CN104004221A - 一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，包括：将聚己内酯溶于溶剂中，搅拌溶解，得到聚己内酯溶液；将角蛋白溶于溶剂中，搅拌溶解，得到角蛋白溶液；将聚己内酯溶液与角蛋白溶液按质量比95：5-5：95混合，搅拌混匀，得到聚己内酯/角蛋白溶液，然后浇铸到模具中，冷冻，得到冷冻固体物；将上述冷冻固体物进行冷冻干燥，即得。本发明采用冷冻干燥技术制备聚己内酯/角蛋白复合多孔支架材料。该多孔支架材料具有孔隙率高且孔连通、生物相容性好、可降解性等优点，可用于皮肤、骨等组织工程支架、细胞培养和药物输送等领域。

Description

一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法
技术领域
本发明属于复合多孔支架的制备领域，特别涉及一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法。
背景技术
角蛋白是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物皮肤及皮肤附属物中，如毛发、蹄、壳、爪、角、鳞片等。近几年的大量研究表明，角蛋白是一种生物相容性好且不被机体免疫排斥的优质生物医用材料，具有广阔的应用前景。目前，国内外已开展大量关于角蛋白生物材料的基础研究及动物实验研究，在创伤敷料[Wound Repair and Regeneration,2012,20:236-242]、人造骨[Journal of Bioactive andCompatible Polymers,2013,28:141-153]以及神经修复[Biomaterials34(2013)5907-5914]等方面都取得了良好效果，并有部分产品应用于临床。
但现有研究证明，由于角蛋白的分子量较低，单一的角蛋白材料制成的膜材料通常较脆，且力学强度不高，使其应用性受到限制。因此，目前，大多数的角蛋白基生物材料往往采用角蛋白与天然高分子或人工高分子复合，这样既可以保持以改善单一角蛋白力学性能较差的不足，如丝素蛋白[Biomacromolecules,2008,9,1299–1305]、PVA[Advances inMaterials Science and Engineering,2014,Article ID163678]、PLGA[Journal of Bioactive andCompatible Polymers,2013,28:141-153]、PLLA[Biomed.Mater.2013,8:1-9]等。聚己内酯(PCL)是一种商业化的；医用高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性，已通过美国药监局的批准，被广泛应用于药物载体、软组织修复、组织工程材料等生物医用领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，本发明通过冷冻干燥的方法，将天然生物大分子材料角蛋白与聚己内酯复合制备成多孔支架，使得该多孔支架在具备高孔隙率的同时，显示出良好的力学及生物学性能。
本发明的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，包括：
(1)将聚己内酯溶于溶剂中，搅拌溶解，得到聚己内酯溶液；
(2)将角蛋白溶于溶剂中，搅拌溶解，得到角蛋白溶液；
(3)将聚己内酯溶液与角蛋白溶液按质量比95：5-5：95混合，搅拌混匀，得到聚己内酯/角蛋白溶液，然后浇铸到模具中，冷冻，得到冷冻固体物；
(4)将上述冷冻固体物进行冷冻干燥，即得聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
所述步骤(1)中溶剂为乙酸或乙酸/甲酸混合液；其中乙酸的质量体积百分浓度大于或等于80％，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的体积比为1:9-9：1。
所述步骤(1)中聚己内酯的平均分子量范围为70,000-90,000；聚己内酯溶液的浓度为50-100mg/ml。
所述步骤(2)中溶剂为甲酸或乙酸/甲酸混合液；甲酸的质量体积百分浓度大于或等于80％，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的体积比为1:9-9：1。
所述步骤(2)中角蛋白的分子量为3-300kDa；角蛋白溶液浓度为10-20mg/ml。
所述步骤(2)中角蛋白为还原法、氧化法或水解法等提取制备的角蛋白。
所述步骤(2)中角蛋白动物毛发或动物体提取制得。
所述的角蛋白可以从人发、羊毛、家禽羽毛、牛毛等人或动物毛发提取而得，也可以是来源于其他已报道的动物体。
所述步骤(3)中冷冻为-10～-80℃下冷冻处理1-48小时，或者通过液氮速冻。
所述步骤(4)中冷冻干燥用冷冻干燥机，-20～-60℃条件下冷冻干燥24-36小时。
所述步骤(4)所得的聚己内酯-角蛋白复合多孔支架用于皮肤、骨组织工程支架、细胞培养、药物输送。
有益效果
本发明开发了一种基于聚己内酯和角蛋白两种材料的复合材料，同时，为了获得较高孔隙率，本发明采用冷冻干燥技术制备聚己内酯/角蛋白复合多孔支架材料，该多孔支架材料具有孔隙率高且孔连通、生物相容性好、可降解性等优点，可用于皮肤、骨等组织工程支架、细胞培养和药物输送等领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
以羊毛为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。将上述羊毛加入100ml、1mol/l的巯基乙醇中，用NaOH调节pH约10.0，然后在40℃条件反应12h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量40，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
聚己内酯/角蛋白复合多孔支架的制备：将质量为0.8g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml、体积比为30/70的乙酸/甲酸混合液中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为80mg/ml的聚己内酯溶液。将0.2g角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比60：40的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径10厘米的塑料圆形塑料培养皿中，加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机中于-60℃条件下进行真空冷冻干燥24h，得到膜状聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例2
以人发为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g人发，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除人发表面油脂，然后用乙醇清洗人发，风干。将上述人发加入200ml水与5g焦亚硫酸钠混合的溶液中，用NaOH调节pH约10.0，然后在60℃条件反应5h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的人发固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
聚己内酯/角蛋白复合多孔支架的制备：将质量为1.0g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml乙酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为100mg/ml的聚己内酯溶液。将0.15g角蛋白固体溶于纯甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为15mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比50：50的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径1厘米的平底圆柱形塑料器皿中，于-80℃条件下进行冷冻处理2小时，然后置入冷冻干燥机中于-40℃条件下进行真空冷冻干燥24h，得到直径约1厘米的圆柱形的聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例3
以羊毛为原料采用氧化法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。向上述羊毛中加入100ml去离子水和5ml、30％的双氧水，然后在100℃条件反应2h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
聚己内酯/角蛋白复合多孔支架的制备：将质量为1.0g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml、体积比为10/90的乙酸/甲酸混合液中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为100mg/ml的聚己内酯溶液。将0.15g角蛋白固体溶于10ml、体积比为10/90的乙酸/甲酸混合液中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为15mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比95：5的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径10厘米的圆形塑料培养皿中，于-10℃条件下进行冷冻处理48小时，然后置入冷冻干燥机中于-20℃条件下进行真空冷冻干燥36h，得到膜状聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例4
以羊毛为原料采用氧化法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。向上述羊毛中加入100ml、4％的过氧乙酸，然后在60℃条件反应5h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
聚己内酯/角蛋白复合多孔支架的制备：将质量为0.8g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml、体积比为90/10的乙酸/甲酸混合液中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为80mg/ml的聚己内酯溶液。将0.2g角蛋白固体溶于10ml、体积比为90/10的乙酸/甲酸混合液中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比5：95的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径5厘米的圆形塑料培养皿中，加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机中于-60℃条件下进行真空冷冻干燥24h，得到膜状聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例5
将质量为0.8g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml乙酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为80mg/ml的聚己内酯溶液。将0.15g角蛋白固体溶于10ml乙酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为15mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比95：5的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径2厘米的平底圆柱形塑料器皿中，于-80℃条件下进行冷冻处理2小时，然后置入冷冻干燥机中于-60℃条件下进行真空冷冻干燥24h，得到圆柱形聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例6
将质量为1.0g，分子量范围为70,000-90,000的聚己内酯溶于10ml、体积比为30/70的乙酸/甲酸混合液，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量100mg/ml的聚己内酯溶液。将0.2g角蛋白固体溶于10ml乙酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的角蛋白溶液。将上述聚己内酯与角蛋白溶液按照质量比90：10的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得聚己内酯/角蛋白溶液注入到直径5厘米的圆形塑料培养皿中，于-80℃条件下进行冷冻处理2小时，然后置入冷冻干燥机中于-60℃条件下进行真空冷冻干燥24h，得到膜状聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
实施例7
按照实施例1中所述的制备方法制备聚己内酯-角蛋白复合多孔支架材料，经扫描电镜分析观察，复合多孔支架材料的孔径达100μm以上。以大鼠成纤维细胞L929及血管内皮细胞为细胞模型，采用扫描电子显微镜观察细胞在材料上的黏附形态，并通过MTT法对细胞的增殖行为进行评价，结果表明，成纤维细胞及内皮细胞在聚己内酯-角蛋白复合多孔支架材料上均表现出良好的黏附形态和增殖行为，与单一的聚己内酯制备的多孔支架相比具有显著性差异。

Claims (10)

1.一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，包括：
(1)将聚己内酯溶于溶剂中，搅拌溶解，得到聚己内酯溶液；
(2)将角蛋白溶于溶剂中，搅拌溶解，得到角蛋白溶液；
(3)将聚己内酯溶液与角蛋白溶液按质量比95：5-5：95混合，搅拌混匀，得到聚己内酯/角蛋白溶液，然后浇铸到模具中，冷冻，得到冷冻固体物；
(4)将上述冷冻固体物进行冷冻干燥，即得聚己内酯-角蛋白复合多孔支架。
2.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶剂为乙酸或乙酸/甲酸混合液；其中乙酸的质量体积百分浓度大于或等于80％，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的体积比为1:9-9：1。
3.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中聚己内酯的平均分子量范围为70,000-90,000；聚己内酯溶液的浓度为50-100mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中溶剂为甲酸或乙酸/甲酸混合液；甲酸的质量体积百分浓度大于或等于80％，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的体积比为1:9-9：1。
5.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白的分子量为3-300kDa；角蛋白溶液浓度为10-20mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白为还原法、氧化法或水解法提取制备的角蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白为动物毛发或动物体提取制得。
8.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中冷冻为-10～-80℃下冷冻处理1-48小时，或者通过液氮速冻。
9.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中冷冻干燥用冷冻干燥机，-20～-60℃条件下冷冻干燥24-36小时。
10.根据权利要求1所述的一种聚己内酯-角蛋白复合多孔支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)所得的聚己内酯-角蛋白复合多孔支架用于皮肤、骨组织工程支架、细胞培养、药物输送。
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