CN103910789A - 一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺 - Google Patents

一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，得到可以快速、完全地溶解于水的丝素蛋白冻干粉，应用于生物医学临床的多个领域。本发明从控制丝素蛋白分子间相互作用力出发，通过改变丝素蛋白溶液的酸碱度、离子强度及浓度，并经过高压高温灭菌诱导丝素蛋白从单分子、多聚体及纳米颗粒等复杂的蛋白结构向50-300纳米左右的稳定纳米颗粒转变，抑制丝素蛋白分子间的相互作用及凝聚交联，因而可以通过基本的冷冻干燥程序得到冻干粉。由于冻干前已经经过高温灭菌，丝素蛋白粉无需进一步的消毒处理就可以直接用于临床治疗，大大简化了操作步骤，节约成本。

Description

一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺。
背景技术
近些年，从再生丝素蛋白溶液出发，经进一步加工制成的薄膜、颗粒、多孔支架和水凝胶等多种可降解生物材料已经证明具有优异的生物相容性，无免疫原性，降解缓慢，正成为一种新型医用生物材料，即可以作为产品直接用于临床中的组织修复，也可以作为药物及细胞的载体支架用于药物缓释及组织工程构建人工器官。因此，丝素蛋白溶液是制备所有丝素蛋白基生物材料的基础，如何纯化得到高质量、高分子量、高稳定性的丝素蛋白溶液是进一步开发丝素蛋白医用生物材料的关键。
大分子量再生丝素蛋白溶液的制备条件有多种，都需经过脱胶丝溶解和透析去除变性剂两个步骤。透析后得到的丝素蛋白水溶液浓度通常在4-8% （w/v）。由于丝素蛋白容易在高温下发生分子结构变化导致聚集，形成凝胶或沉淀析出，纯化的丝素蛋白溶液通常保存在4°C冰箱里，时间不超过两个月。室温下保存不超过两周。这给下游的材料制备和应用带来了很大的不便，主要体现在：（1）浪费时间和材料，每次制备材料都需要重新纯化丝素蛋白溶液；（2）产品质量难以控制、重复性差。大分子量再生丝素蛋白溶液即使保存在4°C冰箱丝素蛋白的结构也在缓慢地变化，分子在不断聚集，可能会直接影响到下面制备材料的性能；（3）难以保存和运输，将再生丝素蛋白溶液作为商品直接销售，或作为可注射凝胶等的主要组分销售都需要考虑保存温度和条件的问题，这也是制约其大规模应用开发的首要难题。此外，某些材料的制备和应用领域需要的再生丝素蛋白溶液浓度较高，纯化后的丝素蛋白溶液只能通过进一步的浓缩手段，如聚乙二醇透析、超滤等得到需要的高浓度丝素蛋白溶液，给材料制备带来额外的成本和污染风险。
发明内容
本发明的目的是开发大分子量丝素蛋白冻干粉的制备方法，得到可以快速、完全地溶解于水的丝素蛋白冻干粉，应用于生物医学临床的多个领域。本发明从控制丝素蛋白分子间相互作用力出发，通过改变丝素蛋白溶液的酸碱度及离子强度，并经过高压高温灭菌诱导丝素蛋白从溶液中单分子、多聚体、纳米颗粒等复杂的蛋白多聚结构向50-300纳米左右的稳定纳米颗粒转变，抑制丝素蛋白进一步凝聚，因而可以通过基本的冷冻干燥程序得到冻干粉。由于冻干前已经经过高温灭菌，丝素蛋白粉无需进一步的消毒处理就可以直接用于临床治疗，大大简化了操作步骤，节约成本。
本发明采用如下技术方案：一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：
S1：蚕丝脱胶：30克蚕丝置于25.44 克碳酸钠/12升去离子水中煮沸0.5小时。沸煮过程中要不断搅拌蚕丝使其分散防止粘结在一起，煮完后将脱胶蚕丝捞出并用去离子水清洗，重复清洗3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，置于超净工作台内干燥过夜；
S2：溴化锂溶解：将10克脱胶的丝置于40 ml 9.3M溴化锂溶液中，用玻璃棒搅拌使得脱胶丝充分浸透，放于60oC 烘箱加热4小时；
S3：透析：使用截流分子量为3500-10000道尔顿的Pierce透析装置或普通透析袋，透析36小时，换水7次，分别在透析开始的3、6、12、18、24、30、36小时换水，可以去除溶液中的溴化锂成分，而丝素蛋白保留在透析袋中；
S4：离心：将透析袋中的丝素蛋白溶液移入离心容器中，于4℃、9000转速条件下离心20分钟，弃去沉淀，取上层溶液即是所要制取的丝素蛋白溶液；
S5：取一定量的丝素蛋白溶液，在60℃烘干3小时以上，将得到的丝素蛋白膜称重，及时丝素蛋白溶液的浓度 （w/v）；
S6：高温高压灭菌：用超纯水稀释丝蛋白溶液至浓度6%，然后用酸碱度PH=7.4， 10mM的PB（磷酸盐）缓冲液按体积比1:1与6%丝素蛋白溶液混合均匀，使得混合后的丝蛋白溶液终浓度为3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度为5mM，将溶液移至玻璃容器中于121°C、0.1Mpa,高压灭菌20 分种；
S7：冷冻干燥：将以上灭菌后的溶液取10ml 置于无菌15ml玻璃瓶中，在-20℃以下的温度彻底冷冻，之后置于冻干机中抽真空48小时以上使冰升华，得到大分子量丝素蛋白冻干粉。
所述S2中的溴化锂可以用其他化合物代替，如氯化钙-乙醇-水三元混合液，其摩尔比为1:2:8，硫氰化锂，氯化钙等。
所述S3中可以通过脱盐柱层析方法代替透析法去除溴化锂或其他盐离子，若S3使用脱盐柱层析方法则可以省去S4。
所述S6中磷酸盐缓冲液也可以由其它可以保持PH稳定的缓冲液代替，如tris缓冲液，醋酸钠缓冲液，氯化铵缓冲液等。
所述S6中丝素蛋白与磷酸盐缓冲液混合时的浓度和体积比可变，但混合液中丝蛋白溶液的终浓度为不高于3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度不低于5mM。
本发明的有益效果是：本发明工艺制备简单，所制得的冻干粉不会改变丝素蛋白的天然分子量和无规卷曲结构，加水后可以快速溶解成溶液，用于制备各种形式的丝素蛋白医用可降解材料。冻干粉可在室温下长久保存（一年以上）和运输，大大降低丝素材料的浪费，提高了使用的便利性和可靠性，促进了丝素蛋白生物材料的科研和产业化应用。
 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：
S1：蚕丝脱胶：30克蚕丝置于25.44 克碳酸钠/12升去离子水中煮沸0.5小时。沸煮过程中要不断搅拌蚕丝使其分散防止粘结在一起，煮完后将脱胶蚕丝捞出并用去离子水清洗，重复清洗3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，置于超净工作台内干燥过夜；
S2：溴化锂溶解：将10克脱胶的丝置于40 ml 9.3M溴化锂溶液中，用玻璃棒搅拌使得脱胶丝充分浸透，放于60oC 烘箱加热4小时；
S3：透析：使用截流分子量为3500-10000道尔顿的Pierce透析装置或普通透析袋，透析36小时，换水7次，分别在透析开始的3、6、12、18、24、30、36小时换水，可以去除溶液中的溴化锂成分，而丝素蛋白保留在透析袋中；
S4：离心：将透析袋中的丝素蛋白溶液移入离心容器中，于4℃、9000转速条件下离心20分钟，弃去沉淀，取上层溶液即是所要制取的丝素蛋白溶液；
S5：取一定量的丝素蛋白溶液，在60℃烘干3小时以上，将得到的丝素蛋白膜称重，及时丝素蛋白溶液的浓度 （w/v）；
S6：高温高压灭菌：用超纯水稀释丝蛋白溶液至浓度6%，然后用酸碱度PH=7.4， 10mM的PB（磷酸盐）缓冲液按体积比1:1与6%丝素蛋白溶液混合均匀，使得混合后的丝蛋白溶液终浓度为3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度为5mM，将溶液移至玻璃容器中于121°C、0.1Mpa,高压灭菌20 分种；
S7：冷冻干燥：将以上灭菌后的溶液取10ml 置于无菌15ml玻璃瓶中，在-20℃以下的温度彻底冷冻，之后置于冻干机中抽真空48小时以上使冰升华，得到大分子量丝素蛋白冻干粉。
所述S2中的溴化锂可以用其他化合物代替，如氯化钙-乙醇-水三元混合液，其摩尔比为1:2:8。
所述S3中可以通过脱盐柱层析方法代替透析法去除溴化锂或其他盐离子，若S3使用脱盐柱层析方法则可以省去S4。
所述S6中磷酸盐缓冲液也可以由其它可以保持PH稳定的缓冲液代替，如tris缓冲液，醋酸钠缓冲液，氯化铵缓冲液等。
所述S6中丝素蛋白与磷酸盐缓冲液混合时的浓度和体积比可变，但混合液中丝蛋白溶液的终浓度为不高于3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度不低于5mM。
表一 不同条件的大分子量丝素蛋白粉效果
  稀释后终浓度 磷酸盐缓冲液终浓度 高压灭菌 冻干粉溶解性
丝素溶液 3% 5mM 是 可溶性好
丝素溶液 3% 5mM 无 不溶
丝素溶液 3% 无 是 有不溶颗粒
丝素溶液 3% 无 无 不溶
丝素溶液 4% 5mM 是 可溶，但不如3%
丝素溶液 4% 5mM 否 不溶
丝素溶液 4% 无 是 不溶
丝素溶液 4% 无 无 不溶
丝素溶液 5% 5mM 是 不溶
丝素溶液 5% 5mM 无 不溶
丝素溶液 5% 无 是 不溶
丝素溶液 5% 无 无 不溶
以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其他实施例，亦均在本发明的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：
S1：蚕丝脱胶：30克蚕丝置于25.44 克碳酸钠/12升去离子水中煮沸0.5小时，
沸煮过程中要不断搅拌蚕丝使其分散防止粘结在一起，煮完后将脱胶蚕丝捞出并用去离子水清洗，重复清洗3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，置于超净工作台内干燥过夜；
S2：溴化锂溶解：将10克脱胶的丝置于40 ml 9.3M溴化锂溶液中，用玻璃棒搅拌使得脱胶丝充分浸透，放于60oC 烘箱加热4小时；
S3：透析：使用截流分子量为3500-10000道尔顿的Pierce透析装置或普通透析袋，透析36小时，换水7次，分别在透析开始的3、6、12、18、24、30、36小时换水，可以去除溶液中的溴化锂成分，而丝素蛋白保留在透析袋中；
S4：离心：将透析袋中的丝素蛋白溶液移入离心容器中，于4℃、9000转速条件下离心20分钟，弃去沉淀，取上层溶液即是所要制取的丝素蛋白溶液；
S5：取一定量的丝素蛋白溶液，在60℃烘干3小时以上，将得到的丝素蛋白膜称重，计算丝素蛋白溶液的浓度 （w/v）；
S6：高温高压灭菌：用超纯水稀释丝蛋白溶液至浓度6%，然后用酸碱度PH=7.4， 10mM的PB（磷酸盐）缓冲液按体积比1:1与6%丝素蛋白溶液混合均匀，使得混合后的丝蛋白溶液终浓度为3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度为5mM，将溶液移至玻璃容器中于121°C、0.1Mpa,高压灭菌20 分种；
S7：冷冻干燥：将以上灭菌后的溶液取10ml 置于无菌15ml玻璃瓶中，在-20℃以下的温度彻底冷冻，之后置于冻干机中抽真空48小时以上使冰升华，得到大分子量丝素蛋白冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述S2中的溴化锂可以用其他化合物代替，如硫氰化锂、氯化钙、及摩尔比为1:2:8的氯化钙-乙醇-水三元混合液等。
3.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述S3中可以通过脱盐柱层析方法代替透析法去除溴化锂或其他盐离子，若S3使用脱盐柱层析方法则可以省去S4。
4.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述S6中磷酸盐缓冲液也可以由其它可以保持PH稳定的缓冲液代替，如tris缓冲液，醋酸钠缓冲液，氯化铵缓冲液等。
5.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于：所述S6中丝素蛋白与磷酸盐缓冲液混合时的浓度和体积比可变，但混合液中丝蛋白溶液的终浓度为不高于3%（w/v），PB（磷酸盐）缓冲液的终浓度不低于5mM。
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