CN101905035A

CN101905035A - 一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法

Info

Publication number: CN101905035A
Application number: CN2010102334259A
Authority: CN
Inventors: 张冰; 吕强; 李明忠; 卢神州; 王建南
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-07-22
Also published as: CN101905035B

Abstract

本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，公开了一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，将丝素蛋白水溶液开口缓慢浓缩之后，与醇混合均匀后进行冷冻干燥，直接获得不溶于水的丝素蛋白多孔支架材料，再选择性地使用后处理手段调控多孔支架的二级结构和力学性能，并可通过改变丝蛋白浓度、冷冻温度等参数控制多孔材料的孔隙率和孔径尺寸等。最后将丝素蛋白多孔支架材料浸泡在水中除去醇，本发明所述制备过程条件温和，无需加入任何交联剂、制孔剂、和其它毒性有机溶剂，简便可控，易于产业化，并能有效保持丝素蛋白的生物相容性，可应用于骨、软骨、韧带、神经、皮肤等组织修复以及药物缓释的载体等。

Description

一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备多孔三维材料的技术，所制备的材料可应用于生物医学、生物技术、组织工程等技术领域。

背景技术

生物医用材料特别是组织工程支架材料、组织修复再生材料等，要求所使用的材料不仅具有良好的生物相容性，同时必须具备合适的三维多孔结构、可控的生物降解性、一定的力学强度、以及可以释放因子或者其它相关药物的性能。

对于制备生物医用材料的方法，尤其是制备生物材料多孔支架的方法，要求：制备过程应当尽可能温和，并尽量避免毒性有机溶剂的使用，这样保护其生物相容性和可能加载药物的活性；同时，也要求有温和有效的方法来调控生物材料的结构，从而有效控制材料的降解行为以适应不同组织的正常再生。

中国是蚕丝的发源地和主要生产国。蚕丝主要由70％的丝素蛋白和25％的丝胶蛋白组成，其中的丝素蛋白具有优异的生物相容性、机械性能和可降解性，是一种非常有前途的组织工程支架材料。大量研究证明，丝素蛋白基组织工程支架能够应用于骨、皮肤、血管、神经、肝、软骨、韧带多种组织的再生。同时，丝素蛋白开始被应用于药物缓释领域，丝素蛋白薄膜或凝胶作为药物释放的载体，表现出良好的控释效果。因此，丝素蛋白有可能同时作为支架材料和药物载体，避免药物载体同支架的不相容问题。作为一种普适的生物材料，丝素蛋白在不同领域都表现出巨大的应用前景。

丝素蛋白的结晶形态主要有丝素I(Silk I)和丝素II(Silk II)两种。其中丝素II结晶是一种伸展的反平行β-折叠结构，丝素I结晶则是介于蛋白质β-折叠结构和α-螺旋结构中间的一种曲柄型结构。蚕丝纤维中丝素蛋白的结晶形态主要是丝素II结晶，从5龄蚕的绢丝腺中得到的液态丝素蛋白不做拉伸或者化学处理，在0～40℃缓慢干燥可以得到丝素I结晶。作为生物材料使用的丝素蛋白，必然涉及到这两种主要的丝素蛋白结晶结构以及非晶结构等。蚕丝纤维的降解速度比较缓慢，这是由于反平行β-折叠结构比较规整紧密。非结晶结构的丝素蛋白可溶于水，作为材料使用时需要使用交联剂来降低其水溶性，而这样作的结果有可能会降低其良好的生物相容性。而丝素I结晶作为一种结晶结构，它是不溶于水的，不需要另外添加交联剂；但因其结构比丝素II疏松，所以具有一定的生物可降解性。其生物降解速度介于非结晶结构和丝素II结晶结构的丝素蛋白之间，可以在几个月内完全降解。因此，可以通过调控两种结晶结构以及非晶结构的比例来获得所需要的材料性能

现有技术中，采用丝素蛋白制备三维多孔支架的方法有盐析法、冷冻干燥法、静电纺丝法以及相分离法等，其中，冷冻干燥法的现有技术主要有以下报道，例如：

(1)公开号为CN101502669A的中国发明专利“丝素蛋白多孔三维支架及其制备方法”中，公开了一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，先将家蚕丝经脱胶、溶解、透析、浓缩后得到质量浓度为1～30％的丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工：第一步：将丝素蛋白溶液注入金属模具中，在-10～-80℃的低温条件下经1～24小时的快速冷冻，得到冷冻体；第二步：在温度为-5～-25℃的条件下将上述冷冻体低温保存2～60天，得到冷冻结晶体；第三步：对冷冻结晶体进行解冻处理，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料，再经干燥处理，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。

上述技术方案，采用冷冻干燥法制备三维支架，避免了有机溶剂使用，但因为没有对丝素蛋白溶液进行处理，溶液中丝素蛋白没有形成规则的纳米结构，导致冷冻干燥过程中片状结构的形成。观察其电镜图片仍可知，所得支架中仍然存在分离片状结构，且该技术方案中蛋白的结晶结构无法调控。

(2)公开号为CN1262579C的中国发明专利“丝素蛋白海绵状三维多孔材料制备方法”中，需要采用甲醇或者乙醇作为变性剂，促使丝素II结构形成，提高丝素蛋白在水中稳定性，但是，因为主要以丝素II结构为主，所以降解缓慢，并且不可调控微结构中丝素I和丝素II结构的比例。

因此，需要研究发明一种在绿色温和条件下制备丝蛋白三维支架的方法，并且可以通过调节制备工艺调控多孔支架材料的孔径尺寸，二级结构的制备方法。

发明内容

本发明目的是提供一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，，克服现有技术中所得丝素蛋白多孔三维材料存在分离片状结构的缺陷，以及所得丝素蛋白多孔三维材料中丝素I和丝素II结构的比例无法调节的缺陷。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)按常规方法先将蚕丝经脱胶、溶解、透析得到纯的丝素蛋白水溶液，将丝素蛋白水溶液进行开口缓慢浓缩处理，通过调整溶液挥发面积，调整溶液浓缩速度，使丝素蛋白水溶液在35～60℃下，浓缩2～7天，使丝蛋白的最终浓度为10％～50％，然后加入水调整所述丝素蛋白水溶液的质量浓度至0.5％～10％；

(2)将醇和丝素蛋白水溶液混合均匀得到丝素蛋白溶液，所述醇为异丙醇、丙三醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇或乙二醇中的一种或两种以上的混合物；

(3)将丝素蛋白溶液注入模具中，进行冷冻处理获得冷冻体；将冷冻体进行冷冻干燥处理，获得干态的丝素蛋白多孔材料，所述丝素蛋白多孔材料不溶于水并且含有醇；

(4)将丝素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；

(5)将去除醇的丝素蛋白多孔材料再进行冷冻干燥处理获得干态的纯丝素蛋白多孔材料。

上述技术方案中，步骤(1)中，上述技术方案中，步骤(1)中，进行透析处理主要是为了过滤除去无机盐等杂质分子从而获得纯的丝素蛋白水溶液；在开口缓慢浓缩过程中，丝素蛋白可以自组装形成纳米球，并且由于开口时，溶剂水会减少，因此形成的纳米球之间会发生结合团聚成纳米线，最终培育得到了稳定的丝素蛋白纳米线水溶液，而冷冻干燥过程中片状结构的形成同丝素蛋白在溶液中的微观结构有关，从而避免了分离片状结构的形成。

上述技术方案中，步骤(2)中，按照质量比，丝素蛋白∶醇＝0.05～20∶1。随着醇含量的提高，有利于结晶结构Silk I和Silk II的形成；同时醇种类的变化同样可以影响丝素蛋白晶体结构，丙三醇的加入更有利于Silk I的形成，而乙二醇的加入则会促进Silk II含量的提高。

上述技术方案中，步骤(3)中，冷冻处理的温度为-10℃～-80℃，冷冻处理时间为1～48小时；低温有利于冰晶的快速形成，从而降低冻干后的孔径，同时低温会在一定程度上抑制丝素蛋白结晶的形成，进一步调控丝素蛋白的晶体组成。根据实际需要，优选地，冷冻处理的温度为-20℃～-60℃。

上述技术方案中，步骤(4)中，丝素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡时间为0.5～24小时。

上述技术方案中，所述冷冻干燥处理是在冻干机中进行的，冷冻干燥又称升华干燥，将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法；该方法的优点是在低温高真空的条件下使样品中的水分由冰直接升华达到干燥的目的，在干燥的过程中不受表面张力的作用，样品不变形。

上述技术方案中，按常规方法制备丝素蛋白水溶液的具体方法为：以天然家蚕丝为原料，丝经脱胶，中性盐溶液溶解后用去离子水透析获得丝素蛋白水溶液；或者以再生丝素为原料配制丝素蛋白水溶液；优选天然家蚕丝。

进一步优选的技术方案中，在步骤(3)和步骤(4)之间，对步骤(3)所得丝素蛋白多孔材料进行处理，所述处理方法选自以下处理方法中的一种或两种以上的组合：①采用真空水蒸气处理丝素蛋白多孔材料0.5～24小时；②采用真空甲醇蒸气或乙醇蒸气处理丝素蛋白多孔材料0.5～24小时；③将丝素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇中10分钟～24小时；④将丝素蛋白多孔材料进行力学拉伸处理，拉伸后增加的长度为材料原长度的20％～300％。其中真空水蒸气处理能够同时提高Silk I和Silk II的含量，而其它处理方式主要提高Silk II的含量，不同处理方式相互结合，可以对丝素蛋白中晶体含量进行进一步调控。

本发明的原理是：丝素蛋白在水溶液中存在缓慢的自组装过程，而冷冻干燥过程中片状结构的形成同丝素蛋白在溶液中的微观结构相关，本发明中丝素蛋白溶液的开口缓慢浓缩过程，调控丝素蛋白的微观结构，从而抑制片状分离结构的形成，然后通过冷冻干燥法可以获得具有良好孔结构的三维多孔支架；同时丝素蛋白的聚集态结构可以通过在培育过的丝素蛋白水溶液中加入多元醇来调控，可以促进并控制丝素蛋白Silk I和II晶体结构的形成；经过对上述两个过程中的参数进行调控，就可以直接通过冷冻干燥法制得具有良好孔结构的不溶于水的丝素蛋白多孔支架材料。另外，通过不同的后处理过程，对丝素蛋白的二级结构进行进一步调控，就可以获得具有不同二级结构和降解性能的丝素蛋白三维多孔材料。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、由于本发明通过开口缓慢浓缩过程对丝素蛋白进行调控，有效抑制了片状结构的形成，因此所获得的多孔支架同其它方法制备的支架相比，具有更加均匀、结构更好的多孔形态。

2、由于本发明在制备过程中将无毒的醇添加到丝素蛋白溶液中，促使丝素蛋白Silk I和II晶体结构形成，从而能够通过冷冻干燥法直接制得不溶于水的丝素蛋白多孔支架，而不需添加其它化学试剂，且醇可通过在水溶液中浸泡直接去除，不会引起丝素蛋白生物相容性的降低。

3、本发明可以在制备过程中，通过调节冷冻温度、丝素蛋白浓度等工艺参数，控制孔的大小，满足不同应用的需要。

4、本发明可以通过采用可选的后处理过程，进一步调节丝素蛋白多孔支架的二级结构，从而获得不同的降解性能和力学性能，以满足不同组织再生或者不同药物释放的要求。

附图说明

图1为实施例一经过缓慢浓缩处理后的丝素蛋白溶液中丝素蛋白的纳米结构原子力显微镜照片；

图2为实施例一和二所得丝蛋白支架材料的红外光谱图；其中a代表实施例一所得丝素蛋白支架材料；b代表实施例二所得丝素蛋白支架材料；

图3为实施例一所得丝蛋白支架材料的电镜照片；

图4为实施例六和七所得丝蛋白支架材料的红外光谱图；其中a代表实施例六所得丝素蛋白支架材料；b代表实施例七所得丝素蛋白支架材料；

图5为实施例六所得丝蛋白支架材料的电镜照片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

将50g左右生丝浸入2L 0.5％Na₂CO₃溶液中，搅拌煮沸30分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。

称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100ml浓度为9.5mol/L的BrLi溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为4％的丝蛋白水溶液，调节丝蛋白水溶液浓度为2％。

取上述丝蛋白溶液15mL，在60℃条件下，通过降低溶液挥发面积，调整浓缩速度，使其浓缩48小时后，浓度为30％左右，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液，所述丝素蛋白纳米线的原子力显微镜图见图1；将溶液重新稀释到2％，然后加入占干态多孔支架质量20％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻24小时。放入冻干机干燥48小时后得到乳白色的不溶性丝素三维支架。用去离子水将甘油浸泡出来，再冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。

对上述丝蛋白三维支架此支架进行电镜扫描和红外测试，结果见图2和图3，从图3可见，上述丝蛋白三维支架中的孔直径在100～300微米之间，从图2中的a曲线可知，材料在1648cm^-1处有吸收峰，这是Silk I结构的特征峰，所以丝蛋白三维支架的结构主要为Silk I结构。

实施例二：

取上述丝蛋白溶液15mL，在60℃条件下，通过降低溶液挥发面积，调整浓缩速度，使其浓缩48小时后，浓度为30％左右，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；将溶液重新稀释到2％，加入占干态多孔支架质量60％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架，然后在去离子水中浸泡12小时，将甘油浸泡出来，进一步冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。

对上述丝蛋白三维支架此支架进行红外测试，结果见图2，从图2中的b曲线可知，材料在1646cm^-1和1629cm^-1处有吸收峰，它们分别是SilkI和SilkII结构的特征吸收峰，因此丝蛋白三维支架的结构主要为Silk I和Silk II结构。

上述丝蛋白三维支架中的孔直径在100～300微米之间。

实施例三：

取上述丝蛋白溶液15mL，在60℃条件下，通过降低溶液挥发面积，调整浓缩速度，使其浓缩48小时后，浓度为30％左右，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；将溶液重新稀释到2％，加入占干态多孔支架质量40％的乙二醇，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架，然后在去离子水中浸泡20小时，将乙二醇浸泡出来，再次冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。此支架中的孔直径在100～300微米之间，主要为Silk I。

实施例四：

称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100ml浓度为9.5mol/L的BrLi溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为4％的丝蛋白水溶液。

取上述丝蛋白溶液20mL，在35℃条件下，通过降低溶液挥发面积，调整浓缩速度，使其浓缩96小时后，浓度为30％左右，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；将溶液重新稀释到6％，加入占干态多孔支架质量40％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具，放入-60℃下冷冻48小时。然后再放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的丝素三维支架，将支架在去离子水中浸泡16小时，将甘油浸泡出来，再次冷冻干燥即得到丝蛋白三维支架。此支架中孔的直径在100微米以下，主要为Silk I和Silk II结构。

实施例五：

将50g左右生丝浸入2L 0.5％NaCO₃溶液中，搅拌煮沸30分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。

取上述丝蛋白溶液15mL，在常温25℃下进行缓慢浓缩，浓缩7天，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；然后加去离子水配成2％的丝素溶液，加入占干态多孔支架质量60％的丙三醇和占干态多孔支架质量20％的乙二醇，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后再放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的丝素三维支架，然后用去离子水将甘油浸泡出来，进一步冷冻干燥即得到丝蛋白三维支架。此丝素蛋白支架主要为Silk II结构，孔径在100～300微米之间。

实施例六：

取上述丝蛋白溶液40mL，在60℃进行缓慢浓缩，通过控制挥发表面积，使溶液在浓缩48小时后，浓度达到30％，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液。将溶液稀释到2％后，加入占干态多孔支架质量20％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架。将此支架利用真空水蒸气处理的方法处理6小时后，浸泡在去离子水中20小时，去除甘油，再次冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。

对上述丝蛋白三维支架进行电镜扫描和红外测试，结果见图4和图5，从图5可见，上述丝蛋白三维支架中的孔直径在100～300微米之间，从图4中的a曲线可知，材料在1648cm^-1和1629cm^-1处有吸收峰，分别是SilkI和SilkII结构的特征吸收峰，因此丝蛋白三维支架的结构主要为SilkI和SilkII结构。

实施例七：

称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100ml浓度为9.5mol/L的BrLi溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为4％的丝蛋白水溶液，调节丝蛋白水溶液浓度为1.5％。

取上述丝蛋白溶液40mL，在60℃进行缓慢浓缩，通过控制挥发表面积，使溶液在浓缩48小时后，浓度达到30％，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；加去离子水稀释成2％的丝素溶液。然后加入占干态多孔支架质量60％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架。用真空乙醇蒸气处理6小时后，将支架浸泡在去离子水中20小时，去除甘油和甲醇，进一步冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。

对上述丝蛋白三维支架此支架进行红外测试，结果见图4，从图4中的b曲线可知，材料在1629cm^-1处有吸收峰，它分别是SilkII结构的特征吸收峰，因此丝蛋白三维支架的结构主要为Silk II结构。

上述丝蛋白三维支架中的孔直径在100～300微米之间。

实施例八：

将50g左右生丝浸入2L 0.5％Na_2CO₃溶液中，搅拌煮沸30分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。

取上述丝蛋白溶液40mL，在30℃调整浓缩速度，缓慢浓缩200小时后溶液浓度为40％左右，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液。将溶液浓度稀释至2％，然后加入占干态多孔支架质量40％的乙二醇，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-60℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的丝素三维支架，将此支架在甲醇溶液中直接浸泡0.5小时，促进Silk II的形成。随后将此在去离子水中浸泡12小时，去除乙二醇和甲醇，再次冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。此支架中的孔直径在100～300微米之间，主要为SilkII。

实施例九：

取上述丝蛋白溶液40mL，调整浓缩速度，在60℃缓慢浓缩48小时后浓度提高到40％，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；将溶液稀释到2％，然后加入占干态多孔支架质量20％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具，放入-60℃下冷冻48小时。然后再放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架。将此支架固定在双向拉伸装置上，双向拉伸100％。随后在去离子水中浸泡10小时，去除甘油，进一步冷冻干燥即得到丝蛋白三维支架。此支架中丝素蛋白主要为Silk II结构。

实施例十：

称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100ml浓度为9.5mol/L的BrLi溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为4％的丝蛋白水溶液，调整丝素蛋白浓度到2％。

取上述丝蛋白溶液20mL，在60℃缓慢浓缩96小时，使丝素蛋白溶液浓度达到20％，浓缩后得到丝素蛋白纳米线的水溶液；然后稀释至8％。加入占干态多孔支架质量20％的甘油，搅拌均匀后倒入聚乙烯模具再放入-20℃下冷冻48小时。然后放入冻干机干燥48小时，得到乳白色的不溶性丝素三维支架。将此支架利用真空水蒸气处理方法处理6小时后，用去离子水浸泡24小时，去除甘油，再冷冻干燥即得到纯的丝蛋白三维支架。此丝素蛋白支架孔径在100微米以下，主要由SilkI晶体组成。

上述实施例所得丝素蛋白三维支架材料可应用于骨、软骨、韧带、神经、皮肤等组织修复以及药物缓释的载体等。

Claims

1.一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)将丝素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，开口缓慢浓缩的温度为20℃～80℃，浓缩时间为1～240小时。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按照质量比，丝素蛋白∶醇＝0.05～20∶1。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中，冷冻处理的温度为-10℃～-80℃，冷冻处理时间为1～48小时。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(4)中，丝素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡时间为0.5～24小时。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，在步骤(3)和步骤(4)之间，对步骤(3)所得丝素蛋白多孔材料进行处理，所述处理方法选自以下处理方法中的一种或两种以上的组合：①采用真空水蒸气处理丝素蛋白多孔材料0.5～24小时；②采用真空甲醇蒸气或乙醇蒸气处理丝素蛋白多孔材料0.5～24小时；③将丝素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇中10分钟～24小时；④将丝素蛋白多孔材料进行力学拉伸处理，拉伸后增加的长度为材料原长度的20％～300％。