CN103861149B

CN103861149B - 一种持久透明的丝素蛋白膜及其制备方法

Info

Publication number: CN103861149B
Application number: CN201410095712.6A
Authority: CN
Inventors: 张珊珊; 卢神州; 李姣姣; 李翔; 胡柯豪; 解传芳
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Paraxon Pharmaceutical Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN103861149A

Abstract

本发明涉及一种持久透明的丝素蛋白膜及其制备方法。它以丝素蛋白为原料，在丝素溶液中加入分子量小于150的酰胺作为透明交联剂，浇铸成膜。该丝素膜在400～800nm可见光范围内透光率大于90%，并具有持久性。制备的丝素蛋白膜易降解，生物相容性好，作为细胞载体材料细胞能在其上正常的生长。由于该材料长时间能保持稳定的透明，所以作为角膜载体或者角膜替代材料有一定的优势，它可用于隐形眼镜、人造角膜、细胞培养、创面修复材料及暂时性覆盖、组织隔离和药物控制释放材料等。

Description

一种持久透明的丝素蛋白膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备长时间保持透明的丝素蛋白膜的技术，所制备的材料可应用于人造角膜和角膜组织工程材料及创面覆盖材料等领域。

背景技术

角膜是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。各种原因导致的角膜溃疡、损伤、瘫痕等是导致角膜盲的主要原因。根据联合国世界卫生组织的报道,角膜病是仅次于白内障的第二大致盲眼病,并且以每年增加150～200万病例的速度递增。角膜移植是目前治疗角膜盲的唯一有效方法,在积极捐献角膜、改进手术方式充分利用供体角膜、提高手术成功率的同时,也要积极寻求更好的角膜替代品缓解角膜移植供体的紧张状况,减轻移植后的排斥反应。理想的人造角膜材料应具有长时间较好的透光性，生物相容性，低免疫性，适度的生物降解性，以及一定的强伸度。

丝素膜是通过物理或化学的方法将蚕丝去除丝胶，再用交联剂制备而成。丝素膜具有优良的透氧透气性能，低的免疫原性以及可降解性。从生物体整体、细胞和基因3个水平的研究表明，再生丝素膜安全可靠，具有良好的生物相容性（[J]中国生物医学工程学报．2005。24：279—280）。因此，丝素蛋白是较理想的制造人造角膜材料的原料。

由于蚕丝是纤维状材料，为了制备膜状材料，一般的做法是脱胶后将丝素蛋白做成水溶液，再采用不同的方法制备丝素蛋白膜。在此过程中，必须要解决丝素蛋白膜的水溶性以及成膜后丝素膜长时间透明性的问题。中国发明专利“一种不溶性丝素蛋白膜的制备方法” （CN101234213）中，采用加入酞酸丁酯和乙醇形成纳米二氧化钛来制备水不溶性丝素蛋白膜，一方面酞酸丁酯和乙醇的加入可能影响生物相容性，另一方面纳米二氧化钛可能影响丝素蛋白膜的透光性能。中国发明专利“一种难溶于水的透明丝素蛋白膜及其制备方法”（CN 101967282A）中，采用加入多元醇与丝素发生交联，一方面多元醇的加入降低了共混膜的强力，另一方面，多元醇丝素膜长时间透光率并没有给出。中国发明专利“再生丝素蛋白膜及其制备方法” （CN101760027A）中，采用加入乙醇以及拉伸的方法制备不溶性丝素膜，一方面乙醇的加入将影响生物相容性，另一方面，形成的β-折叠结构的丝素蛋白膜强度高而伸长率小，降解速度较慢。中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方法” （CN1316465）中，通过加入环氧树脂交联丝素蛋白，从而得到水不溶性丝素蛋白膜，其中环氧树脂的加入将会影响丝素蛋白的生物相容性。中国发明专利“丝素蛋白复层膜及其制备方法”（CN101530402）中，以甘油为增塑剂制备成复层膜以提高药物缓释性，其水中溶失率较大，为11.12%。

发明内容

本发明针对现有技术中丝素蛋白膜长时间下透光率下降及生物相容性方面存在的不足，提供一种生物相容性良好，能有效保持长时间透明、柔韧，且难溶于水的丝素蛋白膜及其制备方法。

为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案是提供一种持久透明的丝素蛋白膜，以质量百分比计，其组份为5%～40%的酰胺，其余为丝素蛋白，所述酰胺的分子量小于150；在波长400nm～800nm的可见光范围内，所述丝素蛋白膜湿态下的透光率达到90%以上。

本发明技术方案还包括一种如上所述的持久透明的丝素蛋白膜的制备方法，家蚕丝经脱胶、溶解、透析，得到质量浓度为3%～5%的丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加工：

1、在丝素蛋白溶液中加入分子量小于150的酰胺，得到混合溶液；酰胺的质量浓度为混合溶液中溶质的5％～40％；

2、将混合溶液倒入模具中，在相对湿度为50%～80%，温度为30℃～55℃的环境中鼓风干燥，得到丝素蛋白/酰胺的共混膜；

3、将共混膜置于相对湿度为65%～90%的环境中静置5～48小时，脱模后得到一种持久透明的丝素蛋白膜。

本发明技术方案所述的酰胺为甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、己内酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种，或它们的任意组合。

经检测，本发明提供的丝素蛋白膜在37℃的水中浸泡两个月后，其湿态下的透光率在波长400nm～800nm的可见光范围内，能够稳定保持在90%以上，没有发白迹象。

本发明的原理是：酰胺小分子不仅具有一定的亲水性，而且分子量较小，将酰胺与丝素蛋白混合成膜后，由于酰胺的结构与丝素蛋白中酰胺键的结构相似，具有极好的相容性，所得的丝素共混膜透明性好，并且湿态的共混膜两个月后透光率仍在90%以上，酰胺的加入诱导丝素蛋白形成Silk 、SilkΠ结晶结构，从而使得共混膜具有较稳定的结构。

与现有技术相比，本发明具有以下明显优点：

1、本发明以天然丝素蛋白为原料，在制备过程中加入的酰胺类小分子，能诱导丝素蛋白由无规向Silk、SilkΠ结晶结构转变，因此，得到的丝素蛋白膜不仅具有良好的生物相容性，且难溶于水，透光性好，在可见光波长400～800nm范围内透光率大于90%，可以作为人造角膜材料得到应用。

2、本发明在制备过程中使用酰胺改变丝素膜的结晶结构，在水溶液中长时间浸泡，丝素膜的结构稳定不发生改变。该丝素蛋白共混膜适合于细胞的生长，且可在一段时间内完全生物降解，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明各实施例提供的复合丝素蛋白膜样品的 X-衍射曲线图；

图2是本发明实施例一提供的复合丝素蛋白膜样品浸泡两个月后在不同波长下的透光率检测结果图；

图3是本发明实施例一和二提供的复合丝素蛋白膜样品的细胞增殖活性(荧光值)检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。

实施例一

本实施例提供的长时间透明丝素蛋白膜制备步骤如下：

1、①将80g生丝放入4升质量浓度为0.075％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理30min，用去离子水洗净。②再将丝素置于浓度为0.05%的碳酸钠水溶液中于98～100℃处理30min,取出洗净。③重复②一次，充分洗涤后得到纯丝素（即丝素蛋白）。将晾干后的纯丝素，用1升浓度为9.0摩尔/升的溴化锂溶液，在60℃下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。

2、用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯丝素蛋白溶液，丝素蛋白的质量浓度约为5 wt.%。

3、在纯丝素蛋白溶液中加入分子量小于150的甲酰胺，甲酰胺的加入量与丝素蛋白的质量比例为10:90。

4、将丝素蛋白混合溶液注入模具中，在25℃,65%湿度条件干燥，得到丝素蛋白共混膜。将上述共混膜置于相对湿度为80%的环境中静置6小时，去除模具后，得到丝素蛋白膜，制备测试用样品若干。

5、将丝素蛋白膜样品剪成粉末状用于测试。使用全自动X’PERT PRO MPD射线衍射仪测定X-衍射曲线，测试条件：CuKα射线，在管电压40Kv，管电流35mA，扫描速度10（°）/min，结果参见附图1。

6、取丝素蛋白膜样品裁剪成合适尺寸置于24孔板中，用生理盐水浸泡，每隔两天换液，每七天用酶标仪检测丝素蛋白膜在492nm，550nm，700nm处的吸光度值(A)，根据公式: T = 1 /10^A ×100%计算其透光率。不同波长下均各检测4个孔，分别计算后取平均值，结果参见附图2。

7、取丝素蛋白膜样品置于96孔板中，用去离子水浸泡三天，每隔两小时换液，三天后用 γ 射线辐照辐照灭菌，密封保存，备用。取冻存L929成纤维细胞复苏，在 37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，种植于96孔板中的复合丝素膜上，观察细胞生长状态，于种植后 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，在每孔中加20μL 树脂天青溶液，于37℃、5％CO₂培养箱中孵化 6h 后，在酶标仪测定每孔的荧光值（FLU值，激发波长 530nm，发射波长 590nm），结果参见附图3。

8、取丝素蛋白膜样品，试样按照GB/T1040-2006标准工字3型刀具压出样条。使用Instrong 3365万能材料试验仪测定拉伸机械性能，夹距为28 mm，拉伸速度为20 mm/min。试验环境：温度25 ℃，RH 65%，每组试样重复6次，取平均值。本实施例制备的透明丝素蛋白膜的主要性能指标如表一所示。

表一

实施例二

2、用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯丝素蛋白溶液，丝素蛋白的质量浓度约为5%。

3、在纯丝素蛋白溶液中加入分子量小于150的甲酰胺，甲酰胺的加入量与丝素蛋白的质量比例为30:70。

4、将丝素蛋白溶液注入模具中，在25℃,65%湿度条件吹干，得到难溶于水的透明丝素蛋白膜。

5、将上述丝素蛋白膜样品剪成粉末状如实施例一进行X衍射结构测试，结果参见附图1。

6、取上述丝素蛋白膜如实施例一进行细胞培养检测细胞相容性，结果参见附图3。

7、取该丝素蛋白膜按实施例一所述要求测试膜的力学性能。本实施例制备的透明丝素蛋白膜的主要性能指标如表二所示。

表二

实施例三

1、如实施例一所述的方法制备5wt.%的丝素蛋白溶液，将分子量小于150的乙酰胺与丝素混合，乙酰胺的加入量与丝素蛋白的质量比例为20:80。

2、将上述丝素蛋白膜样品剪成粉末状用于测试。使用全自动X’PERT PRO MPD射线衍射仪，测试条件：CuKα射线，在管电压40Kv，管电流35mA，扫描速度10（°）/min，其结果参见附图1。

3、取该丝素蛋白膜，试样按照GB/T1040-2006标准工字3型刀具压出样条。使用Instrong 3365万能材料试验仪测定拉伸机械性能，夹距为28 mm，拉伸速度为20 mm/min。试验环境：温度25 ℃，RH 65%，每组试样重复6次，取平均值。本实施例制备的透明丝素蛋白膜的主要性能指标如表三所示。

表三

实施例四

1、将80g生丝放入4升质量浓度为0.05％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使生丝脱胶，充分洗涤后得到纯丝素（即丝素蛋白）。将晾干后的纯丝素，用1升浓度为9.0摩尔/升的溴化锂溶液，在60℃下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。

2、用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯丝素蛋白溶液，丝素蛋白的质量浓度约为5wt.%。

3、在纯丝素蛋白溶液中加入分子量小于150的丙酰胺，丙酰胺的加入量与丝素蛋白的质量比例为25:85。

5、将上述丝素蛋白膜样品如实施例一进行X衍射结构测试，结果参见附图1。

6、取该丝素蛋白膜按实施例一所述要求测试膜的力学性能。本实施例制备的透明丝素蛋白膜的主要性能指标如表四所示。

表四

参见附图1，它是本发明实施例1～4提供的复合丝素蛋白膜的 X-衍射曲线图；图中，曲线A为实施例一样品的 X-衍射结构图，曲线B为实施例二样品的 X-衍射结构图，曲线C为实施例四样品的 X-衍射结构图，曲线D为实施例三样品的 X-衍射结构图。从图1中可以看出，酰胺诱导丝素蛋白形成了Silk、SilkΠ结晶结构。

参见附图2，它是本发明实施例一提供的复合丝素蛋白膜浸泡两个月后的透光率检测结果图；图中，曲线A、B和C分别为样品在492nm、550nm和700nm处的透光率；从图2中可以看出，酰胺丝素蛋白复合膜经过10周浸泡后，透光率仍然大于90%，保持良好的透明性。

参见附图3，它是本发明实施例一和二提供的复合丝素蛋白膜样品的细胞增殖活性(荧光值)检测结果图；图中，A 和B分别为实施例一和二提供的样品在不同天数时的细胞荧光值；从图3中可以看出，细胞在复合膜上呈对数增长，复合膜的细胞相容性良好。

Claims

1.一种持久透明的丝素蛋白膜，其特征在于：以质量百分比计，其组份为5%～40%的酰胺，其余为丝素蛋白，所述酰胺的分子量小于150；在波长400nm～800nm的可见光范围内，所述丝素蛋白膜湿态下的透光率达到90%以上；所述的酰胺为甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、己内酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种，或它们的任意组合。

2.一种如权利要求1所述的持久透明的丝素蛋白膜的制备方法，家蚕丝经脱胶、溶解、透析，得到质量浓度为3%～5%的丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工：

（1）在丝素蛋白溶液中加入分子量小于150的酰胺，得到混合溶液；酰胺的质量浓度为混合溶液中溶质的5％～40％；所述的酰胺为甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、己内酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种，或它们的任意组合；

（2）将混合溶液倒入模具中，在相对湿度为50%～80%，温度为30℃～55℃的环境中鼓风干燥，得到丝素蛋白/酰胺的共混膜；

（3）将共混膜置于相对湿度为65%～90%的环境中静置5～48小时，脱模后得到一种持久透明的丝素蛋白膜。