CN102133432B - 一种丝素蛋白微孔支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用丝素蛋白溶解在有机剂溶中形成的溶液，并向该溶液中添加不同浓度的再生丝素蛋白水溶液制备含微孔的丝素蛋白微孔支架，以及以此丝素蛋白微孔支架制备动物血管等医学仿生再生支架的方法。包括以下步骤：将丝素蛋白有机溶液和丝素蛋白水溶液或者水按一定比例均匀搅拌混合，所述的混合溶液注入容器或者模具内，密封静置6至72小时，纯化步骤所述的丝素蛋白凝胶体，冷冻干燥凝胶体得丝素蛋白微孔支架。
Description
技术领域
本发明涉及生物高分子化学和材料领域，特别涉及一种以丝素蛋白为仿生支架材料的丝素蛋白多孔支架材料的制备方法。
背景技术
我国是蚕丝生产大国，每年有数千吨的下脚茧，还有制丝和丝织过程中所产生的废丝，原材料十分充足，应用丝素蛋白材料的附加值高。
蚕丝丝心蛋白(fibroin)即丝素，被用作生物材料已经有很长历史，它已经从传统的服饰领域转向了非服饰领域的生物材料的应用研究。从最早的直接利用天然丝素作为手术线到现代的经降解处理降低蛋白分子量制备丝素蛋白膜、人造皮肤，药物缓释等，以丝素蛋白为材料的科学应用研究正成为生物材料领域的新热点。特别是在生物医学领域，利用丝素蛋白独特的生物相容性和机械性能，以丝素蛋白再生材料为基础的医学支架材料经细胞和组织培养后获得人造组织器官，如人造血管、眼角膜和再生骨等有着巨大的医学临床应用前景。
利用微米级的氯化钠盐和砂糖粒不溶于有机溶剂的方法，经包埋和溶解制备多孔性骨生长支架材料。多孔性丝素支架材料促进了细胞生长，同时自身的降解速度加快。但另一方面，这些材料却又不容易应用到再生生体材料的培育分化上。比如人工血管等，因为这些组织的生长需要一定的组织渗透压，机械强度和数微米的孔径。所以多孔材料的制备需要通过化学方法而不是物理方法获得。综上所述，高分子蛋白质有机溶液在小分子凝胶因子的诱导下能够形成并具有相互交联立体交叉的空间网络结构等凝胶体的性质特征，但是由于丝素蛋白在有机溶剂中所呈现了完全不同于水溶液状态下的分子构象，所以使丝素有机凝胶的弹性强度有较大提高的可能。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种制备具有较强力学性能且有机溶剂的纳米微孔丝素蛋白支架材料的方法。
本发明提供了一种制备具有较强力学性能且有机溶剂的纳米微孔丝素蛋白支架材料的方法按，包括一下步骤：
(1)将丝素蛋白有机溶液和丝素蛋白水溶液或者水按一定比例均匀搅拌混合；
(2)步骤1)所述的混合溶液注入容器或者模具内；
(3)密封静置6至72小时；
(4)纯化步骤3)所述的丝素蛋白凝胶体；
(5)冷冻干燥凝胶体得丝素蛋白微孔支架。
其中步骤(1)丝素蛋白有机溶液的浓度8％至30％(g/ml)，丝素蛋白有机溶液与丝素蛋白水溶液的体积比或者是丝素蛋白有机溶液与水的体积比为：1∶0.4至1∶3，两种溶液混合时搅拌子速度在80至200转/分。
其中步骤(2)混合溶液注入的模具和容器能够使混合溶液形成膜或者管状支架被密封。
其中步骤(3)装有混合溶液的模具或者容器在不同温度的条件下静置。
其中步骤(4)丝素蛋白胶体在100℃蒸馏水中1小时以上。
其中步骤(5)丝素蛋白凝胶体在零下20℃快速冷冻干燥。
本发明的有益效果是：利用本发明所述的方法制备的丝素蛋白是具有高分子材料的特性，同时具有疏水和亲水性基团，因此使其具备了凝胶体的结构特点。1)由于有机溶剂的作用使得丝素蛋白分子的高级结构构象发生转变从而提高了丝素蛋白有机凝胶体的机械强度，单位面积抗断拉力50～200Mpa。2)本发明所得材料，微孔直径在0.5～3μm之间，因为孔径微小，使得丝素蛋白的比表面积增大，从而有利于蛋白酶对该丝素蛋白的降解作用，提高了丝素蛋白材料的生物降解性。3)此丝素蛋白体可以作为人工皮肤，人工血管等生物医学支架材料应用于动物机体组织再生。
附图说明
图1以8％六氟异丙醇有机溶液制备丝素蛋白所得丝素蛋白固态蛋白膜电镜显微镜图。
图2以30％六氟丙酮有机溶液制备丝素蛋白所得丝素蛋白固态蛋白膜电镜显微镜图。
图3以16％六氟丙酮有机溶液制备丝素蛋白所得丝素蛋白固态蛋白膜电镜显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。
一种丝素蛋白微孔支架制备方法，包括以下步骤：
(1)将脱胶丝素蛋白溶解在有机溶液中，制备成混合溶液；
(2)将步骤(1)所述浓度的丝素蛋白有机溶液与含有丝素蛋白的水溶液混合或者丝素蛋白有机溶液与纯水混合，并均匀搅拌；
(3)将步骤(2)混合溶液注入容器或者模具内并静置6至72小时形成丝素蛋白凝胶体；
(4)去除步骤(3)中丝素蛋白凝胶体中的有机溶剂；
(5)将步骤(6)中的丝素蛋白凝胶体冷冻干燥得到丝素蛋白微孔支架。
步骤1中所述的有机溶剂选自六氟异丙醇、六氟丙酮或它们的混合物。步骤1中制成的脱胶丝素蛋白有机溶液的浓度为8％至30％(g/ml)。
步骤(2)中丝素蛋白有机溶液与0.1％至20％含有丝素蛋白的水溶液混合，配置成1∶0.4至1∶3混合溶液，并均匀搅拌。或者丝素蛋白有机溶液与纯水混合，配置成1∶0.4至1∶3混合溶液，并均匀搅拌。优选的混合溶液浓度为2∶1。
步骤(2)中所述的搅拌速度为80至200转/分。
步骤(3)中所述的静置温度为15℃至50℃。
步骤(4)中去除丝素蛋白胶体中的有机溶剂的方法包括在60℃至100℃蒸馏水中1小时以上。
步骤(5)中冷冻干燥的温度为零下20℃。
实施例1：以六氟异丙醇有机溶液制备丝素蛋白微孔支架的方法
(1)将脱胶丝素蛋白溶解在六氟异丙醇有机溶液中，制备成浓度为8％的溶液；
(2)将步骤(1)所述浓度的丝素蛋白有机溶液与质量体积比为0.1％丝素蛋白水溶液或者丝素蛋白有机溶液与纯水配置成1∶0.4混合溶液，并均匀搅拌；
(3)将步骤(2)混合溶液注入容器或者模具内并静置6至72小时形成丝素蛋白凝胶体；
(4)去除步骤(3)中丝素蛋白凝胶体中的有机溶剂；
(5)将步骤(4)中的丝素蛋白凝胶体冷冻干燥得到丝素蛋白微孔支架。
利用扫描电子显微镜(型号为SEM，KEYENCE VE-7800，日本)对实施例1所得的丝素蛋白微孔支架进行扫描，扫描结果如图1所示的电镜扫描图，测得该私服蛋白微孔直径为0.5至3微米。利用拉压力测试仪(EZ-Graph SHIMADZU Co.Ltd.日本)对所述丝素蛋白微孔支架进行抗断拉力测定，测得抗断拉力为50～200Mpa。实施例2：以六氟丙酮有机溶液制备丝素蛋白的方法
(1)将脱胶丝素蛋白溶解在六氟丙酮有机溶液中，制备成浓度为30％(g/ml)的溶液；
(2)将步骤(1)所述浓度的丝素蛋白有机溶液与质量体积比为20％丝素蛋白水溶液或者丝素蛋白有机溶液与纯水配置成1∶3混合溶液，并均匀搅拌；
(3)将步骤(2)混合溶液注入容器或者模具内并静置6至72小时形成丝素蛋白凝胶体；
(4)去除步骤(3)中丝素蛋白凝胶体中的有机溶剂；
(5)将步骤(4)中的丝素蛋白凝胶体冷冻干燥得到丝素蛋白微孔支架。
利用扫描电子显微镜(型号为SEM，KEYENCE VE-7800，日本)对实施例2所得的丝素蛋白微孔支架进行扫描，扫描结果如图1所示的电镜扫描图，测得该私服蛋白微孔直径为0.5至3微米。利用拉压力测试仪(EZ-Graph SHIMADZU Co.Ltd.日本)对所述丝素蛋白微孔支架进行抗断拉力测定，测得抗断拉力为50～200Mpa。
实施例3：以六氟丙酮有机溶液制备丝素蛋白的方法
(1)将脱胶丝素蛋白溶解在六氟丙酮有机溶液中，制备成浓度为16％(g/ml)的溶液；
(2)将步骤(1)所述浓度的丝素蛋白有机溶液与质量体积比为10％丝素蛋白水溶液或者丝素蛋白有机溶液与纯水配置成2∶1混合溶液，并均匀搅拌；
(3)将步骤(2)混合溶液注入同心圆柱模具内并静置6至72小时形成丝素蛋白凝胶体；
(4)去除步骤(3)中丝素蛋白凝胶体中的有机溶剂；
(5)将步骤(4)中的丝素蛋白凝胶体冷冻干燥得到丝素蛋白微孔支架。
利用扫描电子显微镜(型号为SEM，KEYENCE VE-7800，日本)对实施例3所得的丝素蛋白微孔支架进行扫描，测得该丝素蛋白微孔支架的直径为2.3毫米利用拉压力测试仪(EZ-Graph SHIMADZU Co.Ltd.日本)对所述丝素蛋白微孔支架进行抗断拉力测定，测得抗断拉力为50～200Mpa。
Claims (8)
1.一种丝素蛋白微孔支架制备方法，包括以下步骤：
(1)将脱胶丝素蛋白溶解在有机溶剂中，制备成浓度为8％至30％(g/ml)的溶液；
(2)将步骤(1)所述浓度的丝素蛋白有机溶液与质量体积比为0.1％至20％丝素蛋白水溶液或者丝素蛋白有机溶液与纯水配置成1∶0.4至1∶3混合溶液，并均匀搅拌；
(3)将步骤(2)混合溶液注入容器或者模具内并静置6至72小时形成丝素蛋白凝胶体；
(4)去除步骤(3)中丝素蛋白凝胶体中的有机溶剂；
(5)将步骤(4)中的丝素蛋白凝胶体冷冻干燥得到丝素蛋白微孔支架。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(1)丝素蛋白有机溶剂为六氟异丙醇、六氟丙酮之一或两者的混合物。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(2)丝素蛋白有机溶液与丝素蛋白水溶液的体积比或者是丝素蛋白有机溶液与水的体积比为2∶1。
4.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(2)两种溶液混合时搅拌子速度在80-200转/分。
5.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(3)混合溶液注入的模具或容器能够使混合溶液形成膜或者管状支架被密封。
6.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(3)装有混合溶液的模具或者容器在15℃至50℃的条件下静置。
7.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(4)丝素蛋白凝胶体在60℃至100℃蒸馏水中1小时以上。
8.根据权利要求1所述的丝素蛋白微孔支架制备方法，其特征在于：其中步骤(5)丝素蛋白凝胶体在零下20℃快速冷冻干燥。
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