CN105457095A - 一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可生物医用的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜及其制备方法。它以角蛋白和丝素蛋白为主要原料，经添加剂的增塑作用，在恒温恒湿条件下形成一种柔韧的、难溶于水的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜。该膜的天然蛋白含量为60～90％，拉伸断裂强度为1～40MPa，断裂伸长率为50～400％，结晶度为5～45％。另外，本发明所得的复合致密膜由于其优异的柔韧性和生物相容性可应用于人造皮肤或角膜、口腔种植修复等领域。

Description

一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜及其制备方法，特别涉及一种以角蛋白和丝素蛋白为原料，制备柔韧的复合蛋白材料的方法，所制备的材料可应用于口腔种植修复及人造角膜等领域。
背景技术
丝素蛋白是一种天然高分子材料，因其良好的生物相容性、生物降解性、机械性能等特点，在生物医学、化妆品、食品等领域得到越来越广泛的研究与应用。丝素膜在湿润的条件下有很好的溶氧渗透率，有望用于制备人造皮肤等组织修复材料。但由于再生丝素蛋白是水溶性的，且干态下柔韧性较差，所以丝素膜在生物医学领域的应用范围受到很大局限。
为此，人们通过各类研究以提高和改良丝素膜的力学性能：
中国发明专利“再生丝素蛋白膜及其制备方法”(公开号CN101760027A)中，将提纯后的丝素蛋白溶液在PS皿内直接干燥成膜(未对干燥条件提出要求)，干燥方式的温度或湿度条件不可控，难免会造成所得膜的差异性；
中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方法”(CN1316465A)中，通过加入环氧树脂作为交联剂，制备柔韧性较好且难溶于水的丝素蛋白膜，但交联剂的加入会影响材料的生物相容性。
因此，如何获得一种生物相容性好，具有一定强度和柔韧性、无毒、可生物降解、成形后的膜之间差异性小，能满足生物医学材料要求的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜材料是一个亟待解决的课题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种生物相容性好、具有一定强度和柔韧性、无毒、可生物降解，并满足生物医学材料要求的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的复合致密膜，是以角蛋白和天然蚕丝为主要材料，添加一定量的增塑剂或增稠剂，所制成的结构致密的透明状蛋白膜。该膜的天然蛋白含量为60～90％，拉伸断裂强度为1～40MPa，断裂伸长率为50～400％，结晶度为5～45％。
本发明所述的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过对动物毛羽和蚕丝进行溶解、过滤、透析、浓缩，分别制备角蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液；
(2)取相同浓度的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液，按一定的体积比例配制混合溶液，加入一定量的增塑剂后，经振荡搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液平铺于一定尺寸的离型纸上，在恒温恒湿箱中放置48h进行干燥成膜。
(4)将步骤(3)得到的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜在医用酒精中浸泡0.5～2h，取出用磷酸盐缓冲液洗净风干，即可得到基本不溶的、具有一定柔韧性的复合蛋白膜。
优选的，上述步骤(1)中，所述的角蛋白基质是从天然蛋白纤维中提取得到，所述的天然蛋白纤维优选为人发、羊毛、羊绒、驼毛或兔毛中的一种或几种，蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、天蚕丝中的一种或几种经过脱胶工序后得到的脱胶丝。
优选的，上述步骤(2)中所采用的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液的浓度为1～20％，复合蛋白溶液中丝素蛋白的体积比例为5～95％。
优选的，上述步骤(2)中的增塑剂为丙三醇或聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、聚乙二醇2000中的一种或几种，且所述增塑剂与复合蛋白溶液的质量比例为1～40％.
优选的，上述步骤(3)中的恒温恒湿条件如下：温度为20～50℃，湿度为30～70％。
优选的，上述步骤(3)中，可通过改变混合溶液的浓度及离型纸的尺寸控制薄膜的厚度，所得复合蛋白膜的厚度在50～200μm。
优选的，上述步骤(4)中所述医用酒精的浓度为70～100％，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、或者磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的混合溶液，该缓冲液的PH值为7.2～7.4，浓度为5～20mM。
采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比具有以下优点和效果：
(1)本发明采用丝素蛋白和角蛋白作为原料，综合了蚕丝强度高和动物毛羽弹性好的双重优势，得到的复合蛋白膜具有优异的机械性能，其断裂强度可高达40MPa，断裂伸长率大于150％；
(2)本发明在成膜过程中采用特定的温度和湿度，避免了膜在成形过程中由于外界条件改变而造成的差异，因此提高了成膜实验的重复性，相关测试结果更有说服力；
(3)本发明所采用的原料均为天然蛋白质，具有优异的生物相容性，无毒无刺激，可临床应用；且所述的加工方法简单有效，适合产业化应用。
(4)本发明所获得的复合致密膜为透明膜，可应用于人造皮肤、角膜或口腔修复等领域。
附图说明
图1为实施例二中角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的场发射扫描电镜图片；
图2为实施例二中角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的原子力显微镜图片；
图3为实施例一至三中各复合致密膜的X衍射曲线；
图4为实施例三中纯丝素蛋白膜与复合致密膜样品表面细胞的生长状态；
图5为实施例一至三中各复合致密膜的力学拉伸曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
(1)将剪成碎片的蚕茧在0.5％(w/v)的碳酸氢钠溶液中煮沸30min，重复两次以去除丝胶，然后用纯水洗净，获得脱胶丝并自然干燥。在50℃的温度条件下将干燥的脱胶丝溶解于9.3mol/L的溴化锂溶液中，4个小时后注入截流分子量为3500D的透析袋内进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的纯丝素蛋白溶液。
(2)将洗净的羊毛剪碎，置于含有尿素(7M)、十二烷基硫酸钠(0.2M)、2-巯基乙醇(1.6M)的混合溶液里，在50℃条件下慢速搅拌8个小时，用120目的筛网去除未完全溶解的羊毛后，将羊毛溶解液注入截流分子量为8～14KD的透析袋中进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的角蛋白溶液。
(3)取上述浓度为5wt％的两种蛋白溶液，按照角蛋白：丝素蛋白20:80的体积比例混合，并加入质量浓度为2％的丙三醇，配制混合蛋白溶液。
(4)将混合溶液平铺于离型纸上在恒温恒湿箱内静置48h后取出，在医用酒精中浸泡1h后用去离子水洗净风干，即得基本不溶的、柔韧的呈透明状的羊毛角蛋白/丝素蛋白复合致密膜。
(5)将该复合致密膜按照GB/T1040-2006标准制成条状，使用Instronmicrotester5948进行拉伸试验。试验环境为：温度25℃，湿度为50％，每组试样重复6次，取平均值，可得该复合致密膜的屈服强度为27.16±7.21MPa，拉伸断裂强度为35.41±11.54MPa，拉伸断裂长度为160.6±58％。
实施例二
制备纯丝素蛋白膜：
(1)将剪成碎片的蚕茧在0.5％(w/v)的碳酸氢钠溶液中煮沸30min，重复两次以去除丝胶，然后用纯水洗净，获得脱胶丝并自然干燥。在50℃的温度条件下将干燥的脱胶丝溶解于9.3mol/L的溴化锂溶液中，4个小时后注入截流分子量为3500D的透析袋内进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的纯丝素蛋白溶液。
(2)将上述溶液平铺于离型纸上在恒温恒湿箱内静置48h后取出，在医用酒精中浸泡1h后用去离子水洗净风干，即得纯的丝素蛋白膜。
制备角蛋白和丝素蛋白的体积比例为40：60的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜：
(1)将剪成碎片的蚕茧在0.5％(w/v)的碳酸氢钠溶液中煮沸30min，重复两次以去除丝胶，然后用纯水洗净，获得脱胶丝并自然干燥。在50℃的温度条件下将干燥的脱胶丝溶解于9.3mol/L的溴化锂溶液中，4个小时后注入截流分子量为3500D的透析袋内进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的纯丝素蛋白溶液。
(2)将洗净的羊毛剪碎，置于含有尿素(7M)、十二烷基硫酸钠(0.2M)、2-巯基乙醇(1.6M)的混合溶液里，在50℃条件下慢速搅拌8个小时，用120目的筛网去除未完全溶解的羊毛后，将溶解液注入截流分子量为8～14KD的透析袋中进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的角蛋白溶液。
(3)取上述浓度为5wt％的两种蛋白溶液，按照角蛋白：丝素蛋白40:60的体积比例混合，并加入质量浓度为2％的丙三醇，配制混合蛋白溶液。
(4)将混合溶液平铺于离型纸上在恒温恒湿箱内静置48h后取出，在医用酒精中浸泡1h后用去离子水洗净风干，即得基本不溶的、柔韧的羊毛角蛋白/丝素蛋白复合致密膜。
(5)将该复合致密膜按照GB/T1040-2006标准制成条状，使用Instronmicrotester5948进行拉伸试验。试验环境为：温度25℃，湿度为50％，每组试样重复6次，取平均值，可得该复合致密膜的屈服强度为17.16±4.48MPa，拉伸断裂强度为25.70±8.01MPa，拉伸断裂长度为232.41±50.79％。
(6)分别用场发射扫描电镜和原子力显微镜对该角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的表面形貌进行表征，参见附图1与附图2。
将上述方法所获得的纯丝素蛋白膜与角蛋白/丝素蛋白复合致密膜分别裁剪成合适尺寸置于24孔板中，用医用酒精灭菌后PBS缓冲液洗净，密封保存，备用。然后在37℃的条件下于5％CO2培养箱中进行细胞培养，将L929成纤细胞分别种植于丝素膜和复合致密膜上，用荧光显微镜观察细胞生长状态。结果参见附图4，A和B分别为纯丝素蛋白膜和角蛋白/丝素蛋白复合致密膜表面细胞的生长情况。与纯丝素蛋白膜相比，复合致密膜上的细胞生长的更密集，因此角蛋白的加入更有利于细胞的吸附。
实施例三
(1)将剪成碎片的蚕茧在0.5％(w/v)的碳酸氢钠溶液中煮沸30min，重复两次以去除丝胶，然后用纯水洗净，获得脱胶丝并自然干燥。在50℃的温度条件下将干燥的脱胶丝溶解于9.3mol/L的溴化锂溶液中，4个小时后注入截流分子量为3500D的透析袋内进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的纯丝素蛋白溶液。
(2)将洗净的羊毛剪碎，置于含有尿素(7M)、十二烷基硫酸钠(0.2M)、2-巯基乙醇(1.6M)的混合溶液里，在50℃条件下慢速搅拌8个小时，用120目的筛网去除未完全溶解的羊毛后，将羊毛溶解液注入截流分子量为8～14KD的透析袋中进行透析，即可得到质量浓度为5wt％的羊毛角蛋白溶液。
(3)取上述浓度为5wt％的两种蛋白溶液，按照角蛋白：丝素蛋白60:40的体积比例混合，并加入质量浓度为2％的丙三醇，配制混合蛋白溶液。
(4)将混合溶液平铺于离型纸上在恒温恒湿箱内静置48h后取出，在医用酒精中浸泡1h后用去离子水洗净风干，即得基本不溶的、柔韧的羊毛角蛋白/丝素蛋白复合致密膜。
(5)将该复合致密膜按照GB/T1040-2006标准制成条状，使用Instronmicrotester5948进行拉伸试验。试验环境为：温度25℃，湿度为50％，每组试样重复6次，取平均值，可得该复合致密膜的屈服强度为8.66±1.23MPa，拉伸断裂强度为12.05±3.39MPa，拉伸断裂长度为155.18±85.7％。
将实施例一至三中各复合致密膜样品剪成片状，使用X射线衍射仪测定。附图3为实施例一至三中各复合致密膜的X衍射测试结果，其中，A，B和C分别代表实施例一、二和三中复合致密膜的XRD曲线。从图中可以看出，复合致密膜随着丝素含量的增加，位于2θ＝20.8°β结晶结构的衍射峰越来越尖锐，因此复合致密膜的β结晶结构随着丝素蛋白含量的增加而增加。
附图5为实施例一至三中各复合致密膜的力学拉伸结果，其中，A，B和C分别代表实施例二、三和四中复合致密膜的力学拉伸曲线。从图中可以看出，复合致密膜随着角蛋白含量的增多伸长率越来越大，外观表现为柔韧性增强。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜，其特征在于：所述复合致密膜为无孔结构薄膜，其由下列质量百分比的原料组成，角蛋白5-95％、丝素蛋白95-5％及醇类添加剂1-10％，结晶度为5～45％。
2.根据权利要求1所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜，其特征在于：所述醇类添加剂为丙三醇或聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜，其特征在于：所述复合致密膜为透明状薄膜。
4.根据权利要求1所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜，其特征在于：所述复合致密膜的拉伸断裂强度为1～40MPa，断裂伸长率为50～400％。
5.一种如权利要求1所述的角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过对动物毛羽和蚕丝进行溶解、过滤、透析、浓缩，分别制备角蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液；
(2)取相同浓度的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液，按一定的体积比例配制复合蛋白溶液，加入一定量的醇类添加剂后，经振荡搅拌均匀；
(3)将混合溶液平铺于一定尺寸的离型纸上后放置在恒温恒湿箱中进行干燥成膜，成膜后在医用酒精中浸泡0.5-2h，取出后用磷酸盐缓冲液洗净风干。
6.根据权利要求5所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述复合蛋白溶液中角蛋白与丝素蛋白各自的浓度为1～20％，丝素蛋白在总蛋白中所占的体积比为5％～95％。
7.根据权利要求5所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述恒温恒湿箱的温度为20～50℃，湿度为30～70％。
8.根据权利要求5所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)的所述的醇类添加剂与所述复合蛋白溶液的质量比例为1～10％。
9.根据权利要求5所述的一种角蛋白/丝素蛋白复合致密膜的制备方法，其特征在于：所述医用酒精的浓度为70～100％；所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、或者磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的混合溶液，该缓冲液的PH值为7.2～7.4，浓度为5～20mM。
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