CN110227181A - 一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：1、制取丝素蛋白水溶液并浓缩；2、将丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水制得混合溶液；3、将混合溶液成型，并放入28‑45℃下的温度环境下交联，再冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；4、将丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗，得到丝素蛋白成型品；5、使用原位矿化的方法在丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。本发明的制备方法采用操作简单、成品率高、无毒性的方法制备丝素蛋白复合羟基磷灰石骨导管，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。

Description

一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及材料化学、医用高分子功能材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法及其应用。
背景技术
在现代的对骨损伤修复的研究中，如何重建骨骼，促进骨愈合，须从4个基本要素出发加以考虑：①骨传导基质；②骨诱导因子；③成骨细胞植入合适的环境后就可直接形成新骨；④稳定的生物力学环境。目前临床上，多以移植自体骨或同种异体骨作为主要治疗手段。自体骨治疗一直被认为是植骨的最佳选择，但自体骨取材有限、切取供移植的骨骼时难免增加失血量、手术时间增长给病人增加痛苦，以及供区部位还会有一定的不适，甚至出现并发症等。而使用同种异体骨移植则有着愈合周期长，配型困难，容易发生排异反应等缺点为解决自体骨和同种异体骨的存在缺陷，使用骨导管对缺损的骨组织进行引导再生治疗已经逐渐被研究者们所关注。研究表明生物骨导管膜在大范围骨缺损修复的应用中，能起到隔离非骨生长的生物学环境，减少其他因素对骨形成的干扰管内也可添加对新骨形成有利的物质使得骨的修复更加快速、完整。在骨损伤的修复中，有研究证明了在以纳米纤维素为基底的生物材料中复合进促成骨细胞生长因子，便能更好的诱导骨缺损部位的再生。目前有多种类似于骨导管或机理相似的生物膜材料已经应用于筋腱、血管、关节软骨以及骨头的修复之中。已有研究表明例如改进的聚乳酸/聚乙醇酸高聚物膜、胶原蛋白与多孔钛的复合膜、壳聚糖生物电膜对于生物体内的骨损伤修复具有一定的促进作用。然而，较差的生物相容性与力学性能，以及会过早的在体内降解限制了这些材料的应用。
丝素蛋白是从蚕茧中提取的绿色可再生资源，具有良好的机械性能和优秀的生物相容性等特点而受到广大科学家的关注，丝蛋白中含有18种氨基酸，主要为甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)以及酪氨酸(Tyr)对人体的免疫反应低，是优秀的生物材料良好的力学性能和体内可生物降解性。丝素蛋白占蚕丝总量的70％～80％左右，是可再生的天然高分子材料。这使其在各种组织尤其是骨组织的修复中表现出众；羟基磷灰石作为生物骨骼中无机组分的主要成分，具有优良的生物相容性和生物活性，在体内有一定的溶解度，释放对机体无害的离子，可参与体内代谢，对新骨形成有刺激、诱导作用，可作为一种骨骼的诱导因子与材料复合制备出具有促成骨活性的支架。基于此，丝素蛋白和羟基磷灰石的复合逐渐受到研究者的重视。随着纳米技术的发展，研究者通过钙、磷交替浸泡法将含钙、磷化合物与丝素蛋白混合成功制备了丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合纳米纤维材料，可用于骨组织细胞的培养。综上所诉，酶交联的表面原位合成羟基磷灰石纳米颗粒的丝素蛋白骨导管在大范围骨缺损的修复治疗方面有良好的应用前景。
现有技术中，因丝素蛋白大分子链为两亲性分子，其溶液具有较强的环境敏感性，温度、pH、超声、有机溶剂及本身浓度较高都会引起丝素蛋白水溶液的凝胶化，且丝素蛋白分子量越大或自身浓度过高更易引起其凝胶化的出现，而溶液本身浓度又是影响材料力学性能重要因素之一。有研究者通过丝素蛋白与其他高分子材料(如：壳聚糖、聚乙二醇等)相复合从而得到力学性能较为优异的丝素蛋白复合材料，但壳聚糖、聚乙二醇的体内降解情况又是必须考虑的问题之一，因此如何提高浓度来得到优异力学性能的丝素蛋白材料是现今科学家们关注的热点之一。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，操作简单、成品率高、无毒性的方法制备丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
本发明的目的之二在于提供一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，将丝素蛋白复合羟基磷灰石材料应用于骨修复领域，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。
本发明实现目的之一所采用的方案是：一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制取丝素蛋白水溶液并浓缩至一定浓度；
(2)将所述步骤(1)制备的丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水按照一定比例混合均匀，制得混合溶液；
(3)将所述步骤(2)的混合溶液倒入模具成型，并放入28-45℃下的温度环境下交联，再放入(-18)-(-50)℃环境下冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；
(4)将所述步骤(3)的丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗除去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品；
(5)使用原位矿化的方法在所述步骤(4)的丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
本发明的制备方法通过浓缩提高丝素蛋白水溶液的浓度的方法来提高丝素蛋白材料力学性能，使本发明制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料可完全被人体吸收降解，对机体无毒。
本发明的制备方法是将辣根过氧化物酶和双氧水依次与丝素蛋白水溶液混合均匀后注入模具中并放置于一定温度下使其交联形成凝胶。随后将酶交联的丝素蛋白凝胶放入(-18)-(-50)℃条件下冷冻3～4h后浸泡在甲醇溶液中1～2h，使部分丝素蛋白大分子链形成-折叠构象，进而提高丝素蛋白材料的力学性能。最后通过溶液交替浸泡，在丝素蛋白材料上原位矿化羟基磷灰石颗粒(HAP)，从而制得丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。根据材料良好的生物相容性、优异的力学性能和能够在体内屏蔽的特点，将其应用在大范围的骨缺损修复治疗中。本发明的制备方法制得的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料具有良好的力学性能可用于大范围骨缺损的修复，丝素蛋白生物相容性好，可被人体降解吸收，降解产物为氨基酸，对机体不仅无毒性，还可有助于加快骨缺损部位的修复；原位合成在丝素蛋白基体中的羟基磷灰石具有骨诱导性，可促进成骨细胞的增殖分化，有助于骨的再生修复。
优选地，所述步骤(1)中，丝素蛋白水溶液的浓缩步骤如下：将制取的丝素蛋白水溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并在1-5℃下吹风使丝素蛋白水溶液浓缩至浓度为6wt％-30wt％。
本发明的浓缩方法在克服了丝素蛋白水溶液浓度过高会凝胶化的缺点，并且不添加稳定剂和其他高分子材料，方法简单，成本低廉，制备出了最高浓度为30wt％的丝素蛋白水溶液，为制备处高力学性能的纯丝素蛋白材料提供了基础。
优选地，所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶溶液的活性浓度为900U/mL，双氧水的浓度为0.5wt％，丝素蛋白水溶液、辣根过氧化物酶溶液和双氧水的体积比为1:0.02:0.02。
优选地，所述步骤(5)中，原位矿化的步骤如下：将所述步骤(4)的丝素蛋白成型品先在含钙离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含钙离子的溶液，再在含磷酸根离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含磷酸根离子的溶液，再在含钙离子的溶液中浸泡，如此循环多次后得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
优选地，所述含钙离子的溶液为浓度为200mM的CaCl2水溶液，所述含磷酸根离子的溶液为浓度为200mM的Na2HPO4水溶液。
优选地，所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的羟基磷灰石颗粒粒径为800～1100nm，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料中羟基磷灰石的质量百分数为9％-16％。
优选地，所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的孔径为20-40μm。
本发明实现目的之二所采用的方案是：一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，将所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料用于骨修复领域，所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料由所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法制得。
本发明的制备方法制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料无毒性，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。
优选地，所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料为导管状，将所述导管状的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料套设在骨缺损部位，作为修复材料。
优选地，所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料为膜状，将所述膜状的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料粘合成导管型套设在骨缺损部位，作为修复材料。
本发明的有益效果如下：本发明的制备方法制得的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料具有良好的力学性能可用于大范围骨缺损的修复，丝素蛋白生物相容性好，可被人体降解吸收，降解产物为氨基酸，对机体不仅无毒性，还可有助于加快骨缺损部位的修复；原位合成在丝素蛋白基体中的羟基磷灰石具有骨诱导性，可促进成骨细胞的增殖分化，有助于骨的再生修复。
本发明的制备方法简单，原料成本低廉无污染，通过提高丝素蛋白水溶液的浓度来提高丝素蛋白材料的力学性能，相比于现有通过加入其它高分子材料来提高丝素蛋白材料的力学性能的技术，本发明的制备方法制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料未添加其它高分子材料，可完全被人体降解吸收，对机体完全无毒，本发明的制备方法制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的拉伸强度最大可达到1.75MPa，完全复合骨科医用标准。
本发明的制备方法采用操作简单、成品率高、无毒性的方法制备丝素蛋白复合羟基磷灰石可以应用于骨修复领域，作为骨导管，可有效治疗连续骨缺损，且可避免自体骨提取存在的风险以及同种异体骨存在的排异反应。
通过将本发明的制备方法制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石作为骨导管，一方面，在连续性骨缺损中可将骨缺损位置包裹住(套设在骨缺损部位的两端)，为连续性骨缺损位置提供新生骨生长空间的同时，可阻止其他细胞(例如：成纤细胞)侵入骨缺损位置，从而避免结缔组织(主要由成纤细胞与胶原组合)的出现。另一方面，复合材料中羟基磷灰石可有效促进成骨细胞的分化及增殖，且本发明制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石为多孔材料有助于细胞生存中所需营养物质的运输，从而促进新生骨的形成。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料薄膜及卷曲成导管状材料的效果图；
图2为本发明实施例1制得的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的扫描电子显微镜图；
图3为本发明实施例1制得的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的X射线衍射检测数据图；
图4为本发明实施例1制得的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的力学性能数据图；
图5为本发明实施例1制得的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的吸光度数据图。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
制备丝素蛋白水溶液(SF)：蚕茧经0.005wt％碳酸钠水溶液蒸煮0.5h，进行脱胶处理，脱胶后的蚕丝溶于9.3mol/L溴化锂溶液中，经溴化锂溶解的丝素蛋白溶液经蒸馏水透析3天后浓缩处理得到不同浓度的丝素蛋白水溶液，处理得到浓度分别为6wt％、9wt％、12wt％。
具体浓缩步骤为：将提纯得到的低浓度丝素蛋白溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中；装有丝素蛋白溶液的透析袋悬挂于1-5℃环境下，并采用风扇进行吹扫加速溶液中水分的流失；经风扇吹扫36h后取出丝素蛋白溶液，并采用烘干法对浓缩后的丝素蛋白溶液进行定浓；根据定浓后的丝素蛋白溶液按照目标浓度(6wt％、9wt％、12wt％)进行稀释，最终得到不同浓度的丝素蛋白水溶液。
将浓度为6wt％、9wt％、12wt％的三组丝素蛋白水溶液分别进行以下操作，得到三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料：每毫升丝素蛋白水溶液加入900U/mL辣根过氧化物酶和0.5wt％双氧水各20μL，混合均匀后注入设计好的模具中，并放入37℃(温度范围为28-45℃，优选37℃)下交联2～3h后放入-18℃((-18)-(-50)℃，优选-18℃)冷冻3～4h，得到丝素蛋白初成型品。随后将丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液自组装再生1～2h后脱去模具，并用蒸馏水洗去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品。最后使用原位矿化的方法在丝素蛋白初成型品表面合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到矿化好的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
原位矿化的具体步骤为：准备三杯溶液CaCl2(200mM,500mL),Na2HPO4(200mM,500mL),和蒸馏水500mL；先将丝素蛋白成型品在CaCl2溶液中以200rpm浸泡搅拌1h后放入蒸馏水中水洗15min；再将丝素蛋白成型品放入Na2HPO4溶液中以200rpm浸泡搅拌1h后放入蒸馏水的烧杯中水洗15min，完成一个循环；经3循环浸泡后得到丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料可蜷曲成任意尺寸的导管型材料并使用生物相容性好的胶水或可降解丝线进行黏合固定。图1所示a为制备出的丝素蛋白复合羟基磷灰石薄膜材料，b为蜷曲成导管状的材料。
实施例2
使用扫描电子显微镜(SEM)表征实施例1制备的原位合成的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料截面形貌特征。制样方法如下：取未矿化和矿化后的丝素蛋白薄膜状样品，在液氮中脆断后于-40℃条件下真空干燥，取合适大小的样品碎片经喷金处理后，通过场发射扫描电子显微镜(FESEM，Zeiss，德国)观察水凝胶形貌并拍照，扫描电子显微镜的加速电压为7千伏。图2所示a-c为低倍数的(100×)6wt％、9wt％、12wt％三个浓度原料液制备的的酶交联丝素蛋白材料的截面扫描电镜图，d-f为对应高倍数的(500×)的扫描电镜图，g-i为矿化三次过后的材料孔隙内生长的纳米羟基磷灰石颗粒的扫描电镜图，g为丝素蛋白水溶液浓度为6wt％制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料，h为丝素蛋白水溶液浓度为9wt％制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料，i为丝素蛋白水溶液浓度为12wt％制备的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。从图中可看出随着丝素蛋白浓度的提高，材料内孔径变小；原位矿化后羟基磷灰石以颗粒状形式均匀分散在材料孔内。
实施例3
将实施例1制备的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料分别剪碎成粉末状，对其分别进行X射线衍射检测，研究复合材料中复合羟基磷灰石对材料微观结晶形态的改变。图3所示，结果表明丝素蛋白原材料为无定形结构，经甲醇再生，出现一定结晶(β-折叠)。而在丝素蛋白原材料上原位矿化羟基磷灰石后出现明显羟基磷灰石特征峰，表明羟基磷灰石的存在。
实施例4
将实施例1制备的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料材料制成长4cm，宽0.6cm，厚1mm的长条状导管，在PBS中浸泡24h后对其进行拉伸性能表征。图4所示，通过拉伸试验研究材料的力学性能。从图4应力-应变曲线中的SF-6％、SF-9％和SF-12％三条曲线和力学性能统计数据中可以得知，材料的拉伸强度随着丝素蛋白溶液浓度的增加而增强，且经原位矿化羟基磷灰石后材料力学强度得到提高，拉伸强度最高可达到1.75MPa。
实施例5
将实施例1制备的三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料骨导管放在装有小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的PBS溶液中，室温下进行培养，选取普通培养基为实验对照组。图5为三组丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的MTT细胞毒性数据，通过数据可看出丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的吸光度数据与对照组都呈现出随时间增大的情况，表明材料无生物毒性。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制取丝素蛋白水溶液并浓缩至一定浓度；
(2)将所述步骤(1)制备的丝素蛋白水溶液与辣根过氧化物酶溶液和双氧水按照一定比例混合均匀，制得混合溶液；
(3)将所述步骤(2)的混合溶液倒入模具成型，并放入28-45℃下的温度环境下交联，再放入(-18)-(-50)℃环境下冷冻处理，得到丝素蛋白初成型品；
(4)将所述步骤(3)的丝素蛋白初成型品放入甲醇溶液浸泡后再水洗除去多余甲醇，得到丝素蛋白成型品；
(5)使用原位矿化的方法在所述步骤(4)的丝素蛋白成型品上合成纳米级羟基磷灰石颗粒，得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，丝素蛋白水溶液的浓缩步骤如下：将制取的丝素蛋白水溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并在1-5℃下吹风使丝素蛋白水溶液浓缩至浓度为6wt％-30wt％。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶溶液的活性浓度为900 U/mL，双氧水的浓度为0.5wt％，丝素蛋白水溶液、辣根过氧化物酶溶液和双氧水的体积比为1:0.02:0.02。
4.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，原位矿化的步骤如下：将所述步骤(4)的丝素蛋白成型品先在含钙离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含钙离子的溶液，再在含磷酸根离子的溶液中浸泡，取出后水洗除去多余的含磷酸根离子的溶液，再在含钙离子的溶液中浸泡，如此循环多次后得到所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料。
5.根据权利要求4所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述含钙离子的溶液为浓度为200mM的CaCl2水溶液，所述含磷酸根离子的溶液为浓度为200mM的Na2HPO4水溶液。
6.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的羟基磷灰石颗粒粒径为800～1100nm，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料中羟基磷灰石的质量百分数为9％-16％。
7.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的孔径为20-40μm。
8.一种丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，其特征在于：将所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料用于骨修复领域，所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料由权利要求1-7任一项所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，其特征在于：所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料为导管状，将所述导管状的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料套设在骨缺损部位，作为修复材料。
10.根据权利要求8所述的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料的应用，其特征在于：所述丝素蛋白复合羟基磷灰石材料为膜状，将所述膜状的丝素蛋白复合羟基磷灰石材料粘合成导管型套设在骨缺损部位，作为修复材料。
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