CN113069593A - 预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水凝胶技术领域，提出了预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，包括以下步骤：S1、制备浓缩UC‑MSCs的分泌蛋白组干粉；S2、制备丝素蛋白纳米纤维水凝胶；S3、将所述浓缩MSCs的分泌蛋白组干粉与所述丝素蛋白纳米水凝胶进行混合即得预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶。通过上述技术方案，解决了现有技术中干细胞的分泌蛋白组中蛋白降解快、稳定性差、对创面的修复效果不佳的问题。

Description

预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺
技术领域
本发明涉及水凝胶技术领域，具体的，涉及预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是分布广泛的成体干细胞。目前，已在骨、软骨、肌肉、脂肪、肝脏、胰腺、胎盘、脐带及羊膜组织中均发现MSCs的存在。MSCs具有低免疫原性，使其成为组织修复领域的明星细胞。其中脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)除具备一般MSCs的特性外，还具有较为年轻，来源方便，取材不涉及伦理等优点被研究者们广泛研究。
MSCs主要通过旁分泌效应来发挥作用。MSCs的条件培养基能够活化慢性创面失能的修复细胞(角质细胞、成纤维细胞)，改善创面炎症微环境。目前MSCs主要通过以下几个方面来调节慢性创面微环境，达到促进创面愈合的目的：
①MSCs通过免疫调节，修复了伤口的微环境。慢性炎症时影响创面愈合的最主要的障碍，MSCs的分泌效应从多方面影响创面的免疫反应，较弱了创面的炎症。MSCs分泌的可溶性因子IL10、TGF-等，通过抑制T细胞、巨噬细胞、NK细胞等增殖，抑制炎症。另外，干细胞还具有一定的抗菌的活性，MSCs分泌抗菌因子如LL-37等促进了吞噬细胞对细菌的吞噬作用；
②MSCs激活了创面的新生血管的生成。创面的炎症等微环境使得创面的血管内皮细胞的增生失能，血管的生成受到影响。而干细胞在抑制炎症的同时，受创面局部缺血、缺氧等微环境的诱导，反馈分泌促血管生成因子如VEGF、FGF、IL-8等分泌增多，同时分泌抗凋亡因子BCL-2等，促进内皮细胞的增殖、迁移，从而促进血管的新生；
③MSCs明显减少瘢痕的形成。造成创面瘢痕出现的原因主要是创面成纤维细胞过度增殖而产生过量的ECM。干细胞的分泌效应分泌的IL-10、HGF等，在抑制炎症的同时，还可以下调IL-6、IL-8、TGF-β等，抑制成纤维细胞过度增殖与产生过多的胶原蛋白。因此，MSCs条件培养能够改善慢性创面的严重，修复细胞失能的状态，调节细胞外基质分泌，修正创面微环境，从而促进慢性创面愈合。因此，利用MSCs分泌活性蛋白是组织修复的重要策略。
目前，大量针对MSCs分泌功能的研究主要是利用其条件培养基，其中富含MSCs的分泌蛋白组，前期也由我们通过蛋白芯片的技术证实。MSCs来源条件培养基能够达到直接使用干细胞相当的治疗效应。但是这些分泌蛋白组直接应用于损伤部位会被创面局部酶类迅速降解，这也是MSCs的分泌蛋白组临床应用上一直难以解决的技术难题。
发明内容
本发明提出预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，解决了现有技术中条件培养基中的分泌蛋白组降解快、稳定性差、对创面的修复效果不佳的问题。
本发明的技术方案如下：
一种浓缩UC-MSCs来源分泌蛋白组干粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、UC-MSCs待细胞生长到70％～80％融合，在无血清DMEM培养基中孵育；
S2、收集培养上清，离心去除死细胞；
S3、再次离心，去除细胞碎片；
S4、将S3所得上清液浓缩、透析，制成浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基；
S5、将S4所得浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基预冷冻干，添加甘露醇，分装进行冷冻干燥，制成浓缩UC-MSCs的分泌蛋白组干粉。
作为进一步的技术方案，所述步骤S4中，所述浓缩为浓缩16～24倍。
作为进一步的技术方案，所述步骤S5中，所述甘露醇的添加量为培养基质量的1％～5％。
作为进一步的技术方案，所述步骤S2～S5控制温度0～10℃。
本发明还提出一种预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，包括以下步骤：
B1、按照所述的浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉的制备方法制备浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉；
B2、制备丝素蛋白纳米纤维水凝胶；
B3、将所述浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉与所述丝素蛋白纳米水凝胶进行混合即得预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶。
作为进一步的技术方案，所述步骤B2包括以下步骤：
B21、丝素蛋白制备成质量浓度为5％～6％在55～60℃下静置；
B22、丝素蛋白溶液浓缩至质量浓度为18％～22％形成亚稳态纳米颗粒，用去离子水稀释；
B23、将稀释的丝素蛋白溶液在在55～60℃下再次静置；
B24、重复步骤B22和B23三次，得到丝素蛋白纳米纤维。
作为进一步的技术方案，所述步骤B3中，所述浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉与所述丝素蛋白纳米水凝胶的质量体积比为1mg：(1～1.2ml)。
本发明还提出一种负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的制作工艺，包括以下步骤：
C1、UC-MSCs待细胞生长到70％～80％融合，在无血清DMEM培养基中孵育；
C2、收集培养上清，离心去除死细胞；
C3、再次离心，去除细胞碎片；
C4、将C3所得上清液浓缩10～12倍、透析，制成浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基；
C5、按照所述的预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺制备丝素蛋白纳米纤维；
C6、将C4所得的浓缩的干细胞分泌蛋白组条件培养基与C5所得的纳米纤维水凝胶进行充分混合；
C7、将混合物直接分装到培养板中以制作海绵敷料，分装到不同孔板后立刻放到-80±2℃的低温中冷冻；
C8、冷冻6～8h后进行冻干，即形成负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维海绵敷料。
作为进一步的技术方案，所述步骤C6混合时，C4所得的浓缩的干细胞分泌蛋白组的条件培养基与C5所得的纳米纤维水凝胶按照(200～250μl)：(1～1.5ml)的比例进行充分混合。
根据所述的负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的制作工艺制备的海绵敷料在创面修复中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明是干细胞相关的分泌蛋白组进行临床转化方面使用上的新方法。本发明中将富含干细胞分泌蛋白组的条件培养基制备成为干粉有利于其用于药物途径，并为了防止蛋白在体内的迅速降解，在使用时将干粉进一步溶解并负载到丝素蛋白纳米纤维中即保证干粉中细胞因子的持续性释放，又能够保护蛋白。而丝素蛋白具有细胞外基质的仿生特性，为损伤局部提供可供细胞迁移的支架成分。二者联合后形成的这种预混氏干细胞分泌蛋白组丝素蛋白纳米水凝胶将放大彼此的修复效应，起到相辅相成的作用。
2、丝素蛋白与其他基质材料相比，具有生物相容性好、免疫原性低、吸水率高、力学性能可调等优点，并且丝素蛋白具有与细胞外基质相似的仿生结构。间充质干细胞条件培养基富含多种生物活性物质，利用丝素蛋白特异性输送分泌蛋白能够起到保护蛋白，并持续性缓释来修复受损组织的目的。
3、由于蛋白在室温的不稳定性，本发明先将干细胞条件培养基中的分泌蛋白组在低温冷冻的条件下形成干粉进行储存。丝素蛋白制作水凝胶基质载体以待使用。在用于损伤部位之前，将干细胞分泌蛋白组干粉与丝素蛋白水凝胶进行预混合后进行使用。干细胞分泌蛋白组干粉发挥修复受损组织的生物学功能。丝素蛋白水凝胶一方面维持损伤局部的湿性微环境，另一方面提供基质支架以供细胞迁移，二者结合形成的水凝胶能够发挥更好的生物学功能。
4、创面中如果直接应用条件培养基，损伤微环境中的各种酶将迅速的将条件培养基中的活性蛋白降解，为了更好的利用条件培养基中的干细胞分泌蛋白组成分，本发明将其负载到蚕丝蛋白的纳米纤维中，该纳米纤维能够包裹活性蛋白，并且实现持续性的释放。另外，负载MSCs分泌蛋白组蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶冻干后形成海绵敷料，干燥情况下可以长期保留MSCs分泌蛋白组活性。此外，该海绵敷料可以吸收创面渗液，发生溶解后又能够释放多种MSC来源细胞因子，以期促进创面修复。
5、本发明将富含MSCs分泌蛋白组的条件培养基制备的生物粉末负载到蚕丝蛋白纳米纤维中，并进一步冷冻干燥处理形成海绵状敷料，一方面该海绵敷料具有较强的吸收功能，另一方面吸收创液后，海绵敷料溶解持续释放多种MSCs来源细胞因子，以期促进创面修复。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为预混氏胞分泌蛋白丝素蛋白纳米水凝胶制备流程；
图2为实施例1中浓缩前后的间充质干细胞来源条件培养基进行蛋白芯片检测；
图3为实施例1中干细胞条件培养基浓缩20倍后细胞因子的含量；
图4为实施例1中丝素蛋白纤维和负载干细胞分泌蛋白组干粉的丝素蛋白纤维的原子力显微镜测试结果；
图5为实施例1预混氏干细胞分泌蛋白丝素蛋白纳米水凝胶孵育成纤维细胞及内皮细胞；
图6为实施例2丝素蛋白纳米纤维水凝胶混合10倍浓缩MSCs条件培养基后的红外光谱结果；
图7为实施例2丝素蛋白纳米纤维水凝胶混合10倍浓缩MSCs条件培养基后温度粘度曲线；
图8为实施例2负载干细胞分泌蛋白的丝素蛋白海绵敷料的细胞因子释放情况；
图9为实施例2负载干细胞分泌蛋白的丝素蛋白海绵敷料释放分泌蛋白对皮肤成纤维细胞(HDF)和内皮细胞(HUVECs)增殖的影响；
图10为实施例2负载干细胞分泌蛋白的丝素蛋白海绵敷料释放分泌蛋白对皮肤成纤维细胞(HDF)和内皮细胞(HUVECs)迁移的影响；
图11为实施例1预混氏干细胞分泌蛋白丝素蛋白纳米水凝胶和实施例2负载干细胞分泌蛋白的丝素蛋白海绵敷料促进创面愈合的情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
1.浓缩富含MSCs分泌蛋白组的条件培养基的制备
1.1UC-MSCs培养至4代之前，待细胞生长到70～80％融合，更换培养基为无血清DMEM培养基继续培养72h；
1.2后将培养上清尽数收集后，500g/5min离心去除死细胞；
1.3再2000g/10min离心，去除细胞碎片；
1.4收集处理后的培养上清，使用浓缩仪浓缩20倍，并进一步透析去除盐离子；
1.5离心及浓缩步骤须在低温情况下(0～10℃)进行，并且保证整个过程迅速完成；
1.6预冷冻干机后，将浓缩条件培养基中添加1％质量浓度甘露醇分装于5mlEP管中，进行冷冻干燥，制成富含干细胞分泌蛋白组的条件培养基干粉；
2.丝素蛋白纳米纤维水凝胶的制作
2.1丝素蛋白制备成浓度为6％(wt)并在60℃环境下静置24h；
2.2等待丝素蛋白溶液缓慢浓缩至约20％(wt)形成亚稳态纳米颗粒，然后用去离子水稀释至1％(wt)；
2.3将稀释的丝素蛋白溶液在60℃恒温环境下再次静置24h；
2.4重复步骤2.2和2.3三次后，便可以得到浓度较高的丝素蛋白纳米纤维，该纳米纤维灭菌后可在室温中长期保存；
3.预混氏干细胞分泌蛋白组丝素蛋白纳米水凝胶的制备
干细胞条件培养基制备的分泌蛋白组粉末1mg与丝素蛋白纳米纤维水凝胶1ml的比例进行充分混合，后可直接使用在损伤部位。
图2为将浓缩前后的间充质干细胞来源条件培养基进行蛋白芯片检测，表1为部分蛋白芯片结果，从表1可以看出，浓缩后的条件培养基的蛋白含量较对照组显著，证实条件培养基的浓缩成功。
表1浓缩前后的间充质干细胞来源条件培养基部分蛋白芯片结果
Figure BDA0003014788030000051
Figure BDA0003014788030000061
图3为实施例1中干细胞条件培养基浓缩20倍后代表性细胞因子的含量，将干细胞条件培养基浓缩20倍后，各个细胞因子的含量比原始为浓缩之前提高了19～20倍，能够将干细胞培养基的生物学修复性能集中强化。
图4为实施例1中丝素蛋白纤维和负载干细胞分泌蛋白组干粉的丝素蛋白纤维的原子力显微镜测试结果，丝素蛋白纳米纤维直径为10～20nm、长度约为1～2μm，负载干细胞条件培养基的分泌蛋白组干粉后，纳米纤维上出现了许多颗粒，出现较强的荧光信号团块，表明加载成功。
图5为实施例1预混氏干细胞分泌蛋白组丝素蛋白纳米水凝胶孵育成纤维细胞及内皮细胞。可以发现，本发明实施例制备的水凝胶可以促进细胞的迁移，与没有经过丝素蛋白纳米纤维的培养基相比和单独的水凝胶的修复情况相比，对细胞迁移的促进效果大幅提高，说明丝素蛋白水凝胶与浓缩的MSCs分泌蛋白组粉末二者结合形成的水凝胶能够发挥更好的生物学功能，二者联合后形成的这种预混氏干细胞分泌蛋白组丝素蛋白纳米水凝胶将放大彼此的修复效应，可以加速了皮肤修复，起到相辅相成的作用。
实施例2
1.浓缩的富含MSCs分泌蛋白组的条件培养基制备
1.1UC-MSCs培养至70～80％融合，并在无血清DMEM中孵育72h；
1.2收集新鲜的条件培养液，500g/5min离心去除死细胞；
1.3进一步2000g/10min离心，去除细胞碎片；
1.4收集上清，利用浓缩仪进行浓缩10倍；
2.蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶的制作
2.1将浓度为6％(wt)的蚕丝蛋白溶液放置在60℃环境下静置24h；
2.2等待蚕丝蛋白溶液缓慢浓缩至约20％(wt)以形成亚稳态纳米颗粒，然后用去离子水稀释至低于1％(wt)；
2.3将稀释的蚕丝蛋白溶液在60℃恒温环境下静置约24h；
2.4重复步骤1.2和1.3三次后，便可以得到浓度较高的蚕丝蛋白纳米纤维，置于4℃保存；
3.负载干细胞分泌蛋白的蚕丝蛋白纳米纤维海绵敷料的制备
3.1将10倍浓缩的富含干细胞分泌蛋白组的条件培养基与蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶按照每200ul：1ml的比例进行充分混合；
3.2将混合物直接分装到培养板中，以制作海绵敷料；
3.3分装到不同孔板后立刻放到负80℃低温冰箱中冷冻；
3.4六小时后，使用冻干机进行冻干，即形成负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维海绵敷料；
图6的红外光谱检测结果显示，蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶在混合10倍浓缩MSCs条件培养基后，特异性峰值均发生偏移。
图7中各组间温度变化无显著差异，这些粘度值表明蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶和与浓缩MSCs条件培养基混合后未改变性状，可注射使用。
图8为实施例2负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的细胞因子释放情况。冻干后负载MSCs分泌蛋白蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶呈现海绵样，加入水后迅速溶解，能够同时持续性释放多种分泌蛋白。
图9为负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料释放分泌蛋白对皮肤成纤维细胞(HDF)和内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。所示数据用代表平均值±SD。*，#表示P<0.05；**，##P<0.01。本实施例的海绵敷料与最初浓缩MSCs来源条件培养基相比，可以显著促进纤维细胞(HDF)和内皮细胞(HUVECs)增殖。
图10为实施例2负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料释放分泌蛋白对皮肤成纤维细胞(HDF)和内皮细胞(HUVECs)迁移的影响。所示数据用代表平均值±SD。*表示P<0.05；**P<0.01。本实施例中的海绵敷料与单独使用浓缩MSCs来源条件培养基相比，24h和48h对内皮细胞的迁移都有显著提高，对于皮肤成纤维细胞，海绵敷料24h对促进皮肤成纤维细胞的迁移显著促进，但是48h效果相差不多。
图11为负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶和海绵敷料促进创面愈合的情况。本实施例的负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料和负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶比对照组(单纯水凝胶组)对于创面的愈合速度和修复情况都显著提高，说明不管是负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料，还是负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维水凝胶均可以通过创面释放多种MSCs分泌蛋白的方式，促进创面修复。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种浓缩UC-MSCs来源分泌蛋白组干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、UC-MSCs待细胞生长到70％～80％融合，在无血清DMEM培养基中孵育；
S2、收集培养上清，离心去除死细胞；
S3、再次离心，去除细胞碎片；
S4、将S3所得上清液浓缩、透析，制成浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基；
S5、将S4所得浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基预冷冻干，添加甘露醇，分装进行冷冻干燥，制成浓缩UC-MSCs的分泌蛋白组干粉。
2.根据权利要求1所述的浓缩UC-MSCs的分泌蛋白组干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述浓缩为浓缩16～24倍。
3.根据权利要求1所述的浓缩UC-MSCs的分泌蛋白组干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述甘露醇的添加量为培养基质量的1％～5％。
4.根据权利要求1所述的浓缩UC-MSCs的分泌蛋白组干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S2～S5控制温度0～10℃。
5.一种预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：
B1、按照权利要求1～4任意一项所述的浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉的制备方法制备浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉；
B2、制备丝素蛋白纳米纤维水凝胶；
B3、将所述浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉与所述丝素蛋白纳米水凝胶进行混合即得预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶。
6.根据权利要求5所述的预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，其特征在于，所述步骤B2包括以下步骤：
B21、丝素蛋白制备成质量浓度为5％～6％在55～60℃下静置；
B22、丝素蛋白溶液浓缩至质量浓度为18％～22％形成亚稳态纳米颗粒，用去离子水稀释；
B23、将稀释的丝素蛋白溶液在在55～60℃下再次静置；
B24、重复步骤B22和B23三次，得到丝素蛋白纳米纤维。
7.根据权利要求5所述的预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺，其特征在于，所述步骤B3中，所述浓缩的UC-MSCs分泌蛋白组干粉与所述丝素蛋白纳米水凝胶的质量体积比为1mg：(1～1.2ml)。
8.一种负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：
C1、UC-MSCs待细胞生长到70％～80％融合，在无血清DMEM培养基中孵育；
C2、收集培养上清，离心去除死细胞；
C3、再次离心，去除细胞碎片；
C4、将C3所得上清液浓缩10～12倍、透析，制成浓缩的富含UC-MSCs分泌蛋白组的条件培养基；
C5、按照权利要求6所述的预混氏干细胞分泌蛋白组丝素水凝胶的制作工艺制备丝素蛋白纳米纤维；
C6、将C4所得的浓缩的干细胞分泌蛋白组条件培养基与C5所得的纳米纤维水凝胶进行充分混合；
C7、将混合物直接分装到培养板中以制作海绵敷料，分装到不同孔板后立刻放到-80±2℃的低温中冷冻；
C8、冷冻6～8h后进行冻干，即形成负载干细胞分泌蛋白组的蚕丝蛋白纳米纤维海绵敷料。
9.根据权利要求8所述的负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的制作工艺，其特征在于，所述步骤C6混合时，C4所得的浓缩的干细胞分泌蛋白组的条件培养基与C5所得的纳米纤维水凝胶按照(200～250μl)：(1～1.5ml)的比例进行充分混合。
10.根据权利要求9所述的负载干细胞分泌蛋白组的丝素蛋白海绵敷料的制作工艺制备的海绵敷料在创面修复中的应用。
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