CN104971386A - 丝蛋白支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~6。本发明通过浓缩后溶液和水凝胶混合,利用丝蛋白的自组装行为改变丝蛋白的二级结构,使得孔隙率高;选用丝蛋白溶液,生物降解性好;通过调节pH值,破坏疏水作用力;本发明的丝蛋白支架材料力学性能低,结晶度低,更适合血管的生成。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域,尤其是涉及一种丝蛋白支架材料及其制备方法。
背景技术
各种创伤、疾病等引起的组织器官的缺损、病变等是影响人类健康的一大问题。目前,临床上常采用器官移植的方法对组织器官的缺损进行治疗。组织、器官移植中供体不足、组织和器官的缺损修复和功能重建等问题,已成为生命科学领域研究亟需解决的问题。组织工程基本原理是利用三维支架材料模拟体内生理环境,对细胞进行体外培养,然后将细胞-支架材料复合物植入体内替代病变的组织器官,以达到创伤修复和功能重建的目的。
而构建具有修复大组织和复杂器官的功能性生物材料是急需解决的问题。大组织、复杂器官不像简单的薄层组织可以通过小分子扩散获得营养物质和氧气,它们需要通过庞大的血管系统才能获得营养物质和氧气。微血管系统是由单层内皮细胞组成,营养物质和氧气可通过内皮细胞扩散到组织中。修复损伤的大组织和复杂器官的生物材料必须具有促血管形成的能力才能使大组织和复杂器官具有生物功能。
现有技术的解决方案主要有两种:一种方法是以材料为基础的,现已开发应用的作为组织工程支架的生物医用材料主要分为两大类:合成生物材料与天然生物材料。硅橡胶、聚氨酯等合成材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性等方面尚有许多不足,部分降解产物有一定的毒性,不利于细胞黏附和识别,作为组织工程支架材料推广使用仍有诸多关键问题需要继续解决。而天然生物材料的机械性能不易控制,但其生物相容性优异,种类繁多,来源广泛,在组织的再生修复领域逐渐获得越来越广泛的应用。另一种方法是以细胞为基础的,体外构建支架再接种上内皮细胞,体外培养再移植入体内前诱导血管化,但这种方法需要生长因子或黏着蛋白或细胞外基质蛋白或细胞共培养,培养时间长,过程繁琐,花费较高,不能量化。
蚕丝中富含的丝蛋白以其特殊的生物学特性和良好的人体亲和性越来越受到人们的关注。丝蛋白的构象主要分为:无规结构、α-螺旋和β-折叠。而现有技术中盐析法和甲醇等有机溶剂诱导制备的丝蛋白多孔支架存在硬度 高,结晶度高,多孔支架孔壁表面结构无法调控的问题,不适用于内皮细胞的增殖及血管形成。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种丝蛋白支架材料的制备方法,本发明提供的丝蛋白支架材料的制备方法制备得到的丝蛋白支架材料生物降解性好、孔隙率高、可以起到促进血管生成的作用。
本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:
A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;
B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;
C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~4。
优选的,所述步骤A)浓缩温度为0~90℃。
优选的,所述步骤A)浓缩时间为1~168h。
优选的,所述步骤B)热处理温度为50℃~70℃。
优选的,所述步骤C)混合液中丝蛋白的质量浓度为1%~4%。
优选的,所述步骤C)调节pH值为用酸调节pH值,所述酸选自盐酸、和甲酸中的一种。
优选的,所述步骤C)搅拌时间为1~10min。
优选的,所述步骤C)冷冻温度为-10℃~-80℃,冷冻时间为1~48h,真空干燥时间为1~96h。
优选的,所述步骤C)后还包括将得到的支架材料浸泡、冷冻、干燥得到干态丝蛋白支架材料。
本发明提供了一种丝蛋白支架材料,由上述权利要求任意一项所述的制备方法制备得到。
与现有技术相比,本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:
A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;C)将步骤A)得到的 浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~4。本发明通过特定质量浓度的丝蛋白浓缩后的溶液和特定质量浓度的水凝胶混合,利用丝蛋白的自组装行为改变丝蛋白的二级结构,使得本发明孔隙率高;本发明选用丝蛋白溶液,生物降解性好;并且本发明通过调节pH值,改变丝蛋白分子带电荷情况,破坏疏水作用力,使得本发明制备得到的丝蛋白支架材料力学性能低,结晶度低,更适合血管的生成。实验结果表明,
附图说明
图1中(a)和(b)为本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图;(c)为本发明比较例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图;(d)为本发明比较例2制备得到的支架材料进行扫描电镜图;
图2为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的红外测试图;
图3为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的X-射线衍射检测图;
图4为本实施例和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定图;
图5为本实施例和比较例制备得到的支架进行酶降解处理测定图;
图6中a为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时的HE染色切片图;b为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时CD34免疫组化切片图;
图7为本发明实施例3所述所得丝蛋白支架的电镜图。
具体实施方式
本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:
A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;
B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;
C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~4。
本发明所述丝蛋白溶液为常规方法制备得到的丝蛋白溶液,优选的,所述制备方法具体为:
a)将蚕丝在碳酸钠溶液中加热脱胶、水洗、烘干得到脱胶蚕丝;
b)将所述脱胶蚕丝溶解于溶剂中热处理、透析得到丝蛋白溶液。
所述碳酸钠溶液的质量浓度优选为0.2%~0.5%;所述步骤a)加热温度为90~110℃,所述加热时间为30~60min。
所述步骤a)水洗优选为去离子水洗,所述水洗的次数优选为2~5次,更优选为3次;所述烘干的温度优选为50~100℃,更优选为60~90℃;
所述步骤b)溶剂选自由乙醇、氯化钙和水以摩尔比2:1:8的比例混合构成的三元溶液或溴化锂溶液中的一种;所述溶剂的质量浓度优选为9.3~9.5mol/L;所述步骤b)热处理温度为60~70℃,热处理时间为4~8h;所述透析袋的截留分子量优选为3000~12000;更优选为3500~10000;所述透析的时间优选为3d~4d;所述透析时可以换水,所述换水的间隔优选为1~3h;更优选为2h。最终得到的丝蛋白溶液的质量浓度优选为5%~10%,更优选为6%~8%。
本发明首先将上述丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%。本发明对于所述浓缩方式不进行限定,本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。所述浓缩后中丝蛋白的质量浓度优选为20%~30%;所述浓缩温度优选为0~90℃,更优选为30~80℃,最优选为40~70℃,最最优选为50~60℃;所述浓缩时间优选为1~168h,更优选为40~150h,最优选为48h~130h;最最优选为48h~120h.
将步骤A得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%。本发明对于所述稀释方式不进行限定,加水稀释即可;稀释后热处理得到水凝胶,所述热处理的温度优选为50℃~70℃,更优选为60℃~70℃;所述热处理时间优选为24~48h;所述稀释后质量浓度优选为0.3%~0.5%。
将上述步骤得到的浓缩后溶液和上述步骤得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~6。
本发明通过特定质量浓度的丝蛋白浓缩后的溶液和特定质量浓度的水凝胶混合,利用丝蛋白的自组装行为改变丝蛋白的二级结构,改变其支架结构, 使得本发明制备得到的支架材料与现有技术相比,成孔性更好,并且孔的内壁还具有十分明显的微细结构。
在本发明中,所述浓缩后溶液和水凝胶混合丝蛋白质量比优选为(10~15):1;所述最终得到混合液中丝蛋白的的质量浓度优选为1%~4%,更优选为2%~3%。混合后,调节混合液pH值,本发明优选用酸调节pH值,所述酸选自盐酸和甲酸中的一种;所述酸的浓度优选为1~2M。所述调节pH值为调节pH值至3~6,优选为4~6。
本发明通过调节pH值,改变丝蛋白分子带电荷情况,破坏疏水作用力,使得本发明制备得到的丝蛋白支架材料力学性能低,结晶度低,更适合血管的生成。并且在成型后将多余的酸去除,不需要添加任何其余的化学试剂,无毒副作用,生物相容性和生物降解性良好。
本发明对于所述搅拌方式不进行限定,搅拌速度优选2500-3000rmp/min,所述搅拌时间优选为1~10min,更优选为5~10min。
在本发明中,所述冷冻温度优选为-10℃~-80℃,更优选为-20℃~-70℃;最优选为-20℃~-50℃;所述冷冻时间优选为1~48h,更优选为10~40h;最优选为10~24h;本发明所述冷冻优选在模具中冷冻;
在本发明中,所述真空干燥时间优选为1~96h,更优选为12~84h,最优选为24~72h,最最优选为48~72h。
本发明还包括对上述得到的支架材料后处理,所述后处理具体为将得到的支架材料浸泡、冷冻、干燥得到干态丝蛋白支架材料。
得到的支架材料浸泡为除去剩余的酸溶液,优选为在去离子水中浸泡,所述浸泡时间优选为24~48h;
浸泡后冷冻、干燥得到干态丝蛋白支架材料,所述冷冻温度优选为-10℃~-80℃,更优选为-20℃~-70℃;最优选为-20℃~-50℃;所述冷冻时间优选为1~48h,更优选为10~40h;最优选为10~24h;本发明所述冷冻优选在模具中冷冻;
在本发明中,所述真空干燥时间优选为1~96h,更优选为12~84h,最优选为24~72h,最最优选为48~72h。
本发明通过上述参数的调节可以获得不同力学性能的支架材料,从而满足不同组织工程的需要。
本发明提供了一种丝蛋白支架材料,由上述的制备方法制备得到。
本发明优选采用以下方式对制备得到的支架材料进行压缩性能测定:
支架的压缩模量通过一个称重传感器为10N的拉力强度试验机来评估。将本发明制备得到的样品高度9mm,直径12mm。水平头速度设定为2毫米/分钟。压缩位移-6mm。每种支架做3个重复样。
本发明优选采用以下方式对制备得到的支架材料进行酶降解处理测定:
将本发明制备得到的支架材料切块,浴比1:0.1~200做酶降解处理,取0.5、2、4、8、12、24h等时间点的材料洗净干燥称重。得到降解曲线。
本发明优选采用以下方式对制备得到的支架材料进行血管的形成测定:
本发明以SD大鼠作为实验动物,由苏州大学SPF级动物实验中心提供并饲养。本发明建立简单的皮下包埋实验动物模型,在大鼠的背部做大约1厘米的切口,将灭菌后的支架经无菌PBS浸泡后植入SD大鼠背部切口内,在手术后第28天取样HE染色和抗血管的CD34免疫组化分析观察组织长入及血管形成情况。
本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~4。本发明通过特定质量浓度的丝蛋白浓缩后的溶液和特定质量浓度的水凝胶混合,利用丝蛋白的自组装行为改变丝蛋白的二级结构,改变其支架结构,使得本发明孔隙率高;本发明选用丝蛋白溶液,生物降解性好;并且本发明通过调节pH值,改变丝蛋白分子带电荷情况,破坏疏水作用力,使得本发明制备得到的丝蛋白支架材料力学性能低,结晶度低,更适合血管的生成。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的丝蛋白支架材料及其制备方法进行详细描述。
实施例1
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称 取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为28%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数稀释为0.3%再进行60℃温度处理24h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩后溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1M盐酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得干态的丝蛋白支架材料,其孔隙率高达96%以上。
对本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜测试,结果如图1所示,图1为本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图,其中图1b为图1a的放大图;从图1可知,上述支架的孔内含有大量的丝蛋白片图1a,孔壁上含有大量纳米线图1b。
对本发明实施例1制备得到的支架材料进行红外测试,如图2,图2为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的红外测试图,其中,曲线c为实施例1方法得到的支架的红外测试图;由图2可知,本实施例所述支架的二级结构主要以无规和silk Ⅰ结构为主;
对本发明实施例1制备得到的支架材料进行X-射线衍射检测,结果如图3所示,图3为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的X-射线衍射检测图,其中,c为本发明实施例1制备得到支架的红外测试图,由图2可知,本实施例1经过处理后的溶液制备支架XRD中的结晶峰强度减弱,峰宽增加,表明经浓缩处理后所制备多孔支架含有更多的非晶结构。
按照本发明所述方法对本实施例1和比较例制备得到的支架进行 压缩性能测定,结果如图4所示,图4为本实施例和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定图,其中曲线c为本实施例1曲线图,由图4中的曲线c可以计算出,本实施例制备得到的支架的压缩强度为6.15±1.59kPa。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行酶降解处理测定,结果如图5所示,图5为本实施例和比较例制备得到的支架进行酶降解处理测定图,其中曲线c为本实施例曲线图,由图5中的曲线c可以看出,本实施例1制备得到的支架的降解较快。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,结果如图6所示,图6a为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时的HE染色切片图;图6b为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时CD34免疫组化切片图。由图可见,在第28天时细胞已充满整个支架,新组织形成,形成血管网。说明本发明制备的支架材料有利于血管的形成。
比较例1
将本发明实施例1制备得到的新鲜丝素溶液与类凝胶溶液以丝素干重比15:1混合得到2wt%混合溶液,将混合溶液加入模具中冷冻干燥得到丝蛋白支架。将支架加入到80%甲醇溶液中浸泡30min,倒出甲醇溶液,用去离子水替换出支架中的甲醇,每2h换一次水,处理48h。再经冷冻干燥得到最终支架。
对本发明比较例1制备得到的支架材料进行红外测试,如图2,图2为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的红外测试图,其中,a为比较例1所述未处理丝素溶液经甲醇处理得到支架的红外测试图;
对本发明比较例1制备得到的支架材料进行X-射线衍射检测,结果如图3所示,图3为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的X-射线衍射检测图,其中,a为比较例1未处理丝素溶液经甲醇处理得到支架的红外测试图;
按照本发明所述方法对实施例1和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定,结果如图4所示,图4为本实施例和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定图,其中曲线a为比较例1曲线图,由图可以计算出,结果为23.66±3.87kPa;
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行酶降解处理测定,结果如图5所示,图5为本实施例和比较例制备得到的支架进行酶降解处理测定图,其中曲线a为比较例1降解曲线图。
对本发明比较例1制备得到的支架材料进行扫描电镜测试,结果如图1所示,图1为本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图,(c)为本发明比较例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图;由图1(c)可以看出,支架孔完整,细胞难以穿越。且其模量范围不适宜内皮细胞生长
比较例2
取孔径为250μm和350μm的分样筛,两分样筛叠加使用(孔径大的在上方)筛选氯化钠颗粒。两分样筛之间的颗粒粒径为250μm~350μm。取一个24孔板(用来代替专用的圆柱形容器),每个孔中加入2ml丝素溶液,将4gNaCl(粒径0.25mm~0.35mm)快速均匀地加入溶液中,室温下加盖放置1~2天。将24孔板放置于去离子水中浸泡1~2天后小心取出,取出后的支架继续在水中浸泡,共浸3天后取出支架。用去离子水冲洗后放置于-20℃冰柜中冷冻2小时。将冷冻支架用真空干燥机干燥。即可得到丝素多孔支架。
对本发明比较例2制备得到的支架材料进行红外测试,如图2,图2为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的红外测试图,其中,b为比较例2所述未处理丝素溶液经盐析法得到支架的红外测试图;
对本发明比较例1制备得到的支架材料进行X-射线衍射检测,结果如图3所示,图3为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的X-射线衍射检测图,其中,b为比较例2未处理丝素溶液经盐析法得到支架的红外测试图;
按照本发明所述方法对实施例1和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定,结果如图4所示,图4为本实施例和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定图,其中曲线b为比较例2曲线图,由图可以看出,结果为14.25±1.89kPa;
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行酶降解处理测定,结果如图5所示,图5为本实施例和比较例制备得到的支架进行酶降解处理测定图,其中曲线b为比较例2降解曲线图。
对本发明比较例2制备得到的支架材料进行扫描电镜测试,结果如图1所示,图1为本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图,(d)为本发明比较例2制备得到的支架材料进行扫描电镜图;由图1(d)可以看出,支架孔完整但缝隙太大,细胞不易附着生长。且其模量范围不适宜内皮细胞生长。
实施例2
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为28%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.5%再进行60℃温度处理48h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1M盐酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得干态的丝蛋白支架材料,其孔隙率高达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为6.97±1.41kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例2制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例3
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为28%。然后将丝蛋白水溶液的 质量分数调整为0.3%再进行60℃温度处理48h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1M盐酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为3000rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的HCL溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得丝蛋白支架材料。其孔隙率高达95%以上。
对本发明实施例3制备得到的支架材料进行扫描电镜测试,结果如图7所示,图7为本发明实施例3所述所得丝蛋白支架的电镜图。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为6.39±2.36kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例3制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例4
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为30%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.5%再进行60℃温度处理24h形成水凝胶。将丝蛋白新鲜溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1M硝酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得干态的丝蛋白支架材料。其孔隙率高 达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为6.32±1.42kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例4制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例5
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为30%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.3%再进行60℃温度处理36h形成水凝胶。将丝蛋白新鲜溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1.5M盐酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌10分钟,搅拌速度为3000rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得干态的丝蛋白支架材料。其孔隙率高达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为7.25±1.12kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例5制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例6
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液 中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在60℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为30%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.5%再进行60℃温度处理36h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1.5M盐酸调节混合液pH调至4,剧烈搅拌10分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-20℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥72小时,获得干态的丝蛋白支架材料。其孔隙率高达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为8.02±1.82kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例6制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例7
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在40℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩48小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为20%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.5%再进行60℃温度处理48h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,用1.0M甲酸调节混合液pH调至3,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-40℃下进行冷冻处理24小时,然后真空 干燥72小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-50℃下进行冷冻处理30小时,然后真空干燥60小时,获得干态的丝蛋白支架材料,其孔隙率高达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为6.59±1.62kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例7制备的支架材料有利于血管的形成。
实施例8
将50g蚕丝在0.5%的Na2CO3溶液中100℃煮60min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白,使用去离子水冲洗,重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL质量浓度为9.3mol/L LiBr溶液中,60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天,期间每两小时换一次水,去除溶液中的LiBr,从而得到纯净的丝蛋白溶液,其质量浓度为6%。
将丝蛋白溶液在70℃进行浓缩处理,浓缩时间为48小时,放入通风橱中浓缩100小时,丝蛋白浓缩后溶液质量浓度为25%。然后将丝蛋白水溶液的质量分数调整为0.3%再进行60℃温度处理24h形成水凝胶。将丝蛋白浓缩溶液与丝蛋白水凝胶按丝蛋白质量分数比15:1混合成丝蛋白质量分数为2%的混合液,调节混合液pH调至6,剧烈搅拌5分钟,搅拌速度为2500rmp/min;快速加入模具中于-70℃下进行冷冻处理14小时,然后真空干燥48小时。
将得到的组织泡去剩余的酸溶液,再将组织于-40℃下进行冷冻处理24小时,然后真空干燥50小时,获得干态的丝蛋白支架材料,其孔隙率高达95%以上。
按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行压缩性能测定,测定结果为6.43±1.82kPa。按照本发明所述方法对本实施例制备得到的支架进行血管的形成实验,实验结果表明本发明实施例8制备的支架材料有利于血管的形成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种丝蛋白支架材料的制备方法,包括:
A)将丝蛋白溶液浓缩,得到浓缩后溶液,所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%~35%;
B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶,所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%~0.6%;
C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合,得到混合液;调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料;所述pH值为3~4。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A)浓缩温度为0~90℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A)浓缩时间为1~168h。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤B)热处理温度为50℃~70℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)混合液中丝蛋白的质量浓度为1%~4%。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)调节pH值为用酸调节pH值,所述酸选自盐酸和甲酸中的一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)搅拌时间为1~10min。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)冷冻温度为-10℃~-80℃,冷冻时间为1~48h,真空干燥时间为1~96h。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)后还包括将得到的支架材料浸泡、冷冻、干燥得到干态丝蛋白支架材料。
10.一种丝蛋白支架材料,其特征在于,由权利要求1~8任意一项所述的制备方法制备得到。
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