DE112004002847T5

DE112004002847T5 - Verwendung von Blutplättchen oder blutblättchenreichem Plasma (PRP)

Info

Publication number: DE112004002847T5
Application number: DE112004002847T
Authority: DE
Inventors: Thomas Meury; Thierry Stoll; Mauro Alini
Original assignee: Synthes GmbH
Current assignee: Synthes GmbH
Priority date: 2004-05-05
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2007-04-05
Also published as: US20070280959A1; WO2005105121A1

Abstract

Verwendung des durch Membranauflösung gewonnenen Blutplättchen- bzw. blutplättchenreichen Plasmainhalts zur Herstellung eines Mittels für die Knochen-, Knorpel- bzw. Hautbehandlung.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Blutplättchen oder blutplättchenreichem Plasma (PRP) nach der Präambel im Anspruch 1, und ein Verfahren für die Herstellung eines Mittels für die Knochen-, Knorpel- oder Hautbehandlung nach der Präambel in Anspruch 9.
Die Freisetzung mehrerer Vermittler und Zytozine durch aktivierte Blutplättchen ist zwar bekannt, nicht aber für eine Knochen-, Knorpel oder Hautbehandlung.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verwendungsmöglichkeiten und ein viel leichteres und schnelleres Verfahren für die Aktivierung von PRP mit den von früheren Verfahren der Technik gegebenen vergleichbaren Ergebnissen zu schaffen.
Die Erfindung löst das gestellte Problem durch die kennzeichnenden Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1 und 9. Die durch dieses Verfahren erreichten Vorteile nach der Erfindung sind grundsätzlich darin zu finden, dass es bedeutend weniger Zeit beansprucht, indem es gegenüber den ungefähr 15–30 Minuten nach den Verfahren früherer Technik nur etwa eine Minute benötigt. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass keine nicht-autologen Elemente im Verfahren vorkommen.
Die Behandlung kann auf die Therapie von Knochen- Knorpel oder Hautkrankheiten und -Fehlern oder auch auf die Behebung von Schäden in bzw. bei einer Knochen- Knorpel- oder Hautersetzung gezielt sein. Die Behandlung kann auch ein Knochen-, Knorpel oder Hautwachstum aktivieren, beschleunigen oder fördern.
In einer Sonderausführung umfasst das genannte Mittel einen oder mehrere der folgenden Stoffe: der von Blutplättchen abgeleitete AB-Wachstumsfaktor (PDGF-BB), der endotheliale Gefäßbildungsfaktor (VEGF), der Wachstumswandlungsfaktor β (TGF-β), der epidermische Wachstumsfaktor (EGF), der Insulin-artige Wachstumsfaktor (IGF), der Epithelialzellen-Wachstumsfaktor (ECGF) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). Diese Stoffe verbessern die Genesung von Wunden.
Das genannte Mittel umfasst vorzugsweise keine zusätzlichen organischen Verbindungen und insbesondere keine Ionophoren, um die Toxizität auf einem niedrigen Niveau zu halten.
Das genannte Mittel sollte weder Verbindungen anderer Spezien noch anderer Individuen als der erwähnten Blutplättchen bzw. dem blutplättchenreichen Plasma (PRP) enthalten. Die Aufnahme seitens des Patienten ist durch diese Maßnahme begünstigt.
In einer Sonderausführung des Verfahrens für die Herstellung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel oder Hautkrankheiten oder Fehlern wird eine Ultrabeschallung bei einer Temperatur zwischen 0°C und +10°C, vorzugsweise zwischen 0°C und +2°C vorgenommen. Die Ultrabeschallung geschieht am besten auf Eis.
Die Ultrabeschallung kann bei einer Frequenz zwischen 10 und 30 KHz, vorzugsweise zwischen 15 und 25 KHz, vorgenommen werden.
Die Dauer der Ultrabeschallung kann 1–50 Sekunden, vorzugsweise 5–20 Sekunden betragen.
Vorzugsweise wird vor und nach der Ultrabeschallung keine andere blutplättchenstörende Behandlung unternommen.
Die ex-vivo Aktivierung von Blutplättchen bzw. blutplättchenreichem Plasma (PRP) kann auf chemischem oder physischen Wege durch den Zusatz von Rinderthrombin, wiederholten Einfrier- und Auftauzyklen oder den Zusatz eines Ionophors geschehen. Der Verwendung von Chemikalien wie Rinderthrombin oder Ionophoren ist bedenklich und die wiederholten Einfrier- und Auftauzyklen sind zeitraubend. Das für die Erzeugung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel und Hautkrankheiten nach der Erfindung bevorzugte Verfahren ist Ultrabeschallung. Ultrabeschallung hat sich als ein einfaches, aber schnelles und wirkkräftiges Verfahren für die PRP-Aktivierung erwiesen. Die Aktivierungsleistung ist mit den schon bekannten Verfahren vergleichbar, die Ultrabeschallung ist aber weniger zeitraubend als Einfrier- und Auftauzyklen und erübrigt den Gebrauch potentiell gefährlicher chemischer Mittel wie Rinderthrombin.
Die Erfindung und zusätzliche Änderungen der Erfindung werden nun in eingehendem Detail unter Bezugnahme auf eine Anzahl spezifischer Beispiele erörtert.
Beispiel 1 (Herstellung)
Ein Zitrat-Antikoagulans wurde bei 200g zehn Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die oberste Schicht wurde in ein neues Glas übertragen und bei 200g nochmals 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die obersten auf der Oberfläche schwimmenden 30–50% Blutplättchenarmes Plasma, PPP) wurden abgeschieden und das Bällchen wurde in der restlichen Schwimmflüssigkeit wieder suspendiert, um ein plättchenreiches Plasma (PRP) zu gewinnen. Das PRP wurde mit einem gleichen Volumen CaCl₂ (eine 10%-ige Endkonzentration) versetzt. Die PRP-Ultrabeschallung wurde bei Verwendung einer Frequenz von 25KHz 15 Sekunden lang auf Eis ausgeführt. Dies veranlasste die Blutplättchen, die Vermittler und Zytozine freizugeben. Das Gel brauchte zur Verfestigung eine Stunde. Sämtliche Schritte wurden unter sterilen Bedingungen vorgenommen.
Beispiel 2 (Herstellung)
Ein mit einem Antikoagulans behandeltes Blut wurde bei 150–400g, vorzugsweise 200g 10–60 Minuten lang, bei Raumtemperatur (langsame Bremseinstellung) zentrifugiert. Die Oberschicht (das Plasma) wurde in ein neues Glas übertragen und nochmals bei 500–2000g 7–10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die obersten 50–70% Volumenprozent der PRP-, plättchenarmes Plasma enthaltenden Schwimmschichten wurden abgeschieden und das plättchenreiche Plasma (PRP) wurde durch nochmaliges Suspendieren des Bällchens in der restlichen Schwimmflüssigkeit durch Verwirbelung hergestellt. Dieses Verfahren erzeugte aus 80–130ml unbehandeltem Blut 7–15 ml nichtaktiviertes PRP. Dieses PRP wurde bei 2°C–8°C bis zu 24 Stunden lang, vorzugsweise weniger als 8 Stunden lang gelagert. Dem PRP wurden 10% (Endvolumen) CaCl₂ zugesetzt, um die antikoagulierende Wirkung des Zitrats zu hemmen und die Polymerisierung des Fibrinogen zu Fibrin zu erlauben. Die PRP-Ultrabeschallung wurde bei einer Verwendung einer Frequenz von 20KHz und 2 × 5 Sekunden lang auf Eis ausgeführt. Dies veranlasste die Plättchen dazu, sich zu entkörnen und die Vermittler und Zytozine freizusetzen. Die Verfestigung des Gels benötigte 1–2 Stunden. Alle diese Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Beispiel 3
Das PRP wurde in der in den Beispielen 1 und 2 obenerwähnten Weise aus im unmittelbar voroperativen Zeitraum gesammeltem Blut hergestellt. Ein Zitrat-Antikoagulans wurde bei 200g zehn Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Es wurde bei 2°C–8°C gelagert und aus technischen Gründen (vor der PRP-Gelierung) binnen einer Stunde ab Herstellung verwendet. Das in den obigen Beispielen 1 bzw. 2 hergestellte RP wurde mit einer Injektionsspritze direkt auf einen Knochen- bzw. Knorpelfehler aufgetragen. Die aufgetragene PRP-Menge war von der Größe des Knochens bzw. Knorpelfehlers abhängig, grundsätzlich wurde aber soviel PRP als möglich eingesetzt (100 ml Blut ergaben etwa 10 ml PRP). Um die Ergebnisse zu verbessern, wurde das PRP vor der Ultraschall-Aktivierung durch Entfernung einer weiteren Menge Schwimmschicht nach der zweiten Zentrifugierungsphase (bei 200–2000g, wie im Beispiel 2 beschrieben) noch weiter konzentriert und das Plättchenbällchen wurde in einem geringeren Volumen suspendiert.
Beispiel 4
Das alleinstehende, nach Beispiel 2 hergestellte PRP, oder eine Kombination desselben mit abgesaugtem Knochenmark wurde dem Knochenimplantat als anfänglicher Wachstumsfaktor-Vorrat zugesetzt, um die rasche Vermehrung, Differenzierung, Chemotaxis und Morphogenese der Zellen und Gewebe zu regulieren. Dies ergab eine geringere Blutung und eine wesentlich erhöhte Knochenzellenzufuhr und deshalb eine raschere und bessere Heilung des derart behandelten Knochenfehlers. In den PRP-behandelten Implantaten konnte, im Vergleich zu unbehandelten Implantaten, 6 Monate nach der Implantierung bis zu 100% mehr Knochengewebe erzielt werden.
Beispiel 5 (Proteinwerte)
Die PRP-Herstellung durch Ultrabeschallung hat VEGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-β Werte ergeben, die (± 30%) mit den entsprechenden, durch die anderen Verfahren (Thrombin, Einfrieren/Auftauen) erzeugten Werten vergleichbar sind.
Beispiel 6 (in vitro)
In vitro unter Verwendung von in IMDM, 10% FBS, 10mM β-Glyzerophosphat, 0,1 mM Askorninsäure-2-Phosphat und 10% PRP gezüchteten Knochenmark-Grundgewebezellen (hBMSC) getätigte Experimente erwiesen nach 10 Tagen Kultur eine entschieden höhere (durch Einverleibung von ⁴⁵Ca²⁺ gemessene) Matrixmineralisierung als das ohne PRP gewachsene hBMSC. Der Zusatz von durch Ultrabeschallung erzeugtem PRP ergab eine bis zu 20x höhere Einverleibung von Ca, das Einfrier/Austauverfahren erwies ähnliche Ergebnisse, während ein Thrombin-aktiviertes PRP im Vergleich zu dem ohne PRP gewachsenen hBMSC eine nur 10-fache Erhöhung ergab.
In vitro Versuche erwiesen (bei denselben obenwähnten Einrichtungen) gleichfalls, dass der Zusatz von PRP zu hBMSC, unabhängig vom angewendeten PRP-Verfahren, eine 75–100%-ige Erhöhung der (durch DNA-Gehaltsmessung geschätzte) hBMSC-Vermehrung herbeiführt.
ZUSAMMENFASSUNG
Es wird eine neuartige Verwendung für den Inhalt von Blutplättchen bzw. blutplättchenreichem Plasma (PRP) offenbart, der durch die Auflösung der Blutplättchenmembranen zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel bzw. Hautgeweben gewonnen wird.

Claims

Verwendung des durch Membranauflösung gewonnenen Blutplättchen- bzw. blutplättchenreichen Plasmainhalts zur Herstellung eines Mittels für die Knochen-, Knorpel- bzw. Hautbehandlung.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung darauf gezielt ist, Kochen-, Knorpel- bzw. Hautkrankheiten und -Fehler zu heilen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung auf eine Aktivierung, Beschleunigung oder Förderung von Knochen-, Knorpel- und Hautwachstum gezielt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung auf eine Fehlerbehebung bzw. Ersetzung von Knochen-, Knorpel- und Hautgewebe gezielt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche von 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Mittel einen oder mehrere der folgenden Stoffe umfasst: von Blutplättchen abgeleiteter AB-Wachstumsfaktor (PDGF-AB), von Blutplättchen abgeleiteter AA-Wachstumsfaktor (PDGF-AA), von Plättchen abgeleiteter BB-Wachstumsfaktor (PDGF-BB), endothelialer Gefäßbildungsfaktor (VEGF), Wachstumswandlungsfaktor β (TGF-β), epidermischer Wachstumsfaktor(EGF), Insulin-artiger Wachstumsfaktor (IGF), Epithelialzellen-Wachstumsfaktor (ECGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF).
Verwendung nach einem der Ansprüche von 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Mittel keine zusätzlichen organischen Verbindungen enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche von 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Mittel keine Ionophoren enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche von 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Mittel keine Verbindungen anderer Spezies bzw. anderer Individuen als der genannten Plättchen oder dem plättchenreichen Plasma enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel- bzw. Hautkrankheiten oder -Fehler, dadurch gekennzeichnet, dass Plättchen oder plättchenreiches Plasma (PRP) bei einer Temperatur zwischen 0°C und +37°C einer Ultrabeschallung unterworfen werden, die eine Auflösung der Plättchenmembranen und eine Freisetzung ihres Inhaltes zur Folge hat.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrabeschallung bei einer Temperatur zwischen 0°C und +10°C, vorzugsweise zwischen 0°C und +2°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrabeschallung auf Eis ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche von 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrabeschallung bei einer Frequenz zwischen 10 und 30 KHz, vorzugsweise zwischen 15 und 25 KHz vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche von 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrabeschallung 1–50 Sekunden lang, vorzugsweise 5–20 Sekunden lang, vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche von 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl vor als auch nach der Ultrabeschallung keine andere Plättchenauflösungsbehandlung vorgenommen wird.