CN102585277B - 一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，属于生物材料领域。一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，其特征在于它包括如下步骤：1)将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，空化作用后，得到无鳞片的羊毛毛干；2)按无鳞片的羊毛毛干的重量与助剂的体积比为5g∶100ml，溶解，过滤，得到滤液，再用截留分子量为3500Da～14000Da的透析袋透析，透析时间为3～7天，得到羊毛角蛋白溶液；3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液用聚乙二醇浓缩，浓缩至羊毛角蛋白溶液的浓度为(100～300)mg/ml，在-20～-80℃的温度下预冻，预冻时间为3～18h，然后在低温真空条件下冻干成角蛋白多孔膜。该工艺简单、清洁环保，制得的角蛋白多孔膜具有厚度均匀、孔洞分散性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，属于生物材料领域。
背景技术
角蛋白天然纤维广泛存在于自然界中，各种动物的毛发均为角蛋白材料。我国的纺织产业和畜牧加工业每年产生大量的废弃动物毛发纤维，这些废弃角蛋白纤维的任意丢弃，不仅会造成环境的污染，而且是资源的浪费。动物纤维中角蛋白的含量达90％以上，是极好的可再生利用资源，在化妆品、纺织印染、生物医药等领域已有应用。
组织工程的基础是组织工程材料，而其基体材料是生物细胞生长和成形的支撑体。人们可以在体外将干细胞移植在基体上，生长成由正常组织细胞和生物基体材料组成的生物复合材料。不仅可以对此做体外生物和医学实验，获得科学数据，也有望植入人体做组织修复和器官替代。显然，选择和制备生物相容性的生物基体材料具有重要学术意义和实用价值。而羊毛角蛋白本身具有生物相容性、良好的机械性能、优异的生物化学性能等，是作为组织工程材料基体的首选材料之一。
国内对于多孔膜的研究，有‘一种多孔丝素膜及其制备方法’(中国专利申请号00102103.6)，他是以蚕丝作为原材料，然后经脱胶、溶解、透析、浓缩后，采用冷冻干燥法，制成多孔膜。冷冻干燥温度范围：-4--85℃。
‘一种生物医用材料及其制备方法和用途’(中国专利申请号200310111025.0)，其是采用胶原蛋白或明胶、葡甘聚糖、硫酸软骨素或壳聚糖，经搅拌、减压脱泡、干燥、碱性水溶液浸泡、漂洗最后成膜；或者将脱泡后的复合物直接冷冻干燥成膜。冷冻干燥温度范围：-40--75℃。
‘冷冻干燥法制备多孔材料的改进’(中国专利申请号200710039451.6)，其特征在于通过控制粉体和有机添加剂的添加量调控浆料的固含量，控制冷冻速率形成多孔素胚，最后经过烧结、制成多孔材料。其粉体为陶瓷粉体，有机添加剂为聚乙烯醇、甲基纤维素或淀粉，冷冻干燥温度范围：-10--60℃。
‘一种真空冷冻干燥法制备大比表面积纳米多孔材料的方法’(中国专利申请号200910037592.3)，步骤为以有机硅烷前聚体或金属醇盐为原材料合成湿凝胶，静置老化，用乙醇清洗，再加入修饰剂浸泡，最后预冻干燥。预冻温度范围：-10--85℃。
‘一种壳聚糖/聚乙烯醇/聚乳酸共混多孔膜的制备方法’(CN 101824160A)，是以壳聚糖，聚乙烯醇，聚乳酸为原材料制的多孔膜，步骤为：醋酸溶解壳聚糖，二甲基亚砜溶解聚乳酸，去离子水溶解聚乙烯醇，再将上述三种溶液混合，搅拌，静置脱泡，冷冻干燥。冷冻干燥温度范围：-8--80℃。
上诉专利报道虽与本发明所使用的多孔膜的成形方法有关，但与羊毛角蛋白的再利用，化学试剂、溶液酸碱性、工艺参数存在不同。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，该工艺简单、清洁环保，制得的角蛋白多孔膜具有厚度均匀、孔洞分散性好的特点。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，其特征在于它包括如下步骤：
1)将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，空化作用后【使羊毛鳞片与毛干分离，经筛网(125目筛网)保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片】，得到无鳞片的羊毛毛干；
2)按无鳞片的羊毛毛干的重量与助剂的体积比为5g∶100ml，将步骤1)中所制备的无鳞片的羊毛毛干在助剂(无毒中性、少污染的助剂)中水浴搅拌溶解，水浴温度为60～100℃，水浴时间6～12h，用100～400目筛过滤，得到滤液，再用截留分子量为3500Da～14000Da的透析袋透析，透析时间为3～7天，得到羊毛角蛋白溶液(或称角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液用聚乙二醇(分子量为20000)浓缩，浓缩至羊毛角蛋白溶液的浓度为(100～300)mg/ml，在-20～-80℃的温度下预冻，预冻时间为3～18h，然后在低温(温度为0～-80℃)真空条件(真空度为1～5bar)下冻干成角蛋白多孔膜，温度为0～-80℃，设备内气压为1～5bar，冻干时间为12～20h。
步骤1)中所述空化作用为超声波作用，按小段的羊毛的重量与溶剂的体积比为1g∶50～100ml，将小段的羊毛放入溶剂中超声波作用5～20min(间歇式作用，作用总时间为5～20min)，其中空化作用时间为1s～9s、间歇时间为2s～18s；超声波的功率为200～600W；所用溶剂为浓度80wt％～90wt％的甲酸；使羊毛鳞片与毛干分离，经筛网(125目筛网)保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。
步骤2)中的助剂是由尿素水溶液(溶剂)、十二烷基磺酸钠(表面活性剂)、2-巯基乙醇(开键还原剂)、水(去离子水)混合而成，尿素水溶液、十二烷基磺酸钠、2-巯基乙醇、水的配比为：40g∶1g∶2.5ml∶100ml；尿素水溶液的浓度为20～40wt％。
所得到的角蛋白多孔膜的用途，其特征在于可用于抗菌材料、组织工程材料、人工骨材、生物活体载体或微胶囊等。
本发明的有益效果是：
1)本发明的角蛋白多孔膜的制备，是采用无毒、低污染的中性溶剂(即助剂)直接溶解得到羊毛角蛋白大分子，故具有生物相容性、良好的机械性能、优异的生物化学性能等，可作为组织工程材料基体的首选材料之一。
2)角蛋白多孔膜的成形采用物理的冷冻干燥法，是先将自然铺展在成膜板上的液膜(即羊毛角蛋白溶液)放置在真空冷冻干燥机内，降温后，利用水相在低于冰点时会形成晶核和结晶成长为较大的冰晶粒子，使角蛋白与水相分离成两相结构，在真空的干燥作用下，冰晶及部分液体水会升华或蒸发，留下连续或不连续孔隙，形成多孔，而冰晶粒子附近的角蛋白溶液则被浓缩、固化形成连续的支撑相，故清洁环保。
3)由冷冻干燥法可得到孔隙分布均匀、规则，取向性好的致密羊毛角蛋白多孔膜。
4)本发明所采用的原料来源广泛、价格低廉，成膜工艺简单、清洁环保、易于产业化、产品附加值高。
附图说明
图1为实施例1制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图。图1说明由实施例1得到的羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
1)将羊毛洗净、脱脂、烘干后，将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，以固液比1g/100ml浸入到浓度为88wt％的甲酸中，以功率200w，空化作用时间1s/间隔时间2s超声波破碎10min后，用125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。将得到的无鳞片的羊毛毛干洗净，干燥，备用。
2)将40g尿素水溶液(浓度为30wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。将无鳞片的羊毛毛干按固液比为5g/100ml浸入到所得助剂中水浴搅拌溶解，在80℃搅拌8h，用125目筛过滤，将滤液用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析时间为5天，得到羊毛角蛋白溶液(角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液在聚乙二醇20000的作用下浓缩到羊毛角蛋白溶液的浓度为100mg/ml。将浓缩后的羊毛角蛋白溶液置于模具内，控制厚度在1cm以内，在-25℃的温度下预冻，预冻时间为12h，然后在低温真空条件下(温度为-80℃，设备内气压为2bar)冻干成膜，冻干时间为12h后，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为13.6N/cm2，断裂伸长率为11.5％，说明具有良好的机械性能。
图1为实施例1制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图。图1说明由实施例1得到的羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例1：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例2
1)将羊毛洗净、脱脂、烘干后，将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，以固液比1g/100ml浸入到浓度为88wt％的甲酸中，以功率400w，空化作用时间3s/间隔时间6s超声波破碎15min后，用125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。将得到的无鳞片的羊毛毛干洗净，干燥，备用。
2)将40g尿素水溶液(浓度为30wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。将无鳞片的羊毛毛干按固液比为5g/100ml浸入到所得助剂中水浴搅拌溶解，在60℃搅拌12h，用125目筛过滤，将滤液用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析时间为5天，得到羊毛角蛋白溶液(角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液在聚乙二醇20000的作用下浓缩到羊毛角蛋白溶液的浓度为100mg/ml。将浓缩后的羊毛角蛋白溶液置于模具内，控制厚度在1cm以内，在-25℃的温度下预冻，预冻时间为18h，然后在低温真空条件下(温度为-80℃，设备内气压为2bar)冻干成膜，冻干时间为12h后，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为13.1N/cm2，断裂伸长率为11.2％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图(与图1相同，省略)可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例2：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例3
1)将羊毛洗净、脱脂、烘干后，将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，以固液比1g/100ml浸入到浓度为88wt％的甲酸中，以功率400w，空化作用时间5s/间隔时间10s超声波破碎20min后，用125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。将得到的无鳞片的羊毛毛干洗净，干燥，备用。
2)将40g尿素水溶液(浓度为30wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。将无鳞片的羊毛毛干按固液比为5g/100ml浸入到所得助剂中水浴搅拌溶解，在100℃搅拌6h，用125目筛过滤，将滤液用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析时间为5天，得到羊毛角蛋白溶液(角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液在聚乙二醇20000的作用下浓缩到羊毛角蛋白溶液的浓度为100mg/ml。将浓缩后的羊毛角蛋白溶液置于模具内，控制厚度在1cm以内，在-50℃的温度下预冻，预冻时间为7h，然后在低温真空条件下(温度为-80℃，设备内气压为3bar)冻干成膜，冻干时间为12h后，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为15.2N/cm2，断裂伸长率为12.5％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例3：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例4
1)将羊毛洗净、脱脂、烘干后，将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，以固液比1g/100ml浸入到浓度为88wt％的甲酸中，以功率600w，空化作用时间3s/间隔时间6s超声波破碎10min后，用125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。将得到的无鳞片的羊毛毛干洗净，干燥，备用。
2)将40g尿素水溶液(浓度为30wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。将无鳞片的羊毛毛干按固液比为5g/100ml浸入到所得助剂中水浴搅拌溶解，在80℃搅拌8h，用125目筛过滤，将滤液用截留分子量为3500Da透析袋(透析膜)透析，透析时间为5天，得到羊毛角蛋白溶液(角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液在聚乙二醇20000的作用下浓缩到羊毛角蛋白溶液的浓度为200mg/ml。将浓缩后的羊毛角蛋白溶液置于模具内，控制厚度在1cm以内，在-50℃的温度下预冻，预冻时间为7h，然后在低温真空条件下(温度为-80℃，设备内气压为3bar)冻干成膜，冻干时间为12h后，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为15.1N/cm2，断裂伸长率为12.1％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例4：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例5
1)将羊毛洗净、脱脂、烘干后，将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，以固液比1g/100ml浸入到浓度为90wt％的甲酸中，以功率200w，空化作用时间3s/间隔时间6s超声波破碎20min后，用125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片。将得到的无鳞片羊毛毛干洗净，干燥，备用。
2)将40g尿素水溶液(浓度为30wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。将无鳞片的羊毛毛干按固液比为5g/100ml浸入到所得助剂中水浴搅拌溶解，在80℃搅拌8h，用125目筛过滤，将滤液用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析时间为5天，得到羊毛角蛋白溶液(角蛋白基质溶液)；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液在聚乙二醇20000的作用下浓缩到羊毛角蛋白溶液的浓度为300mg/ml。将浓缩后的羊毛角蛋白溶液置于模具内，控制厚度在1cm以内，在-80℃的温度下预冻，预冻时间为3h，然后在低温真空条件下(温度为-80℃，设备内气压为2bar)冻干成膜，冻干时间为12h后，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为17.1N/cm2，断裂伸长率为15.2％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例5：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例6
1)将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，按小段的羊毛的重量与溶剂的体积比为1g∶50ml，所用溶剂为浓度80wt％的甲酸；将小段的羊毛放入溶剂中超声波作用5min(间歇式作用，作用总时间为5min)，其中空化作用时间为1s、间歇时间为2s；超声波的功率为200W；使羊毛鳞片与毛干分离，经筛网(125目筛网)保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片，得到无鳞片的羊毛毛干。
2)将40g尿素水溶液(浓度为20wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。
按无鳞片的羊毛毛干的重量与助剂的体积比为5g∶100ml，将步骤1)中所制备的无鳞片的羊毛毛干在助剂中水浴搅拌溶解，水浴温度为60℃，水浴时间6h，用100目筛过滤，得到滤液，再用截留分子量为3500Da的透析袋透析，透析时间为3天，得到羊毛角蛋白溶液；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液用聚乙二醇(分子量为20000)浓缩，浓缩至羊毛角蛋白溶液的浓度为100mg/ml，在-20℃的温度下预冻，预冻时间为3h，然后在低温(温度为0℃)真空条件(真空度为1bar)下冻干成角蛋白多孔膜，冻干时间为12h，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为15.1N/cm2，断裂伸长率为12.1％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例6：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
实施例7
1)将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，按小段的羊毛的重量与溶剂的体积比为1g∶100ml，所用溶剂为浓度90wt％的甲酸；将小段的羊毛放入溶剂中超声波作用20min(间歇式作用，作用总时间为20min)，其中空化作用时间为9s、间歇时间为18s；超声波的功率为600W；使羊毛鳞片与毛干分离，经筛网(125目筛网)保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片，得到无鳞片的羊毛毛干。
2)将40g尿素水溶液(浓度为40wt％)，1g十二烷基磺酸钠，2.5ml 2-巯基乙醇加入到100ml去离子水中得到所用助剂。
按无鳞片的羊毛毛干的重量与助剂的体积比为5g∶100ml，将步骤1)中所制备的无鳞片的羊毛毛干在助剂中水浴搅拌溶解，水浴温度为100℃，水浴时间12h，用400目筛过滤，得到滤液，再用截留分子量为14000Da的透析袋透析，透析时间为7天，得到羊毛角蛋白溶液；
3)将步骤2)得到的羊毛角蛋白溶液用聚乙二醇(分子量为20000)浓缩，浓缩至羊毛角蛋白溶液的浓度为300mg/ml，在-80℃的温度下预冻，预冻时间为18h，然后在低温(温度为-80℃)真空条件(真空度为5bar)下冻干成角蛋白多孔膜，冻干时间为20h，得到羊毛角蛋白多孔膜(即角蛋白多孔膜)。此羊毛角蛋白多孔膜的厚度均匀，厚度小于1cm。拉伸断裂强度为15.1N/cm2，断裂伸长率为12.1％，说明具有良好的机械性能。
从制得的羊毛角蛋白多孔膜的SEM图可看出羊毛角蛋白多孔膜的孔洞分散性均匀，说明孔洞分散性好。
应用实例7：
体外细胞培养：在无菌条件下将羊毛角蛋白多孔膜放入细胞培养皿中，种植一定密度的待培养细胞，加入DMF培养液，将培养皿置于37℃，5wt％CO2培养箱中培养。细胞在羊毛角蛋白多孔膜上正常生长，繁殖，铺展。说明本发明可用于生物活体载体。
Claims (2)
1.一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，其特征在于它包括如下步骤：
1） 将羊毛人工剪切成0.5～1cm的小段，空化作用后，得到无鳞片的羊毛毛干；
所述空化作用为超声波作用，按小段的羊毛的重量与溶剂的体积比为1g：50～100ml，将小段的羊毛放入溶剂中超声波作用5～20min，其中空化作用时间为1s～9s、间歇时间为2s～18s；超声波的功率为200～600W；所用溶剂为浓度80wt%～90wt%的甲酸；使羊毛鳞片与毛干分离，经125目筛网保留无鳞片的羊毛毛干，而去除分离后的鳞片；
2）按无鳞片的羊毛毛干的重量与助剂的体积比为5g：100ml，将步骤1）中所制备的无鳞片的羊毛毛干在助剂中水浴搅拌溶解，水浴温度为60～100℃，水浴时间6～12h，用100～400目筛过滤，得到滤液，再用截留分子量为3500Da～14000Da的透析袋透析，透析时间为3～7天，得到羊毛角蛋白溶液；
所述的助剂是由尿素水溶液、十二烷基磺酸钠、2-巯基乙醇、水混合而成，尿素水溶液、十二烷基磺酸钠、2-巯基乙醇、水的配比为：40g∶1g∶2.5ml∶100ml；尿素水溶液的浓度为20～40wt%；
3）将步骤2）得到的羊毛角蛋白溶液用聚乙二醇浓缩，浓缩至羊毛角蛋白溶液的浓度为（100～300）mg/ml，在-20～-80℃的温度下预冻，预冻时间为3～18h，然后在低温真空条件下冻干成角蛋白多孔膜，温度为0～-80℃，设备内气压为1～5bar，冻干时间为12～20h。
2.根据权利要求1所述的一种冷冻制备角蛋白多孔膜的工艺，其特征在于，步骤3）中所述聚乙二醇的分子量为20000。
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