CN103289107A - 一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用，从蚕丝中提取丝素蛋白，制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇或丙二醇用纯净水配制成重量百分比为50～100％的聚乙二醇或丙二醇溶液，然后将所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存；再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合，得到共混液，所述共混液经过1～10分钟凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶；其中，所述聚乙二醇或丙二醇溶液与所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液的体积比为2：1～1：2。本发明方法操作简单，可长期保存。

Description

一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用，具体涉及一种以天然来源的丝素蛋白为基础制备可注射丝素蛋白原位凝胶的方法及其在组织缺损修复、皮肤病防治及皮肤美容、手术后止血防粘连及药物缓释等医疗领域的应用，属于生物材料和生物医学领域。

背景技术

用天然和合成的聚合物制成的凝胶是研究组织工程和药物递送的重要载体。在临床应用中，希望可以通过针头或导管将流动性的液体或半固体凝胶注射到体内，再通过控制某种物理或化学条件诱导其快速形成水不溶性的固体状凝胶，即可注射原位凝胶,从而实现无痛、免开刀治疗。对于大多数组织修复和药物缓释应用来说，治疗的周期都较长（几周至几个月），通常使用的医用聚合物凝胶，如胶原蛋白、透明质酸、聚乙酸等由于降解时间通常较快（几天至几周），很难达到临床应用的要求。而近些年国内外正在开发的新型医用生物材料-丝素蛋白生物材料则以其生物相容性好、降解缓慢等优点越来越引起人们的关注，具有广阔的临床应用前景。

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然生物材料，可以加工成薄膜、颗粒、多孔支架和水凝胶等多种材料形态。低浓度的丝素蛋白凝胶（重量百分比1－6％）为果冻态，可以通过针头直接注射，其体内降解时间为1-4周。浓度高于8％的丝素蛋白凝胶机械强度较高，呈现蜡质，一旦完全成胶，则很难以注射的方式进入到体内。高浓度的丝素蛋白凝胶在体内的降解时间为几周到几个月，因而对大多数的组织修复（如肌肉、皮肤、脂肪）及药物缓释更有应用价值。迄今在动物体外和体内进行的高浓度丝素蛋白凝胶实验通常是将丝素蛋白溶液预先诱导形成凝胶，再将固体状的凝胶通过手术移植到体内，这给临床实践带来了很大的不便，阻碍了丝素蛋白凝胶的进一步应用。

开发可注射原位丝素蛋白凝胶技术的前提是能够在室温下长时间保存高浓度的丝素蛋白溶液，这样在使用时可以快速方便地诱导其成胶。从蚕丝中提纯的丝素蛋白溶液浓度通常为3～10%，4°C低温下可以保存1-3个月，之后会逐渐变性形成凝胶。通过聚乙二醇透析法或超滤法等浓缩的10～30%的浓溶液在4℃低温下仅可以保存1～2周。无论低浓度还是高浓度的丝素蛋白溶液在冷冻干燥后都很难再完全溶于水，回复到起始的溶液状态。因此，迄今所有的丝素蛋白凝胶和其他的材料形式（薄膜、颗粒、多孔支架等）都是利用新鲜的丝素蛋白溶液或浓缩液进行制备。

现在实验室和生产中常用的制备丝素蛋白凝胶的方法有以下几种：

化学方法：

（1）改变溶液酸碱度（pH值）

丝素蛋白的等电点(pI)在4左右，因而调节丝素蛋白溶液的pH值至4左右可以中和丝素蛋白分子携带的电荷，促进分子间疏水基团的相互作用，进而诱导分子结构的改变及分子间的物理交联，最终形成网络状的凝胶结构。这个过程通常较慢，在室温或37℃下达到稳定状态的凝胶至少需要一天的时间，且很难精确控制成胶时间。此外，丝素蛋白凝胶内较低的pH值环境会影响凝胶中包埋的药物分子的稳定性和生物活性，并会引起凝胶周围组织的炎症反应。因此，这种制胶方法通常只用于实验室的基础理论研究，很难临床应用。

（2）盐析

盐析法是指向蛋白质溶液中加入一定量的无机盐（如氯化钠、硫酸铵），造成蛋白质溶解度的降低，进而从溶液中沉淀析出，是蛋白质化学中常用的纯化方法。由于丝素蛋白结构的特性，如果向丝素蛋白溶液中添加氯化钠和硫酸铵等无机盐，丝素蛋白会快速变性凝聚，形成不稳定的黏稠态的液体，再经过一段时间的孵育形成稳定的半固态凝胶。整个成胶的速度决定于盐浓度，通常需要加入大量的盐颗粒或饱和盐溶液才能在较短的时间内诱导丝素蛋白形成凝胶。但在向丝蛋白溶液中加入盐颗粒或饱和盐溶液的一瞬间，由于局部盐浓度过高，会使得周围的丝蛋白快速凝集，形成不均匀的凝胶团块。因此，这种方法很难对凝胶形成的时间和形态进行精确的控制。此外，凝胶中极高的盐浓度（至少1M以上）会在体内引起严重的炎症反应和其他不良反应，因而很难用于临床实践。

物理方法：

（1）超声震荡法

将超声细胞破碎器的探头置于丝素蛋白溶液中，经几秒种的短时间超声波处理，丝素蛋白在溶液中开始变性形成凝胶。成胶的时间可以通过控制超声强度和超声时间来控制。理想状况下固体状的凝胶应在超声结束之后5－10分钟之后形成，这样可以在成胶之前有充裕的时间向丝蛋白溶液中混入药物分子和细胞。这种制备丝素蛋白凝胶的方法快速简便、安全无毒，现已广泛用于组织工程学和药物缓释等方面的研究。虽然从原理上这种方法可以应用于临床治疗，实现可注射原位凝胶的制备，但由于需要使用较特殊的设备并需要一定的操作技巧，因而很难在实际应用中进行推广。

（2）旋涡混合法

旋涡混合法制备丝素蛋白凝胶的原理与超声震荡法相似，都是利用摩擦剪切力诱导丝素蛋白分子变性交联，但由于旋涡混合所产生的摩擦剪切力远远低于超声震荡，因而诱导丝素蛋白形成凝胶的时间也要长很多（通常几个小时以上），而且可重复性较差，不具备临床应用的价值。

（3）电泳法

当将丝素蛋白溶液置于外加电场中时，由于丝蛋白分子表面带有负电荷，在电场中会向正极移动，逐渐聚集在金属电极附近，分子间相互作用，形成黏稠状的胶体团块。这种凝胶的物理性质不稳定，在去掉电场或将电极反转的情况下胶体团块会逐渐消失，回复溶液状态。当将胶体团块从溶液中分离并保存时，黏稠状的胶体会逐渐变硬，最终成为固体状凝胶。因此，以外加电场诱导形成的半固态丝蛋白胶体是介于丝素蛋白溶液和上述稳定态凝胶之间的一种中间态，因而现在只是用于基础研究工作，尚不具备实用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其在生物医学领域的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白，制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇或丙二醇用纯净水配制成重量百分比为50～100％的聚乙二醇或丙二醇溶液，然后将所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存；

再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合，得到共混液，所述共混液经过1～10分钟凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶；

其中，所述聚乙二醇或丙二醇溶液与所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液的体积比为2：1～1：2。

本发明的有益效果是：

（1）安全无毒，减少炎症反应:除了丝素蛋白外，本发明所采用的聚乙二醇及丙二醇都是药物制备中常用的辅料，已被广泛的临床实验证实安全无毒。另外，聚乙二醇和丙二醇是惰性的亲水化合物，对细胞和蛋白质等不具有吸附作用，与蛋白质药物接枝共聚后已被证明可以有效地减少注射部位的炎症和免疫反应。

（2）丝素蛋白成胶速率的控制。通过改变聚乙二醇或丙二醇溶液的浓度即可以在3～30%较宽的丝素蛋白浓度范围内精确控制凝胶形成的速率。

达到的效果:1～10分钟内在原位成胶,从而大幅缩短临床操作所需的时间,并且在药物缓释中减少药物突释的量,提高缓释的效果，具有更广泛的应用性和更好的可重复性。

（3）更好的生物相容性。本发明由于采用惰性的生物安全性好的聚乙二醇及丙二醇作为丝素蛋白物理交联促进剂,因而更适合作为细胞和生物活性分子药物的载体用于组织工程,药物控释等领域。操作中预先将细胞和药物与聚乙二醇或丝素蛋白相混合,然后按以上描述的步骤制备凝胶即可在精确的时间内获得凝胶。

达到的效果:细胞可以最大的存活率(>90%)均匀包埋在丝素蛋白凝胶中。随着凝胶在体内的逐渐降解,包埋的细胞生长分化,最终形成组织。如果包埋的是治疗药物分子,其可以在需要的时间范围里以恒定的速率释放到周围的体液和血液中,达到最佳的治疗效果。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步（方案1），将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合之前，还包括将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液进行处理的步骤，具体如下：

将重量百分比为50～60％的羟丙基-β-环糊精溶液加入所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液中，搅拌混合均匀，得到混合液；其中，所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为1:1～3:1；

然后再将得到的所述混合液先进行冷冻，再进行真空干燥，得到丝素蛋白冻干粉，然后将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

进一步，所述羟丙基-β-环糊精为分子量为1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精、1460道尔顿的羟丙基-β-环糊精及1540道尔顿的羟丙基-β-环糊精中的任意一种或几种的混合。优选为，所述羟丙基-β-环糊精为1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精。

采用上述进一步方案的有益效果是，

羟丙基-β-环糊精可以与丝素蛋白上的疏水氨基酸相互作用，从而抑制丝素蛋白分子向Beta-折叠结构，即不溶于水的结晶区结构转化。因而向纯化后的丝素蛋白溶液中添加一定量的羟丙基-β-环糊精可以有效地防止丝素蛋白在保存和冻干过程中变性凝聚。8％的丝素蛋白溶液在4℃下通常可以保存1～2个月，而添加羟丙基-β-环糊精的溶液则可以保存6个月以上。

实验证明：分子量为1380，1460和1540道尔顿的羟丙基-β-环糊精都有抑制丝素蛋白结构转化的功能，但以1380道尔顿的效果最为明显。

进一步，所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为2:1。

进一步，所述进行冷冻的温度为-20℃～-170℃；所述进行真空干燥的时间为40～50小时；所述密封保存的时间为一年以上；所述丝素蛋白冻干粉完全溶解的时间为10～30分钟。

进一步（方案2），将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合之前，还包括将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液进行处理的步骤，具体如下：

将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液先进行稀释，得到重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液置于玻璃容器中，先进行灭菌，然后再分装在玻璃瓶中后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白冻干粉，再将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

采用上述进一步两种方案的有益效果是，

（1）丝素蛋白溶液的冻干保存和再生浓缩。羟丙基-β-环糊精可以与疏水性的化合物相结合，提高其水溶性，是制药工业中常用的辅料。羟丙基-β-环糊精可以与丝素蛋白上的疏水氨基酸相互作用，从而抑制丝素蛋白分子向Beta-折叠结构，即不溶于水的结晶区结构转化。因而向丝素蛋白溶液中添加一定量的羟丙基-β-环糊精（与丝素蛋白的重量比为1:1～3:1），可以有效地防止丝素蛋白在保存和冻干过程中变性凝聚。

此外，根据加入水的体积，再生的丝素蛋白溶液的浓度可以高达10～30%，因此通过添加羟丙基-β-环糊精和冷冻干燥这一个操作步骤可以同时取得丝素蛋白的稳定保存和高浓度溶液再生两个实用效果，对开发具有临床应用价值的可注射原位丝素蛋白凝胶技术具有重要的意义。

采用高温高压灭菌的方法可以诱导丝素蛋白的分子结构部分beta-折叠化，具有更为稳定的物理化学性质。这样的溶液经冻干后可以具有较好的再溶解性，其与聚乙二醇或丙二醇混合后形成凝胶的特性不变，因此是另外一种冻干丝素蛋白溶液的方法。相比添加环状糊精方法，此方法更为简单有效。在实际应用中，应该根据具体情况决定采用何种冻干方法。

丝素蛋白溶液的冷冻干燥在文献中有报道，其冻干过程需遵循严格的冻干曲线，因此需要使用带有程序设计的高端冻干设备，并且丝素蛋白溶液的体积、冷冻温度及冻干所用的容器等都有一定的限制。本发明中开发的两种冻干方法都不需要特殊的冻干设备，并且对冷冻温度和溶液的体积没有严格的限制，因此更适合大规模工业化生产。

（2）丝素蛋白溶液的浓缩和长期保存。丝素蛋白冻干粉可以在室温下保存至少一年以上。由于冻干时可以采用低于3%的低浓度的丝素蛋白溶液，因此这种冻干-重新溶解过程可以有效地浓缩丝素蛋白溶液，从而有效地简化和优化了凝胶制备工艺。

进一步，所述进行灭菌是在高压的条件下进行，具体的工艺条件为：在121℃,0.1MPa的条件下加热灭菌20～30分钟。

进一步，所述分装在玻璃瓶中后进行冷冻干燥的丝素蛋白溶液的体积不大于15ml，冷冻的温度为-20℃～-170℃；所述进行干燥的时间为40～50小时；所述密封保存的时间为一年以上；所述丝素蛋白冻干粉完全溶解的时间为10～30分钟。

冷冻干燥是在低于-20°C环境中进行，并且不需要使用特殊的冻干曲线，环状糊精冻干法中每瓶冻干的体积不限，高压灭菌法中每瓶冻干的体积应小于15ml。

进一步，所述进行充分混合的具体步骤如下：

将聚乙二醇或丙二醇溶液及重量体积百分比为3～30％的丝素蛋白溶液放入一个容器中充分混合；或者，

将聚乙二醇或丙二醇溶液与重量体积百分比为3～30％的丝素蛋白溶液分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连，之后交替互推5～10次，至充分混合。

采用上述进一步方案的有益效果是，操作步骤的简化：只需将聚乙二醇/丙二醇和丝素蛋白溶液混合，或分别置于两个注射器中并用连接器连接起来,来回推挤使两种溶液充分混合,在1～10分钟内将共混液涂抹或注射到体内即可。

达到的效果:具有更强的临床实用性,节省治疗时间,提高医生和病人的满意度。并且容易进行大规模的生产,产品的可靠性和安全性有保障。

进一步，所述共混液凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶的过程中，

当为放入一个容器中充分混合得到的共混液，可将所述共混液移入注射器进行注射或者直接用于涂抹填充；

当为分别吸入两个注射器中充分混合得到的共混液，可将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射。

采用上述进一步方案的有益效果是，操作简单，可通过细针头注射：将丝素蛋白溶液与聚乙二醇或丙二醇溶液快速混合后滴注或涂抹在创口组织表面，通过液体的流动性覆盖所有的创面，或者将混合液通过25～30号（国际标准）细针头注射到皮下或肌肉组织中。混合液在1～10分钟之内在原位凝固成为凝胶，进而完成组织修复或药物缓释等目的。这种液体－凝胶形式的转变不需要特殊的仪器或复杂的操作，只需要将两种液体混合，因而简便有效。

进一步，所述聚乙二醇为聚乙二醇300（分子量300道尔顿）、聚乙二醇400（分子量400道尔顿）、聚乙二醇600（分子量600道尔顿）或聚乙二醇1500（分子量1500道尔顿）中的任意一种。

进一步，在步骤1）中，所述聚乙二醇溶液置于室温下保存的时间为六个月以上。

本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种根据上述的制备方法制得的可注射丝素蛋白原位凝胶在生物医学领域的应用，所述可注射丝素蛋白原位凝胶可应用于组织缺损修复、皮肤病防治及皮肤美容、手术后止血防粘连及药物缓释医疗等领域。

附图说明

图1为本发明中的注射器连接器的结构示意图；

图2为本发明实施例7中的胰岛素从可注射丝素蛋白原位凝胶中的释放速率图；

图3为本发明实施例7中的胰岛素从可注射丝素蛋白原位凝胶中的释放百分比图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白，制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇或丙二醇用纯净水配制成重量百分比为50～100％的聚乙二醇或丙二醇溶液，然后将所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存；

再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合，得到共混液，再将所述共混液移入注射器进行注射或者直接用于涂抹填充，经过1～10分钟凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶；或者，

将聚乙二醇或丙二醇溶液与重量体积百分比为3～30％的丝素蛋白溶液分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连（如图1所示），之后交替互推5～10次，至充分混合，得到共混液，再将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射入皮下或肌肉中（体内实验），或缓冲液中（体外试验）。

其中，所述聚乙二醇或丙二醇溶液与所述重量体积百分比为3～30％的丝素蛋白溶液的体积比为2：1～1：2。

另外，将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合之前，还包括将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液进行处理的步骤，包括两种步骤，

其中一种步骤为羟丙基-β-环糊精溶液与丝素蛋白水溶液混合，以及冻干保存的步骤，具体如下：

将重量百分比为50～60％的羟丙基-β-环糊精溶液加入到所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液中，搅拌混合均匀，得到混合液；其中，所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为1:1～3:1；

然后再将得到的所述混合液在-20℃～-170℃的温度下进行冷冻，再进行真空干燥40～50小时，得到丝素蛋白冻干粉，然后将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存一年以上，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，溶解的时间为10～30分钟，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

另一种步骤为采用丝素蛋白水溶液高压灭菌以及冻干保存的步骤，具体如下：

将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液先进行稀释，得到重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液置于玻璃容器中，在121°C,0.1MPa的条件下加热灭菌20～30分钟；将灭菌后的丝素蛋白溶液以不大于15ml的体积分装在玻璃瓶中后在-20℃～-170℃的温度下进行冷冻，再进行干燥40～50小时，得到丝素蛋白冻干粉，然后将丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，密封保存的时间为一年以上，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉溶解10～30分钟，至完全溶解，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

一种根据上述的制备方法制得的可注射丝素蛋白原位凝胶在生物医学领域的应用，所述可注射丝素蛋白原位凝胶可应用于组织缺损修复、皮肤病防治及皮肤美容、手术止血防粘连及药物缓释医疗等领域。

以下通过几个具体实施例以对本发明进行进一步的说明。

实施例1

一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白制成重量百分比为16％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇300（分子量300道尔顿）用纯净水配制成重量体积百分比为50～100％的聚乙二醇300溶液，再将所述聚乙二醇300溶液置于室温下保存，保存的时间为六个月以上；

将所述聚乙二醇300溶液与重量体积百分比为16％的丝素蛋白溶液以相同的体积分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连，之后交替互推5～10次，至充分混合，得到共混液，再将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射入皮下或肌肉中（体内实验），或缓冲液中（体外试验）。

凝胶形成的时间可以通过改变丝素蛋白溶液和聚乙二醇溶液的浓度精确地控制（见表1）。

表1：丝蛋白溶液与聚乙二醇300溶液配比对凝胶形成的影响

实施例2聚乙二醇及丙二醇的选择

首先筛选了几种制药工业中常用的助溶剂,如聚乙二醇、丙二醇,棉籽油，聚氧乙烯蓖麻油，二甲基乙酰胺，甲基吡咯烷酮，中链甘油三酯等对丝素蛋白凝胶形成的影响，发现聚乙二醇的效果最好,丙二醇其次。其它的化合物或者不能够促进凝胶形成,或是难以控制凝胶形成的时间和状态。

聚乙二醇的分子量差别很大,从几百到几万道尔顿不等。聚乙二醇200、300（分子量300道尔顿）在4℃低温下为液态,聚乙二醇400在低温下为固态,而在室温下为液态,更大分子量的聚乙二醇在低温和室温都为固态。

对于液态聚乙二醇，直接将聚乙二醇称重后加入纯净水配成所需的浓度。对于固态聚乙二醇，首先将聚乙二醇在室温下配制成浓溶液(接近饱和),然后加入纯净水配成所需的浓度。实验时按一定比例将聚乙二醇溶液与丝素蛋白溶液混合后观察丝素蛋白凝胶形成的时间和状态。研究发现，无论分子量多大，当溶液中聚乙二醇浓度达到一定量时,都会促进丝素蛋白的聚集和物理交联，形成凝胶。然而随着聚乙二醇分子量的增高,丝素蛋白的变性聚集过程也变得越来越难以控制,且形成的凝胶也越来越不均匀。当向丝素蛋白溶液中添加6000和20000道尔顿的聚乙二醇时,丝素蛋白溶液快速变性析出,形成颗粒状沉淀(见表2)。为了能够更好地控制成胶的时间并获得均匀的丝素蛋白凝胶,本实施例优选的选择了聚乙二醇300作为丝素蛋白原位凝胶的诱导剂。此外,由于聚乙二醇300在低温和室温下都是液态,因而更方便材料的保存和临床操作。

表2：聚乙二醇和丙二醇分子量和溶液浓度对丝蛋白凝胶形成的影响

实施例3

一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将丙二醇用纯净水配制成重量体积百分比为30～80％的丙二醇溶液，再将所述丙二醇溶液置于室温下保存，保存的时间为六个月以上；

将重量百分比为50～60％的羟丙基-β-环糊精溶液加入到所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液中，搅拌混合均匀，得到混合液；其中，所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为2:1；

然后再将得到的所述混合液在-20℃～-170℃的温度下进行冷冻，再进行真空干燥48小时，得到丝素蛋白冻干粉，然后将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存一年以上，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，溶解的时间为10～30分钟，得到重量百分比为16％的丝素蛋白溶液，再将丙二醇溶液与重量百分比为16％的丝素蛋白溶液以相同的体积分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连，之后交替互推5～10次，至充分混合，得到共混液，再将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射入皮下或肌肉中（体内实验），或缓冲液中（体外试验）。

实施例4羟丙基-β-环糊精的选择

羟丙基-β-环糊精具有两亲性和极高的水溶解性,溶解度可达重量体积比50%以上,因而相比环糊精更有助于提高水不溶化合物的溶解度,是制药工业中常用的药品辅料。本实施例首先比较了羟丙基-β-环糊精和环糊精对丝素蛋白溶液凝胶形成的抑制作用,发现添加有羟丙基-β-环糊精(与丝素蛋白的重量比为2:1)的高浓度(16%)的丝素蛋白溶液可在低温下保存3个月以上,而加入同样量的环糊精的丝素蛋白溶液则只能保存1～2个月。未添加任何保护剂的同样浓度的丝素蛋白溶液则只能保存1～2周。添加羟丙基-β-环糊精的丝蛋白溶液在冷冻干燥后的溶解性显著高于添加环糊精的丝蛋白溶液,而后者则高于单纯的丝素蛋白溶液(见表3)。本实施例随后对三种不同分子量的羟丙基-β-环糊精进行了对比研究,发现它们对防止丝素蛋白凝胶的作用差别不大,但以1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精效果稍好(具体见表3)。本实施例进一步对丝素蛋白与羟丙基-β-环糊精的比例进行了优化。当将1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白(16%的丝素蛋白溶液)以重量比为1:4,1:2,1:1,2:1,4:1相混合时,无论是溶液的保存时间还是冻干后的溶解性都以2:1的比例为最佳(具体见表3)。

表3：羟丙基-β-环糊精分子量和溶液浓度的优化

实施例5

一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇300（分子量300道尔顿）用纯净水配制成重量体积百分比为30～80％的聚乙二醇300溶液，再将所述聚乙二醇300溶液置于室温下保存，保存的时间为六个月以上；

将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液先进行稀释，得到重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液置于玻璃容器中，在121°C,0.1MPa的条件下加热灭菌20～30分钟；将灭菌后的丝素蛋白溶液以不大于15ml的体积分装在玻璃瓶中后在-20℃～-170℃的温度下进行冷冻，再进行干燥48小时，得到丝素蛋白冻干粉，然后将丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，密封保存的时间为一年以上，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉溶解10～30分钟，至完全溶解，得到重量百分比为16％的丝素蛋白溶液，

将聚乙二醇300溶液与重量体积百分比为16％的丝素蛋白溶液以相同的体积分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连，之后交替互推5～10次，至充分混合，得到共混液，再将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射入皮下或肌肉中（体内实验），或缓冲液中（体外试验）。

实施例6溶液混合方法的优选

为了使聚乙二醇溶液和丝素蛋白溶液混合的更为均匀,并能精确控制丝素蛋白形成凝胶的时间,本实施例对混合方法进行了一系列摸索。最简单的方法是将两种溶液同时加入一个容器中,用搅拌棒搅均后即可使用。制备注射用原位凝胶时，可将混合液通过大号(14～18号)的针头吸入注射器中,再换上小号(25号以上)的针头,慢慢将液体推出。另外一种重复性更好的方法是将两种液体预先置于两个注射器中,中间用一个连接器连接,然后将两个针管左右互推,使两种液体充分混合（具体见图1）。如果左右互推的次数固定(如10次),则最终丝素蛋白形成凝胶的时间也精确可控。这种混合方法也给临床操作带来很大的便利,丝蛋白和聚乙二醇都可以预先保存在注射器中，因而整个制备过程只需要几分钟。

实施例7包埋有胰岛素的可注射原位丝蛋白凝胶的体外释放试验

药物分子即可以以溶液的形式也可以以颗粒的形式与聚乙二醇或丝素蛋白溶液预先混合,进而包埋在丝素蛋白凝胶中。

本实施例以人胰岛素为例,对溶液混合及成胶的过程以及胰岛素从凝胶中的释放速率进行了详细的研究(具体见图2、图3)。本实施例先将胰岛素溶解在酸性的75%聚乙二醇溶液(pH值3.75）或将胰岛素颗粒悬浮在中性的75%聚乙二醇溶液(pH值6～8）中,然后再与等体积的丝素蛋白溶液在注射器中混合,再通过25号细针头将混合液注射到pH7.4的磷酸缓冲液中，置于37℃下温育。观察发现混合溶液可以在10分钟内形成胶体状半透明凝胶，1小时内形成固体状的白色凝胶，其成胶时间和形态与不加胰岛素的混合溶液对照组（聚乙二醇和丝蛋白）相比基本相似。

在另外一组实验中，将胰岛素溶液或颗粒与丝蛋白溶液相混，进而与75%的聚乙二醇溶液混合形成凝胶，整个实验过程与前面的实验类似，观察到的成胶时间和过程也基本相同。因此，丝素蛋白形成凝胶的过程不受胰岛素的形态（溶液或颗粒）和混合顺序的影响。随后利用高压液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附法（ELISA)对磷酸缓冲液中的胰岛素浓度进行实时定量检测，并定期更换新鲜的磷酸缓冲液，直到胰岛素从凝胶中的释放基本结束。结果显示胰岛素从丝蛋白凝胶中的释放可以持续两周以上，两种不同的凝胶样品（胰岛素-聚乙二醇混合或胰岛素-丝素蛋白混合）其释放速率基本相同，但含有胰岛素颗粒的凝胶样品的释放速率要稍慢于含有胰岛素溶液的凝胶样品（具体见图2、图3）。

这个实验初步证明了新型的丝素蛋白可注射原位凝胶可以作为新型药物载体用于皮下或肌肉注射，达到延长药物作用时间和效率，减轻病人负担的目的。对于大多数糖尿病人来说，每天至少注射一次胰岛素无论从经济上还是便利上都是很大的负担。如果能够开发出每两周或一个月注射一次，并且可以由患者自行操作注射的基础胰岛素制剂将会创造极高的社会和经济效益。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

从蚕丝中提取丝素蛋白，制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇或丙二醇用纯净水配制成重量百分比为50～100％的聚乙二醇或丙二醇溶液，然后将所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存；

再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合，得到共混液，所述共混液经过1～10分钟凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶；

其中，所述聚乙二醇或丙二醇溶液与所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液的体积比为2：1～1：2。

2.根据权利要求1所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合之前，还包括将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液进行处理的步骤，具体如下：

将重量百分比为50～60％的羟丙基-β-环糊精溶液加入到所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液中，搅拌混合均匀，得到混合液；其中，所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为1:1～3:1；

然后再将得到的所述混合液先进行冷冻，再进行真空干燥，得到丝素蛋白冻干粉，然后将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

3.根据权利要求2所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述羟丙基-β-环糊精为分子量为1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精、1460道尔顿的羟丙基-β-环糊精及1540道尔顿的羟丙基-β-环糊精中的任意一种或几种的混合。

4.根据权利要求3所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述羟丙基-β-环糊精为1380道尔顿的羟丙基-β-环糊精。

5.根据权利要求2所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述羟丙基-β-环糊精与丝素蛋白水溶液的重量比为2:1。

6.根据权利要求2所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述进行冷冻的温度为-20℃～-170℃；所述进行真空干燥的时间为40～50小时；所述密封保存的时间为一年以上；所述丝素蛋白冻干粉完全溶解的时间为10～30分钟。

7.根据权利要求1所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合之前，还包括将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液进行处理的步骤，具体如下：

将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液先进行稀释，得到重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比不高于3%的丝素蛋白溶液置于玻璃容器中，先进行灭菌，然后再分装在玻璃瓶中后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白冻干粉，再将所述丝素蛋白冻干粉在室温下密封保存，备用；

使用前将备用的丝素蛋白冻干粉放入容器中，边加入水边摇晃至丝素蛋白冻干粉完全溶解，得到重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液，再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合。

8.根据权利要求7所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述进行灭菌的工艺条件为：在121℃,0.1MPa的条件下加热灭菌20～30分钟。

9.根据权利要求7所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述分装在玻璃瓶中后进行冷冻干燥的丝素蛋白溶液的体积不大于15ml，冷冻的温度为-20℃～-170℃；所述进行干燥的时间为40～50小时；所述密封保存的时间为一年以上；所述丝素蛋白冻干粉完全溶解的时间为10～30分钟。

10.根据权利要求1至9任一项所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述进行充分混合的具体步骤如下：

将聚乙二醇或丙二醇溶液及重量百分比为3～30％的丝素蛋白溶液放入一个容器中充分混合；或者，

将聚乙二醇或丙二醇溶液与重量体积百分比为3～30％的丝素蛋白溶液分别吸入两个注射器中，溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以连接器相连，之后交替互推5～10次，至充分混合。

11.根据权利要求10所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述共混液凝固形成所述丝素蛋白凝胶的过程中，

当为放入一个容器中充分混合得到的共混液，可将所述共混液移入注射器进行注射或者直接用于涂抹填充；

当为分别吸入两个注射器中充分混合得到的共混液，可将所述共混液置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，换上针头，缓慢将混合液推出针头进行注射。

12.根据权利要求1至9任一项所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600中或聚乙二醇1500中的任意一种。

13.根据权利要求1至9任一项所述的可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存的时间为六个月以上。

14.一种根据权利要求1至13任一项所述的制备方法制得的可注射丝素蛋白原位凝胶在生物医学领域的应用，其特征在于：所述可注射丝素蛋白原位凝胶可应用于组织缺损修复、皮肤病防治及皮肤美容、手术后止血防粘连及药物缓释医疗领域。

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