CN103923200A - 一种大分子量丝素蛋白冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉是将蚕丝通过脱胶、溴化锂溶解、透析、离心、高温高压灭菌以及冷冻干燥后得到的粉末。所述冻干粉的组成为无规卷曲和α-螺旋构成的稳定纳米颗粒。本发明的有益效果是：可以在冷冻和干燥的过程中保持丝素蛋白的无规卷曲分子结构，使其不向beta-折叠方向转变或控制转变的程度，可以有效防止丝素蛋白分子间相互作用、聚集结晶。本发明为可以快速、完全地溶解于水的大分子量丝素蛋白冻干粉，适用于生物医学临床的多个领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种大分子量丝素蛋白冻干粉。
背景技术
近些年，从再生丝素蛋白溶液出发，经进一步加工制成的薄膜、颗粒、多孔支架和水凝胶等多种可降解生物材料已经证明具有优异的生物相容性，无免疫原性，降解缓慢，正成为一种新型医用生物材料，即可以作为产品直接用于临床中的组织修复，也可以作为药物及细胞的载体支架用于药物缓释及组织工程构建人工器官。蚕茧中存在的天然丝素蛋白分子量约为300万道尔顿左右。经酸碱处理后的丝素蛋白降解为小分子量（< 10万道尔顿）多肽，以无规卷曲的形式存在，其冻干粉虽然可以溶于水，但由于失去了分子结构变化的能力，不能够通过分子间相互作用自组装成凝胶、薄膜、纳米颗粒、多孔支架等生物材料形式，用于组织修复和药物递送。因此，大分子量丝素蛋白溶液是制备所有丝素蛋白基生物材料的基础，如何纯化得到高质量、高分子量、高稳定性的丝素蛋白溶液是进一步开发丝素蛋白医用生物材料的关键，而理想的丝素蛋白分子量应大于10万道尔顿，最好大于100万道尔顿，尽量接近天然丝素蛋白分子。
现有的大分子量丝素蛋白溶液（再生丝素蛋白溶液）经纯化后很难保存和运输，将再生丝素蛋白溶液作为商品直接销售，或作为可注射凝胶等的主要组分销售都需要考虑保存温度和条件的问题，这也是制约其大规模应用开发的首要难题。此外，某些材料的制备和应用领域需要的再生丝素蛋白溶液浓度较高，纯化后的丝素蛋白溶液只能通过进一步的浓缩手段，如聚乙二醇透析、超滤等得到需要的高浓度丝素蛋白溶液，给材料制备带来额外的成本和污染风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种大分子量丝素蛋白冻干粉，可以在冷冻和干燥的过程中保持丝素蛋白的无规卷曲分子结构，使其不向beta-折叠方向转变或控制转变的程度，可以有效防止丝素蛋白分子间相互作用、聚集结晶。本发明为可以快速、完全地溶解于水的丝素蛋白冻干粉，应用于生物医学临床的多个领域。
本发明采用如下技术方案：一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉是将蚕丝通过脱胶、溴化锂溶解、透析、离心、高温高压灭菌以及冷冻干燥后得到的粉末。
所述冻干粉的丝素蛋白分子结构为无规卷曲状和α-螺旋状。
所述冻干粉的丝素蛋白平均分子量大于10万道尔顿，纯化后以50-300纳米的颗粒状存在于溶液中，并在灭菌前后和冻干粉溶解后保持颗粒大小不变。
本发明的有益效果是：可以在冷冻和干燥的过程中保持丝素蛋白的无规卷曲分子结构，使其不向beta-折叠方向转变或控制转变的程度，可以有效防止丝素蛋白分子间相互作用、聚集结晶。本发明为可以快速、完全地溶解于水的丝素蛋白冻干粉，应用于生物医学临床的多个领域。
附图说明
图1为本发明未经处理的丝素蛋白原溶液冻干后的片状结构电镜图；
图2为本发明所述的大分子量丝素蛋白冻干粉的扫描电镜图；
图3 为本发明不同方法制备丝素蛋白的分子量分析曲线图；
图4 为本发明大分子量丝素蛋白冻干粉在制作过程中的粒径变化曲线图；
图5 为本发明再生丝素蛋白溶液成胶和大分子量丝素蛋白冻干粉的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
1.一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉是将蚕丝通过脱胶、溴化锂溶解、透析、离心、定浓度、高温高压灭菌以及冷冻干燥后得到的白色固体粉末。
2.将蚕丝置于一定量碳酸钠溶液中煮沸一段时间后用清水浸泡洗涤后得到脱胶丝，脱胶丝通风干燥后取适量脱胶丝置于溴化锂溶液中溶解。脱胶丝完全溶解后置于透析袋中透析两天，溴化锂会从透析袋中渗出，而丝蛋白保留在透析袋中。透析完后将丝素蛋白溶液离心，取上清，即得丝素蛋白溶液。待溶液测定浓度后与磷酸盐缓冲液混合制得质量体积比为3%的丝素蛋白溶液，一定体积分装入玻璃瓶中冷冻过夜，然后冷冻干燥一定时间后即制得本发明所述大分子量丝素蛋白冻干粉。
3. 步骤2中所述溴化锂也可以由其他已知的可溶解脱胶丝的化合物代替，如氯化钙/乙醇/水组成的三元混合液、硫氰化锂，氯化钙等。
4.步骤2中所述磷酸盐缓冲液也可以由其它可以保持PH稳定的缓冲液代替，如tris缓冲液，醋酸钠缓冲液，氯化铵缓冲液等。
5.冻干粉保存：将密封的装有冻干粉的玻璃容器置于室温，避光保存。
6.冻干粉溶解：向冻干粉中加入一定量的纯净水，缓慢转动混匀，直到所有的干粉都接触到水，之后静置5-10分钟，直到完全溶解为透明的丝素蛋白溶液,期间可以缓慢搅拌促进溶解。
7.冻干粉微观形貌：原丝素蛋白溶液冻干成粉后是片状结构，冻干粉的结构致密，不溶于水。调节PH值并高温灭菌后制得的大分子量丝素蛋白冻干粉呈多孔海绵状，可以快速溶于水，如图1、2所示。
8.冻干粉的分子量：用两种不同方法制备的丝素蛋白溶液制得的大分子量丝素蛋白冻干粉，两者分子量相差不大，且与铁蛋白（Ferritin）的分子量相近，远高于分子量为6.6万道尔顿的牛血清白蛋白(BSA)的分子量，如图3所示。
9．冻干粉的粒径：高压高温灭菌可以诱导丝素蛋白从单分子、多聚体及纳米颗粒等复杂的分子结构向50-300纳米左右的稳定纳米颗粒转变，降低了分子间作用力，抑制丝素蛋白进一步凝聚，因此，冻干粉在纯化后以50-300纳米的颗粒状存在于溶液中，并在灭菌前后和冻干粉溶解后保持颗粒大小不变。如图4所示。
10.冻干粉结构：丝素蛋白的红外吸收光谱上，silkⅠ结构的特征吸收峰分别出现在1650cm-1，1665 cm-1 (酰胺Ⅰ)，1545 cm-1（酰胺Ⅱ)，1240 cm-1（酰胺Ⅲ)，669cm-1（酰胺Ⅴ)附近。silkⅡ结构的特征吸收峰分别出现在1625-1640cm-1(酰胺Ⅰ)，1515-1525 cm-1（酰胺Ⅱ)，1265 cm-1（酰胺Ⅲ)，696cm-1（酰胺Ⅴ)，大分子量丝素蛋白粉溶解后凝胶的红外吸收特征峰主要在1640 cm-1,1526 cm-1处，即β-折叠结构，而大分子量蛋白粉的红外吸收特征峰重要在1663 cm-1,1542 cm-1处，即α-螺旋和无规卷曲结构。所以，所述冻干粉的结构为无规卷曲状和α-螺旋状，如图5所示。
11.冻干粉溶解后凝胶性能：丝素蛋白凝胶具有良好的生物相容性，降解缓慢等优点，在皮肤病防治、手术后止血防粘连以及药物缓释等领域应用，丝素蛋白凝胶是丝素蛋白的一项重要行能。将重量体积比为3～30的丝素蛋白溶液与小分子量液态聚乙二醇300或400进行充分混合，得到共混液，一定时间后凝胶，丝素蛋白和聚乙二醇的浓度不同，凝胶时间亦不同，聚乙二醇和丝素蛋白溶液的体积比为1:1。凝胶时间是我们分析丝素溶液性能的重要表征。丝素蛋白溶液形成凝胶是通过倒置试管观察丝素蛋白的流动情况来判断。我们通过以原丝素溶液和再生丝素溶液分别与聚乙二醇400混合形成凝胶的方法，得出再生丝素溶液在凝胶时间上与原丝素溶液无较大差别，说明再生丝素溶液具有良好的凝胶性能，如表1所示。用聚乙二醇300代替聚乙二醇400得到的凝胶时间相对较长，但趋势相同，即再生丝素溶液在凝胶时间上与原丝素溶液无较大差别。
表一 原/再生丝素溶液分别与聚乙二醇400以不同浓度混合后成胶时间
以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其他实施例，亦均在本发明的保护范围之中。
Claims (3)
1.一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉是将蚕丝通过脱胶、溴化锂溶解、透析、离心、高温高压灭菌以及冷冻干燥后得到的粉末。
2.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉的丝素蛋白分子结构为无规卷曲状和α-螺旋状。
3.根据权利要求1所述的一种大分子量丝素蛋白冻干粉，其特征在于：所述冻干粉的丝素蛋白平均分子量大于10万道尔顿，纯化后以50-300纳米的颗粒状存在于溶液中，并在灭菌前后和冻干粉溶解后保持颗粒大小基本不变。
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |