CN106421902B - 一种快速凝胶化丝素蛋白溶液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高分子生物医用材料技术领域,具体涉及一种快速凝胶化丝素蛋白溶液及其制备方法,将丝素蛋白溶液质量浓度调整为0.1‑10%,在不高于0℃下进行冷冻处理2‑48h,得到冷冻体,然后将冷冻的冷冻体解冻,获得具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液。本发明的制备方法简单,通过低温条件诱导丝素蛋白的结构转变得到具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液,制备过程温和,制备条件绿色可控;得到的这种丝素蛋白溶液无需使用化学试剂、高温、剧烈的机械作用等条件即可快速形成凝胶,因此具有良好的生物相容性,可用于制备装载生物活性因子和细胞的水凝胶材料,对促进丝素蛋白作为生物医用水凝胶的应用发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及高分子生物医用材料技术领域,具体涉及一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液及其制备方法。
背景技术
组织工程是解决组织器官损伤的修复和重建潜在的有效途径。用于组织修复的支架材料是组织工程和再生医学的核心内容之一。水凝胶是组织工程和再生医学领域的研究热点之一。高分子水凝胶聚合物网络中充斥大量的水,使得支架材料具备流体的性质,这与机体组织微环境的液体极其相似。同时,水凝胶柔软、润湿的特征大大减少了材料对周围组织的刺激性,提高了材料的组织相容性以及与损伤部位的吻合性,在组织工程和药物释放领域具有广泛和现实的应用前景。
蚕丝丝素蛋白是由蚕绢丝腺的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质,具有良好的生物相容性。丝素蛋白由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等二十种氨基酸组成,可被生物降解且最终降解产物为多肽和游离氨基酸,容易被机体代谢。因此,丝素蛋白是一种较为理想的制备生物医用材料的高分子原料。
丝素蛋白溶液可以形成丝素蛋白水凝胶。在常温静置下,丝素蛋白溶液会逐渐向凝胶化转变,但是其转变转变时间长。在无外界因素的促进作用时,根据储存温度的不同,丝素蛋白的凝胶化过程需要数周到数月,即使在温度达到接近体内环境温度37℃时,其凝胶时间也需要一周以上。丝素蛋白溶液凝胶化时间太长制约了丝素蛋白水凝胶的应用。
增加丝素蛋白溶液的浓度可以在一定程度上加速丝素蛋白的凝胶速度(Biomacromolecules, 2004, 5(3): 786-792),但浓度的增加必然降低凝胶的含水率和孔隙率,从而限制了凝胶的使用。通过增加外加因素的诱导可以加速丝素蛋白的凝胶化。将丝素蛋白溶液的pH值调节至丝素蛋白的等电点时(pH=4左右),可以加快丝素蛋白的凝胶化,但其凝胶时间也需要8天左右(浙江工程学报,1999,16(3): 172-176)。添加表面活性剂、有机醇等化学试剂也能够加速丝素蛋白的凝胶化速度。中国发明专利(CN102220017)公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法,采用添加表面活性剂可以诱导丝素蛋白快速凝胶。中国发明专利(CN103289107)公开了一种丝素蛋白可注射水凝胶的制备方法,将有机醇和丝素蛋白溶液混合可以在短时间内形成凝胶。但是,pH的降低和化学物质使用将降低凝胶的生物相容性,而且不利于蛋白类生物活性物质和细胞的加载。此外,中国发明专利(CN101502670)公开了一种超声波诱导的方法制备丝素蛋白水凝胶,采用超声波震荡的方法,可以诱导丝素蛋白溶液在短时间内形成凝胶,但是难以做到可注射和体内成型,而且超声波的局部剧烈作用会导致丝素蛋白分子的降解(Macromolecular Materials andEngineering, 2013, 298(11): 1201-1208),从而破坏丝素蛋白水凝胶的物理、化学和生物学性能。
鉴于以上缺陷,本发明人通过积极研究并加以创新,设计了一种通过冷冻诱导丝素蛋白快速凝胶化的方法,促进丝素蛋白作为生物医用水凝胶的发展,使其更具有产业化上的利用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种绿色、温和的方法加速丝素蛋白凝胶化,促进丝素蛋白作为生物医用水凝胶的发展。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.取纯化的丝素蛋白溶液,将其质量浓度调整为0.1-10%;
S2.将纯化的丝素蛋白溶液在不高于0℃下进行冷冻处理,得到冷冻体;
S3.将冷冻体在0℃~37 ℃下解冻,得到解冻的丝素蛋白溶液;
S4.将解冻的丝素蛋白溶液离心去除不溶物,得到具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液。
进一步地,所述步骤S2冷冻处理是在-10~0℃下进行。
进一步地,所述冷冻处理的时间为2-48h。
进一步地,所述冷冻体为凝固态,其中丝素蛋白处于浓缩状态。
进一步地,所述步骤S4中离心是以转速10000-20000r/min离心2-10min。
进一步地,所述丝素蛋白为家蚕丝素蛋白。
一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液,由上述方法制备而成。
一种快速凝胶化的丝素蛋白水凝胶,由上述快速凝胶化的丝素蛋白溶液制成。
本发明的有益效果是:本发明利用简单的冷冻方法诱导丝素蛋白结构转变形成快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液,制备过程温和,制备条件绿色可控,避免了化学试剂、高温和剧烈的机械作用等条件的使用,不会引起丝素蛋白生物相容性的降低和分子的降解;本发明的丝素蛋白溶液无需添加任何化学试剂即可快速形成水凝胶,因此具有良好的生物相容性,可用于装载生物活性因子和活细胞,对促进丝素蛋白作为生物医用水凝胶的应用发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1制备过程中丝素蛋白的凝胶动力学曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
将100g家蚕生丝浸渍入5 L的0.05%NaCO3溶液中,于98-100℃下煮沸处理30 min,重复3次,使蚕丝脱胶,充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维;将丝素纤维加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中,在60℃下搅拌溶解1 h得到丝素蛋白混合溶液;将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到2%,在-7℃下冷冻24h成丝素蛋白冷冻固体;
将丝素蛋白冷冻固体在室温25℃下融化,获得解冻的丝素蛋白溶液;
解冻的丝素蛋白溶液以10000 r/min离心5 min,去除冻干过程形成的少量不溶物,获得具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液;
将实施例1制备过程中得到的丝素蛋白溶液用酶标仪在37℃下检测波长550 nm处吸光度随时间的变化,表征丝素溶液的凝胶化过程,检测结果如图1所示。
实施例2
将脱胶的丝素纤维加入到摩尔比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中,在72℃下搅拌溶解1 h得到丝素蛋白混合溶液;将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到3%,析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到3%,在-4℃下冷冻20 h成丝素蛋白冷冻固体;
将丝素蛋白冷冻固体在37℃下融化,获得解冻的丝素蛋白溶液;
解冻的丝素蛋白溶液以20000 r/min离心3 min,去除冻干过程形成的少量不溶物,获得具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液;
将上述丝素蛋白溶液置于37℃下静置,获得由具有快速凝胶化特这的丝素蛋白溶液制成的水凝胶。
实施例3
将脱胶的丝素纤维加入到熔融的Ca(NO3)2溶液中,在90℃下搅拌溶解2 h得到丝素蛋白混合溶液;将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到2%,在-7℃下冷冻24h成丝素蛋白冷冻固体;
将丝素蛋白冷冻固体在0℃下融化,获得解冻的丝素蛋白溶液;
解冻的丝素蛋白溶液以10000 r/min离心5 min,去除冻干过程形成的少量不溶物,获得具快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液。
实施例4
将100g家蚕生丝浸渍入5 L的0.05%NaCO3溶液中,于98-100℃下煮沸处理30 min,重复3次,使蚕丝脱胶,充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维;将丝素纤维加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中,在60℃下搅拌溶解1 h得到丝素蛋白混合溶液;将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到10%,在-10℃下冷冻2h成丝素蛋白冷冻固体;
将丝素蛋白冷冻固体在20℃下融化,获得解冻的丝素蛋白溶液;
解冻的丝素蛋白溶液以10000 r/min离心2 min,去除冻干过程形成的少量不溶物,获得具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液。
实施例5
将100g家蚕生丝浸渍入5 L的0.05%NaCO3溶液中,于98-100℃下煮沸处理30 min,循环重复进行浸渍、煮沸处理3次,使蚕丝脱胶,充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维;将丝素纤维加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中,在60℃下搅拌溶解1 h得到丝素蛋白混合溶液;将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中,用去离子水透析3天,得到纯化的丝素蛋白溶液;
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到0.1%,在0℃下冷冻48h成丝素蛋白冷冻固体;
将丝素蛋白冷冻固体在25℃下融化,获得解冻的丝素蛋白溶液;
解冻的丝素蛋白溶液以15000 r/min离心10 min,去除冻干过程形成的少量不溶物,获得具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.取纯化的丝素蛋白溶液,将其质量浓度调整为0.1-10%;
S2.将纯化的丝素蛋白溶液在不高于0 ℃下进行冷冻处理,得到冷冻体;
S3.将冷冻体在0℃~37 ℃下解冻,得到解冻的丝素蛋白溶液;
S4.将解冻的丝素蛋白溶液离心去除不溶物,得到具有快速凝胶化特征的丝素蛋白溶液;
所述步骤S2冷冻处理是在-7~0℃下进行;
所述冷冻处理的时间为20-48h。
2.根据权利要求1所述的一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液的制备方法,其特征在于,所述冷冻体为凝固态,其中丝素蛋白处于浓缩状态。
3.根据权利要求1所述的一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中离心是以转速10000-20000r/min离心2-10min。
4.一种快速凝胶化的丝素蛋白溶液,其特征在于,由权利要求1-3任意一项所述方法制备而成。
5.一种快速凝胶化的丝素蛋白水凝胶,其特征在于,由权利要求4所述快速凝胶化的丝素蛋白溶液制成。
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