溶液冷冻24h后进行冷冻干燥24h，形成多孔海绵前体，接着多孔海绵前体放入140℃烘箱中进行4h的交联，制得多孔海绵支架。
(4)将多孔海绵支架的表面进行镀金，得到镀金过的多孔海绵支架。
(5)称取明胶与柠檬酸溶解于体积配比为14:21:10的乙酸乙酯、乙酸和去离子水中，最终明胶的固含量为10％，柠檬酸的固含量为1％，室温在磁力搅拌器上搅拌均匀，得到纳米纤维，将纳米纤维装入带针头的注射器中。
(6)镀金过的多孔海绵支架放置于金属接收板上，金属接收板与注射器针头垂直距离为10cm，注射器通过微量注射泵控制液体流速，针头连接正极，金属接收板连接负极，控制微量注射泵流速为0.2ml/h，在10kV的高压电压下纺丝10min。
(7)将纺丝完成的支架放入140℃烘箱交联4h得到用于构建全层皮肤的双层复合支架，纳米纤维通过静电纺丝和高温交联的方法附着于镀金过的多孔海绵支架的表面。
图1至3为实施例1的用于构建全层皮肤的双层复合支架的扫描电镜图。从扫描电镜图可知，多孔海绵支架的厚度为400-600μm，其孔径为100±20μm，具有高孔隙率，多孔结构均匀的三维支架，纳米纤维通过静电纺丝和高温交联的方法附着于多孔海绵支架的表面，纳米纤维层的厚度为10-15μm，其孔径最大不超过5μm，纳米纤维直径为500-1200nm。用于构建全层皮肤的双层复合支架的总厚度为415μm～615μm，其孔隙率不低于90.0％。
实施例2
本实施例为利用实施例1制备得到的用于构建全层皮肤的双层复合支架、现有技术的明胶多孔支架和人角质细胞进行全层皮肤的构建，图4和图5为实验结果，图4为人角质细胞同时接种于用于构建全层皮肤的双层复合支架的多孔海绵支架(S1)和用于构建全层皮肤的双层复合支架的纳米纤维层(S2)一天和三天后的扫面电镜图像，从图上可知，图4(a)(b)中，团状物为角质细胞于S1多孔海绵支架上粘附增殖的形态；(c)(d)中黑色片状部分为角质细胞于S2纳米纤维层上的形态，其中凸起单个球状结构为细胞核。接种人角质细胞于S2相比于S1，S2纳米纤维层表面的细胞粘附得更好且纳米纤维为细胞提供了很好的力学支撑，细胞与纳米纤维紧密粘附，角质细胞得以呈片状增殖，进而有利于在气液条件下进行分化，形成角质层；图5为角质细胞接种于现有技术的明胶多孔支架(S1)与用于构建全层皮肤的双层复合支架(S2)的1天与3天后的细胞空间分布图像，蓝色为细胞核染色，绿色为细胞中鬼笔环肽的荧光标记，可表征细胞骨架结构，标尺为200um，从实验结果可看出，角质细胞接种于S1、S2的细胞形貌与图4的结果一致，在S1中细胞呈团状增殖生长于0-125um三维深度，而S2支架上角质主要在表面成片状增殖生长，且相对于S1的现有技术的明胶多孔支架，本发明的双层复合支架S2上的细胞粘附得更好。
以上实验说明，人角质细胞接种于用于构建全层皮肤的双层复合支架的多孔海绵支架(S1)和用于构建全层皮肤的双层复合支架的纳米纤维(S2)的一天和三天后的扫面电镜图像，可以清晰的看出人角质细胞粘附在纳米纤维层的效果更佳，人角质细胞粘附得更好更快，其细胞较容易伸展开，形态与体内更相近，且细胞增殖也较快，十分有利于表皮层的快速构建；实施例1的用于构建全层皮肤的双层复合支架构建全层皮肤的周期比现有技术更短，构建效率更快。
综上所述，本发明双层复合支架的生物相容性好、成本低、力学性能较强，允许表皮层与真皮层细胞短时间内完成接种，可缩短组织培养周期，较快构建细胞共培养体系，建立真表皮层细胞间通讯，快速构建全层皮肤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、将可降解蛋白与柠檬酸溶液混合低温冷冻后进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体经高温交联得到多孔海绵支架；
步骤二、将生物可降解纤维与第一溶剂混合后，得到得到生物可降解纤维溶液，所述生物可降解纤维溶液与第二溶剂混合并在所述多孔海绵支架的表面进行静电纺丝，得到纳米纤维层；
步骤三、将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架通过交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架。
2.根据权利要求1所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述可降解蛋白为明胶、胶原、丝蛋白、弹性蛋白和纤维蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述生物可降解纤维为明胶、胶原、丝蛋白、聚乳酸、聚氨基酸和聚己内酯中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述生物可降解纤维为明胶。
5.根据权利要求1所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述步骤三的交联反应具体为高温热交联反应或/和化学交联反应。
6.根据权利要求5所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述高温交联反应具体为在步骤三中将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架在高温条件下进行交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架，其中，所述第二溶剂为柠檬酸溶液。
7.根据权利要求5所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，所述化学交联反应具体为在步骤三中将表面附有所述纳米纤维层的多孔海绵支架进行交联反应后，制得用于构建全层皮肤的双层复合支架，其中，所述第二溶剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺乙醇溶液的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，步骤一还包括对多孔海绵支架的表面进行镀金处理。
9.根据权利要求1所述的用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法，其特征在于，步骤一具体为：将具有可降解蛋白与柠檬酸溶液混合置于模具中进行真空冷冻干燥得到多孔海绵前体，将多孔海绵前体在高温交联得到多孔海绵支架，所述模具具体为聚二甲基硅氧烷的固化模具。
10.一种用于构建全层皮肤的双层复合支架，其特征在于，包括如权利要求1至9任意一项所述用于构建全层皮肤的双层复合支架的制备方法制得的用于构建全层皮肤的双层复合支架。
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