CN104548200B - 一种制备高支化多糖‑丝素水凝胶支架的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高支化多糖‑丝素水凝胶支架的方法，属于天然高分子材料技术领域。制备方法采用将虎奶菇高支化多糖分散在NaOH和异丙醇中，与氯乙酸在60 ℃温度下经反应、冷却、中和、透析、冷冻干燥得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化多糖溶解在pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液中，用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺活化15 min～4 h，在4～37 ℃温度下与丝素溶液交联反应6～48 h后，得高支化多糖‑丝素水凝胶支架。本发明方法操作简便，所用原材料来源丰富，而且所制得的支架材料具有药物可控释放性，力学性能良好且兼有生物相容性，该高支化多糖‑丝素水凝胶支架可用于制备人工组织支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法。属于天然高分子材料技术领域，这种高支化多糖-丝素水凝胶三维贯通多孔支架可广泛应用于组织工程材料和生物医用药物可控释放等行业。
背景技术
高分子水凝胶具有一定弹性、三维贯通多孔结构,适合模拟细胞外基质、提供适合细胞生长所需的三维微环境及细胞和细胞外基质之间的生物物理信号，维持细胞正常表型与生理功能。多糖是一类可降解天然高分子，来源丰富，在组织工程及药物控制释放材料中应用广泛。天然多糖可以与蛋白质、其他多糖或其他生物大分子通过氢键或静电引力进行络合，或通过化学修饰后交联形成水凝胶。多糖水凝胶作为一种良好的支架材料，不仅仅取决于它的生物相容性，更重要的是它的独特化学结构、可生物降解性、低毒等特性，而且这些特性可被反复重新设计及改造，因此优于合成高分子水凝胶。研究证实，天然多糖及其衍生物水凝胶已可以成功将细胞植入其中，为细胞增殖及组织再生提供生长条件。目前，研制理想的人工支架材料代替器官移植手术修复组织缺损或病变，是生物材料科学和医学领域的重要课题之一。然而，在人工支架材料中，随着细胞不断生长和分化，边界处的细胞将耗尽氧气和营养物质，使得支架内部细胞坏死，从而限制均一性人工骨组织的形成。由于缺乏必要的血管组织导致较大尺寸人工组织内部得不到营养供应而坏死，因此无法满足移植手术之所需。血管化组织工程材料可维持细胞增殖、分化所需的营养物质、氧气持续供应及代谢产物的及时排出，以期满足临床应用的实际需要。值得注意的是：多糖水凝胶不仅在结构上与细胞外基质相似，更重要的是，其易于灵活调控物理性能或携带各种化学信号分子，从而诱导细胞特定的分化行为。多糖水凝胶在组织工程、药物控制释放、化妆品及日用护肤等领域具有广阔的应用前景。
正因为天然多糖水凝胶存在极大的应用价值，因此其制备及应用开发成为目前国内、外研究热点之一。目前多糖水凝胶制备主要采用海藻酸钠、壳聚糖、普鲁兰等作原料。例如：在海藻酸钠水凝胶中包埋血管内皮细胞生长因子(VEGF)可促使内皮细胞增殖和分化成毛细血管网络。中国专利公开号为CN102600493 A，公开日为2012年7月25日，发明名称为“天然普鲁兰多糖水凝胶伤口敷料及其制备方法”的申请案。该申请案公开了将天然普鲁兰多糖羧甲基化，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐将羧甲基化普鲁兰多糖与肼或二元胺交联制备天然普鲁兰多糖水凝胶伤口敷料。该方法的缺点在于：所采用的普鲁兰多糖是线性多糖，因此在药物控制释放过程中，药物在水凝胶中释放迅速，而且有机原料二元胺或肼用量很大，存在细胞毒性等问题。中国专利公开号为CN101920045A，公开日2010年12月22日，发明名称为“一种明胶-壳聚糖-透明质酸-硫酸肝素复合支架及其制备方法”申请案。该申请案公开了采用明胶、壳聚糖、透明质酸及硫酸肝素四中材料，以不同配比混合得到不同浓度的混合物，通过冷冻干燥法制取复合支架，支架成型后再用碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺和乙醇等交联、清洗，冷冻干燥后得复合三维支架。该方法的不足在于：由于采用冷冻成型后再交联，交联剂难以扩散到支架内部，，导致交联可能只发生在支架表面，支架内部和表面交联不均匀。上述方法的共同缺点是：这些多糖呈线性链构象或支化度不高，所得水凝胶支架的强度较弱，药物在水凝胶中释放迅速，因此，作为生物医用材料应用或作为药物载体时，难以支撑细胞粘附和增殖生长，并且药物释放过快，达不到预期的效果。因此急需寻求更好的制备方法或者利用其它独特结构的天然多糖作为水凝胶原料。
发明内容
针对上述技术存在的不足，本发明的目的是提供一种工艺简便，污染小，所得产品具有很好的力学性能、药物可控性释放、良好的生物相容性和生物降解性的水凝胶支架制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法，所述的制备方法包括以下步骤：
a将干燥的虎奶菇菌核粉碎，依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪，然后将去脂肪后的虎奶菇菌核浸泡在生理盐水中，在高压120℃温度下提取，离心得提取液，冷却提取液后再离心且收集残渣；残渣用去离子水离心清洗且冷冻干燥得到高支化虎奶菇多糖。
b在冰水浴条件下，将虎奶菇高支化多糖分散在20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，搅拌2h后形成虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液，其中虎奶菇高支化多糖与异丙醇的质量体积比为：60:1，20wt％NaOH与异丙醇的体积比为1:2.5。
c将氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓逐滴到经b步骤得到的虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液中，在60℃温度下反应3h，停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，其中，高支化多糖羟基与氯乙酸的摩尔比为1:5，氯乙酸与异丙醇的质量体积比为2.63:5。
d将蚕丝在0.5wt％的Na2CO3水溶液中煮沸40min，用去离子水清洗甩干后得到丝素蛋白纤维，真空干燥，干燥温度为50℃，干燥时间为12h，将干燥后的丝素蛋白纤维磨制成平均粒径3mm的丝素粉体。
e将经d步骤得到的平均粒径3mm的丝素粉体分散在9.3mol/mL的LiBr水溶液中，在60℃温度下搅拌6h配成丝素溶液，所得丝素溶液的质量体积浓度为5％。
f将经e步骤得到的丝素溶液在去离子水中透析3～7天，去除丝素溶液中的LiBr，然后在质量体积浓度为20％的聚乙二醇水溶液中透析，浓缩得质量体积浓度为15％的丝素溶液。
g将经c步骤得到的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20～60％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入到上述溶液中，搅拌15min～4h得活化体系，将活化体系加入到经f步骤得到浓度为15％的丝素溶液中，在4～37℃温度下交联反应6～48h，得高支化多糖-丝素水凝胶支架。
由于采用了以上技术方案，本发明的技术方案针对高支化多糖和丝素粉体的结构特点，制备药物可控释放且力学性能良好的高支化多糖-丝素水凝胶支架，将药物或细胞生长因子包埋在该水凝胶支架中，利用丝素蛋白与高支化多糖的含量比例来调节水凝胶的力学性能。高支化多糖的高支化结构形成的“小内腔”与水凝胶交联网络形成的贯通性“大孔腔”可调控药物或细胞生长因子以不同的速率释放，从而模拟生长因子在细胞外基质中的控制释放行为及可控诱导细胞增殖分化。此外，丝素是由结构排列规整的结晶区和疏松的非结晶区组成，其中结晶区中的有序排列的纳米纤维和短程有序排列的聚合物链性质稳定，对水凝胶的强度有良好的增强效果，而丝素蛋白中的非结晶区对水凝胶的韧性起重要作用。
本发明制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法与已有技术相比具有以下优点：
本发明制备方法具有操作简单，成本低廉，可在适合细胞生长的生理条件下原位制备水凝胶，由此制备方法得到的高支化多糖-丝素水凝胶支架，用作药物载体时可控制药物缓慢释放，提高药效；作为组织工程支架材料时可装载细胞生长因子且模拟细胞外基质控制细胞生长因子缓慢释放的功能，从而诱导细胞增殖分化成再生组织，并且丝素蛋白的存在，可大大提高水凝胶支架的力学性能。实验表明，本方法所得的高支化多糖-丝素水凝胶支架具有三维贯通的多孔结构，模型分子牛血清蛋白在该水凝胶中包埋量大，且具有良好的可控释放行为，冷冻干燥后所得的高支化多糖-丝素支架具有良好的力学性能及较高的溶胀性能。因此，该方法可广泛应用于制备人工组织支架材料，而且在药物控制释放及食品等领域也具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2，3，4，8的高支化多糖-丝素水凝胶支架的扫描电镜图片。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和应用作进一步说明：
一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法，所述的制备方法包括以下步骤：
a将干燥的虎奶菇菌核粉碎，依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取6h去除脂肪，所用乙酸乙酯和丙酮均为化学纯试剂。然后将去脂肪后的虎奶菇菌核浸泡在在80℃温度下的生理盐水中2h，离心；残渣在高压120℃温度下提取30min，在8000转的转速下离心20min得提取液，冷却提取液后再离心且收集残渣；残渣用去离子水离心清洗且冷冻干燥得到高支化虎奶菇多糖，也可采用其它方法干燥得到高支化虎奶菇多糖，用重沉淀分级法将所得的高支化多糖分成分子量不同的级分。
b在冰水浴条件下，将虎奶菇高支化多糖分散在20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，搅拌2h后形成虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液，其中虎奶菇高支化多糖与异丙醇的质量体积比为：60:1，20wt％NaOH与异丙醇的体积比为1:2.5。
c将氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓逐滴到经b步骤得到的虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液中，在60℃温度下反应3h，停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和，用pH试纸检测其pH值至pH＝7，得到产物，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，其中，高支化多糖羟基与氯乙酸的摩尔比为1:5，氯乙酸与异丙醇的质量体积比为2.63:5，所得羧甲基化高支化多糖的分子量范围为1.36′106～1.03′105。
d将蚕丝在0.5wt％的Na2CO3水溶液中煮沸40min，用去离子水清洗甩干后得到丝素蛋白纤维，真空干燥，干燥温度为50℃，干燥时间为12h，将干燥后的丝素蛋白纤维磨制成平均粒径3mm的丝素粉体，除了真空干燥外，也可采用其它干燥方法干燥水洗后的丝素蛋白纤维，干燥后的丝素蛋白纤维可采用球磨机磨制或其它方法达到所需的粒径。
e将经d步骤得到的平均粒径3mm的丝素粉体分散在9.3mol/mL的LiBr水溶液中，在60℃温度下搅拌6h配成丝素溶液，所得丝素溶液的浓度为5％，此处丝素溶液浓度为质量体积浓度。
f将经e步骤得到的丝素溶液在去离子水中透析3～7天，去除丝素溶液中的LiBr，然后在20％的聚乙二醇水溶液中透析，浓缩得浓度为15％的丝素溶液，此处聚乙二醇及丝素溶液浓度为质量体积浓度，也可采用浓度更高的聚乙二醇水溶液透析较短的时间，或者稍低浓度的聚乙二醇水溶液透析更长的时间达到浓缩丝素溶液的目的。
g将经c步骤得到的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20～60％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入到上述溶液中，搅拌15min～4h得活化体系，将活化体系加入到经f步骤得到浓度为15％的丝素溶液中，在4～37℃温度下交联反应6～48h，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，羧甲基化高支化多糖与丝素溶液的体积比为1:3，用去离子水清洗高支化多糖-丝素水凝胶且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，采用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例1
将0.9g分子量为4.81′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌15min得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在37℃温度下交联反应12h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例2
将0.9g分子量为4.81′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得40％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌15min得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在37℃温度下交联反应12h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。(此实施例为最佳实施例)
实施例3
将0.9g分子量为4.81′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得60％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌15min得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在37℃温度下交联反应12h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例4
将0.9g分子量为1.22′107的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌4h得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在4℃温度下交联反应48h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例5
将0.9g分子量为4.51′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌2h得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在25℃温度下交联反应24h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例6
将0.9g分子量为2.89′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌1h得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在25℃温度下交联反应24h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例7
将0.9g分子量为2.59′106的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌30min得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在37℃温度下交联反应12h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例8
将0.9g分子量为4.36′105的虎奶菇高支化多糖分散在50mL 20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，在冰水浴条件下搅拌2h后形成均匀悬浮液，将7.8g氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓滴加到多糖悬浮液体系中，在60℃温度下反应3h。停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将上述产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，将所得的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入上述溶液中，搅拌15min得活化体系，将活化体系加入到15％丝素溶液在37℃温度下交联反应6h后，得高支化多糖-丝素水凝胶支架，用去离子水清洗且冷冻干燥得高支化多糖-丝素三维贯通多孔支架，用扫描电镜观察冷冻干燥后支架的形貌，并用拉力机在压缩模式下测试支架材料的力学性能，在磷酸缓冲盐溶液中测试干燥后支架材料的溶胀率。
实施例1～8的高支化多糖在磷酸缓冲盐溶液中的特性见表一
表一
| 实施例 | 分子量(×105) | 均方旋转半径(nm) | 特性粘数(cm3/g) |
| 1 | 6.30 | 32.6 | 42.2 |
| 2 | 6.30 | 32.6 | 42.2 |
| 3 | 6.30 | 32.6 | 42.2 |
| 4 | 12.97 | 39.5 | 48.3 |
| 5 | 6.39 | 27.9 | 41.4 |
| 6 | 4.85 | 28.2 | 33.5 |
| 7 | 3.79 | 24.1 | 32.7 |
| 8 | 1.03 | 8.8 | 20.2 |
实施例1～8的高支化多糖-丝素水凝胶支架的性能见表二
表二
Claims (1)
1.一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
a将干燥的虎奶菇菌核粉碎，依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪，然后将去脂肪后的虎奶菇菌核浸泡在生理盐水中，在高压120℃温度下提取，离心得提取液，冷却提取液后再离心且收集残渣；残渣用去离子水离心清洗且冷冻干燥得到高支化虎奶菇多糖；
b在冰水浴条件下，将虎奶菇高支化多糖分散在20wt％NaOH和异丙醇混合溶液中，搅拌2h后形成虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液，其中虎奶菇高支化多糖与异丙醇的质量体积比为：60:1，20wt％NaOH与异丙醇的体积比为1:2.5；
c将氯乙酸溶于异丙醇中，并缓缓逐滴到经b步骤得到的虎奶菇高支化多糖-NaOH-异丙醇均匀悬浮液中，在60℃温度下反应3h，停止反应后冷却至室温，然后用0.5M乙酸溶液中和至pH＝7，将经上述反应所得的产物用蒸馏水透析，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即得羧甲基化高支化多糖，其中，高支化多糖羟基与氯乙酸的摩尔比为1:5，氯乙酸与异丙醇的质量体积比为2.63:5；
d将蚕丝在0.5wt％的Na2CO3水溶液中煮沸40min，用去离子水清洗甩干后得到丝素蛋白纤维，真空干燥，干燥温度为50℃，干燥时间为12h，将干燥后的丝素蛋白纤维磨制成平均粒径3mm的丝素粉体；
e将经d步骤得到的平均粒径3mm的丝素粉体分散在9.3mol/mL的LiBr水溶液中，在60℃温度下搅拌6h配成丝素溶液，所得丝素溶液的质量体积浓度为5％；
f将经e步骤得到的丝素溶液在去离子水中透析3～7天，去除丝素溶液中的LiBr，然后在质量体积浓度为20％的聚乙二醇水溶液中透析，浓缩得质量体积浓度为15％的丝素溶液；
g将经c步骤得到的羧甲基化高支化多糖溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液中得20～60％的溶液，将100mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和150mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺加入到上述溶液中，搅拌15min～4h得活化体系，将活化体系加入到经f步骤得到浓度为15％的丝素溶液中，在4～37℃温度下交联反应6～48h，得高支化多糖-丝素水凝胶支架。
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