JP2019510753A - マイクロｒｎａ遺伝子を介した新規な組織工学的な神経構築及びその神経欠陥修復における使用 - Google Patents
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Abstract
Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１、又はｍｉＲ−２２２に基づく一種又は複数種のマイクロＲＮＡ遺伝子の、組織工学的神経の構築及び末梢神経欠損修復における応用。組織工学的神経移植片の外及び／又は内表面或いは空隙内部にＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２、又はその模倣物を担持した高分子材料ナノスフィアが被覆又は吸着され、前記高分子材料は生体適合性のフィブロネクチン及びヘパリンで構成される。マイクロＲＮＡ遺伝子の発現を制御して末梢神経再生と組織工学的神経構築を促進し、インビトロで初代培養したシュワン細胞の増殖を促進でき、ニューロン細胞に対する抗アポトーシス作用を有し、インビボ実験により該組織工学的神経移植片の架橋は末梢神経再生に役立ち、末梢神経欠損に使用できる。
Description
本発明は生物医学分野に属し、具体的には、組織工学的な神経構築及びその神経欠陥修復におけるマイクロＲＮＡ遺伝子の使用に関する。
末梢神経損傷は一般的な臨床的疾患であり、交通事故及び様々な偶発事故による末梢神経損傷は急速に増えている。中国経済の急速な発展に伴い、交通事故や産業事故等の偶発的な外傷による末梢神経損傷患者も年々増加している。現在、中国では、末梢神経損傷後の機能不全患者の数は約２０００万人に達し、且つ年間約２００万人の割合で増加している。末梢神経損傷は患者の生活の質に重大な影響を及ぼし、労働力喪失と医療費の増加が、社会に重大な負担を与えた。
末梢神経損傷は不随、麻痺、及び対応する身体部分の自律的制御の喪失をもたらす。神経損傷の外科的修復の効果は、現在非常に満足できるものではない。神経損傷後の特異的な軸索再生を改善するための新しい戦略が必要である。末梢神経系のニューロンは、中枢神経系のニューロンに比べて、より高い内因性再生能力を有し、適切な環境条件下で軸索を再生することができる。末梢神経再生過程は複雑で複数の要因によって制御され、良好な微小環境は神経からの再生神経に有益である。
自己由来神経移植は末梢神経損傷を修復するための重要な基準である。但し、自己由来神経ドナーの供与は困難であるため、移植はしばしば二次的損傷を引き起こし、その適用は大きく制限されている。非自己組織の架橋と移植は、同種異系又は異種組織自体が感染源を持つリスクのため、感染症を起こしやすく、同時に免疫拒絶反応があり、臨床における実際応用は限られている。
現在、自己由来神経代替物の開発は、主に組織工学的神経に注目している。組織工学的神経は一般的にはステント材料、細胞外マトリックス、種子細胞、成長因子等のいくつかの部分から構成される。神経組織の成長をより良く誘導するために、中空の神経カテーテルに線維ステント、ゲルを加え又は多くのマイクロチャネルを有する神経カテーテルとして製造するように工夫しており、研究から検証されたとおり、このような改良人工神経移植片は、充填なしの中空神経カテーテルに比べ、神経欠陥を修復できる距離をある程度で増加する。他の研究者は、生物学的材料の神経移植片に特定の細胞外マトリックス又は成長因子を結合して修復作用を強化する。研究から明らかなように、組織工学的神経は生体の病変部で再生に有利な微小環境を作り出すのに役立つ。
しかしながら、単純なステント材料、例えばコラーゲン、キトサン、及びポリグリコール酸チューブ等の材料で製造される神経カテーテルは、末梢神経欠損修復に早期使用された人工合成材料と天然材料の神経カテーテルであり、一部の製品は商品化され且つ臨床での使用が承認されるが、欠陥を修復する能力が限られ、一般的には、末梢神経欠損を短い距離で修復するためにのみ使用される。種子細胞として使用されるシュワン細胞、骨髄間葉系幹細胞等は入手しにくいこと、取得するために生体に二次的損傷を与えなければならないこと、及び免疫原性等の多くの問題がある。一方、ステント材料に添加される成長因子は安定性と効率をどのように維持するかという問題に直面する。生物学的材料の神経移植片に細胞外マトリックスを結合し修復を強化する方法は、細胞と神経カテーテルをインビトロで共培養する必要があるため、周期が長く、ステップが複雑であり、後期には脱細胞化により免疫原性を除去することを必要とし、バッチ間の一貫性を保証することは困難である。
マイクロＲＮＡｓ（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡ）は真核生物に広く見られ、内因性の小さな非コード一本鎖ＲＮＡ（２２ヌクレオチド未満の長さ）は、タンパク質翻訳の阻害又は標的ｍＲＮＡの分解により、転写を負に調節してタンパク質発現を調節する。ｍｉＲＮＡは発達及び細胞分化期に広く存在する調節因子である。
ｌｅｔｈａｌ−７（ｌｅｔ−７）マイクロＲＮＡファミリーは，最初にカエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に見つかり、脊椎動物及び無脊椎動物共に高度に保存的である。Ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡファミリーはニューロンの細胞運命を調節し、神経変性疾患や神経再生に影響を及ぼすことができる。そのファミリーの８つのメンバーであるｌｅｔ−７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅ、７ｆ、７ｉ及びｍｉＲ−９８は、坐骨神経損傷後の異なる時期での発現が基本的に同じであり、発現変化はＮＧＦと負の相関がある。Ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡファミリーはＮＧＦを直接標的に調節することにより、ＮＧＦのタンパク質翻訳を減少させ、インビトロで初代培養したシュワン細胞の増殖と移動を顕著に減少させる。坐骨神経損傷後、Ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡの発現を阻害することにより、シュワン細胞のＮＧＦ分泌及びシュワン細胞とＤＲＧニューロンの共培養による軸索成長を促進することができる。再生微小環境でＬｅｔ−７マイクロＲＮＡの発現を阻害することにより、シュワン細胞の移動と軸索成長を促進できることがインビボ動物実験結果により示されている。
ｍｉＲ−２１遺伝子は染色体１７ｑ２３．２に位置し、哺乳動物の組織器官に広く存在する。ｍｉＲ−２１遺伝子はプロトオンコジーンで、ほぼ全てのヒトがんにおける高発現を呈する。約２／３の実験研究結果から、ｍｉＲ−２１遺伝子は内因性／外因性アポトーシスに関連することを示す。ｍｉＲ−２２２は染色体Ｘｐ１１．３に位置し、多くの臨床癌患者で上方制御された発現を呈する。
坐骨神経損傷後、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２はメタロプロテイナーゼの組織阻害剤３（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３、ＴＩＭＰ３）の発現を阻害することにより、成体ラット後根神経節ニューロンのアポトーシスを減少させる。ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２はスーパーアポトーシスタンパク質ＴＩＭＰ３を直接標的する。ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２はラット坐骨神経横断損傷後の最初の７日間の内、Ｌ４−６後根神経節における１３個の差次的発現されたｍｉＲＮＡ遺伝子である。ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２は損傷後の７日間の内、継続的に発現が増加する。過剰発現ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２は標的ＴＩＭＰ３への阻害作用により、インビトロで培養した後根神経節ニューロンにおけるアポトーシスを有意に阻害し、後根神経節ニューロンの細胞活力を向上させ、ニューロン突起の成長を促進する。坐骨神経損傷後、ｍｉＲ−２１は脊髄と後根神経節で高発現を呈し、Ｓｐｒｏｕｔｙ２タンパク質発現を直接標的に低下させることで、神経突起の成長を促進する。
インビトロで培養したＤＲＧニューロンにマイクロＲＮＡ−２２２阻害剤を加えると、神経突起の成長を阻害することができる。相同ホスファターゼ−テンションホモログタンパク質（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ、ＰＴＥＮ）は、マイクロＲＮＡ−２２２が直接標的とする標的遺伝子である。ＰＴＥＮは神経再生を阻害する重要な調節因子であり、ＰＴＥＮの阻害は成体末梢神経軸索の内因性再生能力を向上させることができる。ｍｉＲ−２２２はＰＴＥＮによりｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）のリン酸化作用を調節し、ｃ−Ｊｕｎの活性化によりｍｉＲ−２２２発現を向上させ、転写レベルで末梢神経損傷後のニューロンの内因性再生能力を制御し活性化する。ｍｉＲ−２２２はＴＩＭＰ３とＰＴＥＮを直接標的するプロトオンコジーンであり、且つ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アポトーシス関連シグナル伝達経路に関連する。
今日まで、生体損傷局部マイクロＲＮＡ発現の制御と新規な組織工学的な神経構築を組み合わせ、神経再生、末梢神経欠損修復を促進する研究がなかった。
本発明は、末梢神経再生の理論的特徴に基づいて設計するものであり、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１、及びｍｉＲ−２２２発現の制御を組織工学的神経の構築に適用し、研究結果から明らかなように、神経栄養因子ＮＧＦ生成をよく調節し、神経軸索再生を促進し、シュワン細胞増殖を促進し、血管形成を調節する等の作用を有し、末梢神経再生に適切な微小環境を提供する。
更に、ナノスフィア技術により、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤（ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物（ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃｓ）をナノスフィアに包埋して、ナノスフィアとキトサンカテーテル又はシルクフィブロインカテーテルとを結合し、末梢神経欠損に対するブリッジ縫合に利用可能な、インビボで徐々に放出されてマイクロＲＮＡ発現レベルを調節するための新規な組織工学的神経移植片を形成する。
本発明における末梢神経再生促進薬物送達カテーテルシステムは、本発明の初期段階で開発されたキトサン又はシルクフィブロイン生物学的カテーテルに基づき、ナノスフィア技術により、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物をナノスフィアに包埋して、次にナノスフィアと生物学的カテーテルを結合することで、末梢神経欠損に対するブリッジ縫合に利用可能で、縫合後にインビボで緩慢に放出してＭｉｃｒｏＲＮＡ発現を調節する組織工学的神経を形成する。
本発明の具体的な手段は以下のとおりである。
ＭｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子の組織工学的神経構築と末梢神経欠損修復での応用であって、前記ＭｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子はＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１又はｍｉＲ−２２２のうちの１種又は複数種である。前記Ｌｅｔ−７ファミリーメンバーはｌｅｔ−７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅ、７ｆ、７ｉ及びｍｉＲ−９８である。
上記ＭｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子の発現を制御し、即ち、Ｌｅｔ−７ＭｉｃｒｏＲＮＡの発現を阻害し、あるいはｍｉＲ−２１又はｍｉＲ−２２２発現を向上させることで、組織工学的神経を構築して、末梢神経再生を促進する。
好ましくは、前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を末梢神経再生促進成分として組織工学的神経移植片の外及び／若しくは内表面又は空隙内部に被覆又は吸着させる。
好ましくは、前記用量は１ｇ当たりの組織工学的神経ステント材料に１０μｇ〜１０ｍｇのＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を担持する。
本発明の好ましい手段として、ナノスフィア技術により、前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物をナノスフィアに包埋する。前記マイクロスフェアはＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を担持した高分子材料ナノスフィアであり、好ましくは高分子材料は生体適合性のフィブロネクチンとヘパリンから構成され、フィブロネクチンとヘパリンとの質量比は１：１０〜１：１である。
更に好ましくは、ナノスフィアの平均直径は１００−２５０ｎｍである。
前記ナノスフィアは以下の方法で調製することができる。
適量のフィブロネクチンを滅菌純水に溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン水溶液を得て、次に、適量のヘパリンを滅菌純水に溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのヘパリン水溶液を形成する。次に撹拌下で、フィブロネクチンの水溶液をヘパリンの水溶液に加え、室温で９０分間反応させる。反応が完了した後、生体適合性架橋剤であるジェニピンを上記溶液に加えて均一に混合させ、４℃で一晩反応させ、浅青色で粒径が均一なナノスフィアを形成する。ここで、ジェニピンとフィブロネクチンとの質量比は１：５である。
ＭｉｃｒｏＲＮＡを生理食塩水に溶解させ、ＭｉｃｒｏＲＮＡの含有濃度が２５０ｎｇ／ｍＬの溶液を調製する。次にそれを上記マイクロスフェア溶液に加え、４℃で十分に撹拌混合し、２時間インキュベートしてＭｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子を担持したフィブロネクチン−ヘパリンのナノスフェア分散液を形成し、使用に備える。
本発明の前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物は、好ましくは以下の通りである。
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−３ｐ：ＣＵＧＵＡＣＡＡＣＣＵＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ：ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−５ｐ：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−３ｐ：ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＵＣＧＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ：ＧＧＣＵＣＡＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ：ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）。
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−３ｐ：ＣＵＧＵＡＣＡＡＣＣＵＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ：ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−５ｐ：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−３ｐ：ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＵＣＧＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ：ＧＧＣＵＣＡＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ：ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）。
本発明の別の目的は、外及び／若しくは内表面又は空隙内部にＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物の１種又は複数種が被覆又は吸着される組織工学的神経移植片を提供することである。好ましくは、前記組織工学的神経移植片の外及び／若しくは内表面又は空隙内部にＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を担持した高分子材料ナノスフィアが被覆又は吸着され、前記高分子材料は生体適合性のフィブロネクチンとヘパリンから構成される。好ましくはフィブロネクチンとヘパリンとの質量比は１：１０〜１：１である。更に好ましくはナノスフィアの平均直径は１００〜２５０ｎｍである。
上記組織工学的神経移植片は、本分野に一般的に使用される組織工学的神経移植片であってもよく、好ましくは神経移植片ステント又は神経カテーテルであり、ステント又はカテーテル内に空隙が分布している。好ましくはキトサン人工神経移植片であり、ステントは空隙率５０％〜９０％且つ孔径１０μｍ〜１００μｍの多孔質構造を有し引張強さが高い神経カテーテルである。
本発明は末梢神経再生の理論的特徴に基づいて設計されるものであり、Ｌｅｔ−７阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を組織工学的神経に適用し、神経栄養因子ＮＧＦ生成を調節し、神経軸索再生を促進し、シュワン細胞増殖を促進し、血管形成を調節する等の作用を有し、末梢神経再生に適切な微小環境を提供する。更に、ナノスフィア技術により、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を生体適合性のフィブロネクチンとヘパリンから構成されるナノスフィアに包埋する。フィブロネクチンとコラーゲン、ヘパリン、セルロースとインテグリンファミリーの細胞表面受容体は、例えば細胞接着、移動、血栓形成及び胚分化等、多くの細胞生物学プロセスに関与する。本発明はフィブロネクチンとヘパリンの生物学的特性を利用して、架橋によりナノスフィアを調製するものであり、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物の安定性を向上させるだけでなく、神経損傷に対して局部で緩慢に放出して濃度を維持すると同時に、細胞増殖、組織、又は器官の修復と再生を促進する作用を有する。本発明の前記ナノスフィアは生体適合性に優れ、生化学的性質が安定し、インビトロで初代培養したシュワン細胞増殖を促進でき及びニューロン細胞に対する抗アポトーシス作用を有し、インビボ実験により該組織工学的神経移植片の架橋は末梢神経再生に役立ち、末梢神経損傷の治療に用いられ得ることが示される。
以下、実施例にて本発明の具体的なステップを説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
本発明に使用される用語は、他に指示がない限り、一般的に当業者によって一般的に理解される意味を有する。
以下、実施例とデータを参照しながら本発明を更に説明する。なお、該実施例は本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
以下の実施例では、詳細に記載されていない様々なプロセス及び方法は本技術分野で周知の常法である。
以下、実施例により本発明を更に説明する。
実施例１；Ｌｅｔ−７ファミリー阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物又はｍｉＲ−２２２又はその模倣物を担持したナノスフィアの調製
本発明で選択されるＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物又はｍｉＲ−２２２模倣物の配列は以下のとおりである。
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−３ｐ：ＣＵＧＵＡＣＡＡＣＣＵＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ：ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−５ｐ：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−３ｐ：ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＵＣＧＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ：ＧＧＣＵＣＡＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ：ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）。
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−３ｐ：ＣＵＧＵＡＣＡＡＣＣＵＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ：ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−５ｐ：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−３ｐ：ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＵＣＧＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ：ＧＧＣＵＣＡＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３）；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ：ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵ、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）。
適量のフィブロネクチンを滅菌純水に溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン水溶液を得て、次に、適量のヘパリンを滅菌純水に溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのヘパリン水溶液を形成した。次に、撹拌下で、フィブロネクチンの水溶液をヘパリンの水溶液に加え、室温で９０分間反応させた。反応が完了した後、生体適合性架橋剤であるジェニピンを上記溶液に加えて均一に混合させ、４℃で一晩反応させ、浅青色で粒径が均一なナノスフィアを形成した。ここでジェニピンとフィブロネクチンとの質量比は１：５である。
上記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物のうちの１種又は複数種を生理食塩水に溶解させ、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物の含有濃度が２５０ｎｇ／ｍＬの溶液を形成した。次にそれを上記マイクロスフェア溶液に加え、４℃で十分に撹拌混合し、２ｈインキュベートしてＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物を担持したフィブロネクチン−ヘパリンのナノスフィア分散液を形成し、使用に備えた。
実施例２；マイクロスフェアを担持した組織工学的神経の調製
文献Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ、Ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｎｅｒｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｃｏｎｄｕｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．６，５３−６０，２０１６に開示された方法を参照して神経カテーテルを製造し、神経カテーテルと実施例１で製造されたマイクロスフェアを室温条件で２時間インキュベートし、物理的吸着を行い、マイクロスフェアを担持した組織工学的神経を得て、又は、神経カテーテル及びＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物のうちの１種又は複数種を、室温条件で２時間インキュベートし、物理的吸着を行い、Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物を直接担持した組織工学的神経を得た。
組織工学的神経１：Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤マイクロスフェア担持した組織工学的神経。
組織工学的神経２：ｍｉＲ−９８阻害剤マイクロスフェア担持した組織工学的神経。
組織工学的神経３：ｍｉＲ−２１模倣物マイクロスフェア担持した組織工学的神経。
組織工学的神経４：ｍｉＲ−２２２模倣物マイクロスフェア担持した組織工学的神経。
組織工学的神経５：Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、及びｍｉＲ−２１模倣物とｍｉＲ−２２２の模倣物担持した組織工学的神経。
組織工学的神経６：Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤及びｍｉＲ−２１模倣物とｍｉＲ−２２２の模倣物マイクロスフェア担持した組織工学的神経。
実施例３；インビトロでのシュワン細胞増殖促進実験
長さ１ｃｍの組織工学的神経１〜６を２ｍｌの培地（実験目的に応じて、シュワン細胞増殖実験ではＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＤＲＧニューロンアポトーシス実験では９７％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕＭＡＸを使用する）にそれぞれ完全に入れて、室温で２４時間浸漬した後、４℃で保存し、使用に備えた。
１〜２日齢の新生ＳＤラットを用い、凍結後、７５％アルコールをスプレーして消毒した後、以下のステップを培養室の滅菌クリーンベンチで実施した。大腿骨後側方の筋肉ギャップから坐骨神経を露出して分離して摘出し、予め冷却されたＨＢＳＳ溶液に入れ、解剖鏡で神経外膜を剥がした後、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ２００μｌを容れた１．５ｍｌ ＥＰ管に入れて細断し、３７℃で３０分間消化し、コラゲナーゼを除去し０．１２５％のパンクレアチンを加え３７℃で１２分間消化し、コラゲナーゼを除去して、０．１２５％トリプシンを添加して３７℃で１２分間消化し、５ｍｌ ＥＰ管に移し、シュワン細胞培養液３ｍｌを加えて、目視では組織塊が見えなくなるまで繰り返してピペットして分離し、遠心分離して上清液を捨てて、シュワン細胞培養液で二回洗浄し、１×１０６の密度で、ＰＬＬで予め被覆された培養皿に接種して、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーターに入れ、２４時間以内にシタラビン（１：１０００）を含有する培養液に変更し、２４時間後に２μＭ ｆｏｒｓｏｋｏｌｉｎ及び１０ｎｇ／ｍｌを含有するＨＲＧに変更し、３日ごとに液体を交換し、細胞が５０％コンフルエントになったとき、培地を組織工学的神経１〜６の浸漬液にそれぞれ変更し、２４時間培養し続け、０．２５％トリプシンで消化後に細胞密度を５×１０５／ｍｌに調整し、５０ｕｇ／ｍｌ ＰＩ染色液０．５ｍｌを加え、室温で遮光下３０分間染色した後、標準的な手順でフローサイトメーターによる細胞周期検出を行った。
フローサイトメーターの検出結果を図１に示す（Ａ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤マイクロスフェア群；Ｂ．ｍｉＲ−９８阻害剤マイクロスフェア群；Ｃ．ｍｉＲ−２１マイクロスフェア群；Ｄ．ｍｉＲ−２２２マイクロスフェア群；Ｅ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物非マイクロスフェアの併用群；Ｆ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物マイクロスフェアの併用群）。結果から、図Ｅと図Ｆの実験群では、増殖周期にあるシュワン細胞はそれぞれ７４．９３％及び８８．５８％であり、図Ａの６４．７１％、図Ｂの６８．５７％、図Ｃの６６．３４％、図Ｄの６０．１５％より有意に高いことを示し、このことから、複数のＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物の併用による効果は単独使用する場合より優れることが分かった。且つ、ナノスフィアとＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２模倣物を併用した組織工学的神経は、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２模倣物を直接物理的に吸着させることによるシュワン細胞への増殖作用より優れる。結論：マイクロスフェアとＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２模倣物を併用した組織工学的神経は、インビトロで初代培養したシュワン細胞増殖を促進することができる。
胚１６ｄ ＳＤラットＤＲＧ Ｌ４、５、６を、０．２５％のパンクレアチンを用いて３７℃で１５分間消化し、細胞密度１０５／ｍｌで２４ウェル培養板に接種し、インビトロで１日通常培養した後に、位相差顕微鏡で観察した結果、細胞は付着し且つ少量の神経突起は成長した。４０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで細胞を１２時間予め処理した後、組織工学的神経１〜６浸漬液で、初代培養したＤＲＧニューロンを１２時間それぞれ処理した。培養液を除去して、０．０１Ｍ ＰＢＳで一回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを加え、室温で３０分間固定させ、固定液を除去し、０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて室温で１０分間×３回洗浄した。１０％ヒツジ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−０１００を含む０．０１Ｍ ＰＢＳ液を用いて３７℃で６０分間ブロックし、ブロック液を除去した。一次抗体Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３ １：５００；Ｍｏｕｓｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｏｔａｌ ｃａｓｐａｓｅ−３ １：８００を滴下し、４℃で一晩インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで１０ｍｉｎ×３回洗浄した。二次抗体ＴＲＩＴＣ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ １：６００；ＦＩＴＣ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ １：６００を滴下し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（５μｇ／ｍｌ）で細胞核を標識し、室温、遮光下１時間放置し、０．０１Ｍ ＰＢＳで１０分間×３回洗浄した。レーザー共焦点顕微鏡（ＦＩＴＣ励起波長：４８８ｎｍ、観測波長：５００−５３５ｎｍ；ＨｏｅｃｈｓｔアルゴンイオンＡｒ励起波長：３５３−３６４ｎｍ、観測波長：４６０−４８０ｎｍ）で、免疫蛍光細胞の化学試験結果を観察した。
細胞性免疫組織化学染色結果を図２に示す（Ａ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤マイクロスフェア群；Ｂ．ｍｉＲ−９８阻害剤マイクロスフェア群；Ｃ．ｍｉＲ−２１マイクロスフェア群；Ｄ．ｍｉＲ−２２２マイクロスフェア群；Ｅ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物非マイクロスフェアの併用群；Ｆ．Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物マイクロスフェアの併用群）。図中、青色のものはＨｏｅｃｈｓｔであり、細胞核を標識し、赤色のものはｔｏｔａｌ ｃａｓｐａｓｅ−３であり、正常細胞は一般に発現されるものであり、緑色のものは活性化ｃａｓｐａｓｅ−３であり、アポトーシス細胞のみが発現する。結果から示されるように、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤マイクロスフェア群（図Ａ）、ｍｉＲ−９８阻害剤マイクロスフェア群（図Ｂ）、Ｃ．ｍｉＲ−２１マイクロスフェア群（図Ｃ）、ｍｉＲ−２２２マイクロスフェア群（図Ｄ）の免疫組織化学では、大量の緑色即ち活性化ｃａｓｐａｓｅ−３を有し、即ち細胞アポトーシスは発生し、図ＥはＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２２模倣物非マイクロスフェアの併用群であり、活性化ｃａｓｐａｓｅ−３が発現したことがあるものの、ＭｉｃｒｏＲＮＡ単独の実験群より有意に少なかった。図ＦはＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物マイクロスフェアの併用群であり、その結果、活化性ｃａｓｐａｓｅ−３の発現は見られず、即ちほぼ細胞アポトーシスは発生しなかった。結論として、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物を併用した組織工学的神経は、ＴＮＦ−αによる初代培養した後根神経節ニューロンのアポトーシスを有意に阻害できる。
実施例４；ＭｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子媒介性の新型組織工学的神経の神経欠陥修復での使用
１．動物実験のグループ分け及びモデル作成
１．１；動物実験及びグループ分け
ラットを、組織工学的神経群（実験群、実施例２に記載の組織工学的神経６）、自家神経群、キトサンマイクロスフェアカテーテル群（陰性対照群）、偽手術群（正常群）の４群（１群１５匹）にランダムに分けた。
１．１；動物実験及びグループ分け
ラットを、組織工学的神経群（実験群、実施例２に記載の組織工学的神経６）、自家神経群、キトサンマイクロスフェアカテーテル群（陰性対照群）、偽手術群（正常群）の４群（１群１５匹）にランダムに分けた。
キトサンマイクロスフェアカテーテルの製造
文献Ｋａｗａｄｋａｒ Ｊ，Ｃｈａｕｈａｎ Ｍ Ｋ．Ｉ Ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｉｐｉｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｏｆ ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ．［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，８１（３）：５６３−５７２．を参照し、濃度３０ｇ／Ｌのキトサン酢酸水溶液３ｍｌを２０ｇ／Ｌ ｓｐａｎ−８０を含む液体パラフィン４０ｍｌに滴下し、室温条件で磁気撹拌して安定したＷ／Ｏ型乳化系とした。生物架橋剤であるジェニピンを７０体積％のエタノール溶液２ｍｌで溶解させ、乳化液に滴下し架橋硬化を行った。反応が完了した後、遠心分離して分散させ、得られたキトサンマイクロスフェアを収集した。実施例１に記載のＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２の模倣物を生理食塩水に溶解させ、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物の含有濃度が２５０ｎｇ／ｍＬの溶液を形成した。次にそれを上記マイクロスフェア溶液に加え、４℃で十分に撹拌混合し、２時間インキュベートして、最後にＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物を担持したキトサンナノスフェア分散液を形成し、使用に備えた。
文献Ｋａｗａｄｋａｒ Ｊ，Ｃｈａｕｈａｎ Ｍ Ｋ．Ｉ Ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｉｐｉｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｏｆ ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ．［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，８１（３）：５６３−５７２．を参照し、濃度３０ｇ／Ｌのキトサン酢酸水溶液３ｍｌを２０ｇ／Ｌ ｓｐａｎ−８０を含む液体パラフィン４０ｍｌに滴下し、室温条件で磁気撹拌して安定したＷ／Ｏ型乳化系とした。生物架橋剤であるジェニピンを７０体積％のエタノール溶液２ｍｌで溶解させ、乳化液に滴下し架橋硬化を行った。反応が完了した後、遠心分離して分散させ、得られたキトサンマイクロスフェアを収集した。実施例１に記載のＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２の模倣物を生理食塩水に溶解させ、Ｌｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物の含有濃度が２５０ｎｇ／ｍＬの溶液を形成した。次にそれを上記マイクロスフェア溶液に加え、４℃で十分に撹拌混合し、２時間インキュベートして、最後にＬｅｔ−７ｄ阻害剤、ｍｉＲ−９８阻害剤、並びにｍｉＲ−２１模倣物及びｍｉＲ−２２２模倣物を担持したキトサンナノスフェア分散液を形成し、使用に備えた。
文献Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ，Ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｎｅｒｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｃｏｎｄｕｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．６，５３−６０，２０１６に開示された方法を参照し、神経カテーテルを製造し、神経カテーテルと上記マイクロスフェアを室温条件で、２時間インキュベートし、物理的吸着を行い、マイクロスフェアを担持したキトサンカテーテルを得た。
１．２；モデル作成
動物を麻酔薬混合物（０．２〜０．３ｍｌ／１００ｇ体重）で腹腔内注射して麻酔した。麻酔後、左大腿骨部の手術領域について、従来のように毛除去、消毒、巾敷きを行った。左大腿の後正中部に口を切り開き、皮膚と筋膜を順次切開し、坐骨神経を遊離して十分に暴露させ、大腿骨の中部から坐骨神経を切り１０ｍｍ欠損させた。組織工学的神経群（ｎＴＥＮＧ）及びシルクフィブロインカテーテル群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）では、両側神経切断端をカテーテル内に１ｍｍそれぞれ入れ、無損傷縫合糸で神経外膜を縫合し固定し、自家神経群では、切った坐骨神経を回転した後に縫合した。従来のように切開部を閉鎖した。モデル作成及び次の飼育観察はいずれもＳＰＦレベルバリアシステム内で行われた。
動物を麻酔薬混合物（０．２〜０．３ｍｌ／１００ｇ体重）で腹腔内注射して麻酔した。麻酔後、左大腿骨部の手術領域について、従来のように毛除去、消毒、巾敷きを行った。左大腿の後正中部に口を切り開き、皮膚と筋膜を順次切開し、坐骨神経を遊離して十分に暴露させ、大腿骨の中部から坐骨神経を切り１０ｍｍ欠損させた。組織工学的神経群（ｎＴＥＮＧ）及びシルクフィブロインカテーテル群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）では、両側神経切断端をカテーテル内に１ｍｍそれぞれ入れ、無損傷縫合糸で神経外膜を縫合し固定し、自家神経群では、切った坐骨神経を回転した後に縫合した。従来のように切開部を閉鎖した。モデル作成及び次の飼育観察はいずれもＳＰＦレベルバリアシステム内で行われた。
２．術後機能回復の評価
２．１；電気生理機能の検出
手術１２ｗ後、室温でラットに電気生理機能検出を行った。ラットの体重を量り、麻酔薬混合物（１００グラム体重当たりのラットに０．２〜０．３ｍｌ）を腹腔内注射し、麻酔後、坐骨神経を暴露させ、ガラス分離針で坐骨神経を慎重に分離し、複合筋活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ、ＣＭＡＰｓ）を記録した。記録電極を腓腹筋の筋腹に刺し、干渉電極をラット膝での皮膚表面に置き、刺激電極を挟みによりけがをした近、遠位坐骨神経幹に置き、神経を刺激し、ＣＭＡＰｓを記録し、ＣＭＡＰｓ振幅、潜伏期間を測定した。同じ方法で、正常側ＣＭＡＰｓの振幅と潜伏期間を記録した。ＣＭＡＰｓは神経線維が支配した標的筋の神経線維と比例し、これによりＣＭＡＰｓを測定し、末梢神経の伝達機能の回復に重要なパラメータを提供した。式ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ＝手術側ＣＭＡＰｓ最大振幅／正常側ＣＭＡＰｓ最大振幅によりＣＭＡＰｓ回復指数（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ）を計算した。
２．１；電気生理機能の検出
手術１２ｗ後、室温でラットに電気生理機能検出を行った。ラットの体重を量り、麻酔薬混合物（１００グラム体重当たりのラットに０．２〜０．３ｍｌ）を腹腔内注射し、麻酔後、坐骨神経を暴露させ、ガラス分離針で坐骨神経を慎重に分離し、複合筋活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ、ＣＭＡＰｓ）を記録した。記録電極を腓腹筋の筋腹に刺し、干渉電極をラット膝での皮膚表面に置き、刺激電極を挟みによりけがをした近、遠位坐骨神経幹に置き、神経を刺激し、ＣＭＡＰｓを記録し、ＣＭＡＰｓ振幅、潜伏期間を測定した。同じ方法で、正常側ＣＭＡＰｓの振幅と潜伏期間を記録した。ＣＭＡＰｓは神経線維が支配した標的筋の神経線維と比例し、これによりＣＭＡＰｓを測定し、末梢神経の伝達機能の回復に重要なパラメータを提供した。式ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ＝手術側ＣＭＡＰｓ最大振幅／正常側ＣＭＡＰｓ最大振幅によりＣＭＡＰｓ回復指数（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎｄｅｘ）を計算した。
実験結果を図３に示す（Ａ．キトサンマイクロスフェアカテーテル群Ｂ．本発明組織工学的神経６実験群Ｃ．自家神経群Ｄ．正常群）。結果から明らかなように、本発明の組織工学的神経６実験群のラット腓腹筋の複合筋活動電位ＣＭＡＰ及び神経伝達速度の回復状況は、キトサンマイクロスフェア群より有意に優れ、陽性対照とする自家神経群に近い。
２．３；灌流固定及び材料取得
２．３．１；灌流固定
手術４ｗ、１２ｗ後、麻酔薬混合物で麻酔したラット胸を開き、心臓を暴露させ、右心耳を突き刺し、針の先を左心室に刺して、肝臓の色が浅くなるまで生理食塩水で灌注し（灌注量が約動物体重の２倍である）、同時に腸間膜血管内液が赤色からほぼ無色になった後、等量の４％パラホルムアルデヒドを注入した。
２．３．１；灌流固定
手術４ｗ、１２ｗ後、麻酔薬混合物で麻酔したラット胸を開き、心臓を暴露させ、右心耳を突き刺し、針の先を左心室に刺して、肝臓の色が浅くなるまで生理食塩水で灌注し（灌注量が約動物体重の２倍である）、同時に腸間膜血管内液が赤色からほぼ無色になった後、等量の４％パラホルムアルデヒドを注入した。
２．３．２；材料取得
１群ごとに３匹のラットを灌流固定し、再生坐骨神経幹を取り、予冷されたグルタルアルデヒド固定液に浸漬させ、樹脂包埋及び電子顕微鏡観察に備えた。
１群ごとに３匹のラットを灌流固定し、再生坐骨神経幹を取り、予冷されたグルタルアルデヒド固定液に浸漬させ、樹脂包埋及び電子顕微鏡観察に備えた。
灌流が完了した後、体積の大きさが約０．５ｃｍ×０．３ｃｍ×０．３ｃｍの両側の完全な腓腹筋を慎重に切開して切断し、予冷された適量の後固定液（４％ＰＡ）に４℃で一晩浸漬させた。手術側の再生坐骨神経幹を慎重に切開して切断し、正常側の対応する部位から一部の坐骨神経を対照として取り、坐骨神経サンプルを取り出し段ボールに引張状態で貼付け、予冷された適量の後固定液（４％ＰＡ）に４℃で一晩浸漬させた。
２．４；サンプル処理及び観察
２．４．１；電子顕微鏡サンプルの処理
それぞれ手術４ｗ及び１２ｗ後、グルタルアルデヒドで坐骨神経及び腓腹筋サンプルを固定し、１％オスミン酸で後固定し、酢酸ウラニルで急速染色し、エタノールで勾配脱水した後、Ｅｐｏｎ８１２エポキシ樹脂で包埋した。
２．４．１；電子顕微鏡サンプルの処理
それぞれ手術４ｗ及び１２ｗ後、グルタルアルデヒドで坐骨神経及び腓腹筋サンプルを固定し、１％オスミン酸で後固定し、酢酸ウラニルで急速染色し、エタノールで勾配脱水した後、Ｅｐｏｎ８１２エポキシ樹脂で包埋した。
２．４．２；筋肉のマッソントリクローム染色
それぞれ手術４ｗ及び１２ｗ後、腓腹筋をスクロース溶液に入れ底部に沈下させた後、５％スクロース（０．１Ｍ ＰＢ調製）で包埋して、切片を凍結させて、１０μｍ横に切った。組織付着のために、切片を室温で約２４時間放置した。以下のステップに従いマッソントリクローム染色を行い、コラーゲン線維は青色、肌線維は赤色、細胞核は濃紺色になった。
それぞれ手術４ｗ及び１２ｗ後、腓腹筋をスクロース溶液に入れ底部に沈下させた後、５％スクロース（０．１Ｍ ＰＢ調製）で包埋して、切片を凍結させて、１０μｍ横に切った。組織付着のために、切片を室温で約２４時間放置した。以下のステップに従いマッソントリクローム染色を行い、コラーゲン線維は青色、肌線維は赤色、細胞核は濃紺色になった。
（１）切片をｄｄＨ２Ｏに入れて３〜５分間放置した。
（２）Ｅｈｒｌｉｃｈヘマトキシリンで２０分間染色した。
（３）ｄｄＨ２Ｏで約１分間浸漬し、１％塩酸エタノール溶液で、約１分間分別した。
（４）顕微鏡制御下、水道水で約２０分間青化した。
（５）ポンソー−酸性フクシン液で５分間染色した。
（６）ｄｄＨ２Ｏで染色液を洗浄した。
（７）１％リンモリブデン酸で５分間染色した。
（８）水洗せずに、酢酸アニリンブルー液に直接入れ５分間染色した。
（９）ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、１％氷酢酸で１分間分別した。
（１０）９５％エタノールで５分間×３回脱水し、無水エタノールで５分間×２回脱水した。
（１１）キシレンで５分間×３回透明化し、ニュートラルバルサム（Ｎｅｕｔｒａｌ ｂａｌｓａｍ）でシーリングし、室温で風乾した後に光学顕微鏡で観察した。
実験結果を図４に示す（Ａ．キトサンマイクロスフェアカテーテル群；Ｂ．本発明組織工学的神経６実験群；Ｃ．自家神経群；Ｄ．正常群、図中、赤色は肌線維、青色はコラーゲン線維としてマークする。）結果から明らかなように、本発明の組織工学的神経６実験群の肌線維の横断面積は自家神経群に近く、いずれもキトサンマイクロスフェア群より有意に高く、且つコラーゲン線維の面積百分率はキトサンマイクロスフェア群より有意に低かった。
２．５；神経組織の電子顕微鏡測定分析
（１）ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン：０．５ｇのヘマトキシリン染料を５ｍｌの無水エタノールに加えて溶解させ、１０ｇの硫酸アルミニウムカリウムを１００ｍ１の二重蒸留水に加えて溶解させ、２種の溶液を均一に混合させた後に、沸騰するまで加熱すると、０．２５ｇの黄色酸化水銀を加えた。溶解後に氷水で冷却させた。濾過後、５ｍｌの氷酢酸を加えた。（２）三色液：０．３ｇのファストグリーンＦＣＦ、０．６ｇのクロモトロープ２Ｒ及び０．６ｇのリンタングステン酸を１００ｍ１の二重蒸留水に順次加え溶解させ、更に２ｍ１の氷酢酸を加え、ｐＨ値を３．４に調整した。該染色液は室温で二週間保存でき、保存時間が長すぎ又はｐＨ値が変わった場合、染色は紫がかる。緑色が浅くなる。（３）０．３％の氷酢酸溶液は使用時に調製した。
（１）ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン：０．５ｇのヘマトキシリン染料を５ｍｌの無水エタノールに加えて溶解させ、１０ｇの硫酸アルミニウムカリウムを１００ｍ１の二重蒸留水に加えて溶解させ、２種の溶液を均一に混合させた後に、沸騰するまで加熱すると、０．２５ｇの黄色酸化水銀を加えた。溶解後に氷水で冷却させた。濾過後、５ｍｌの氷酢酸を加えた。（２）三色液：０．３ｇのファストグリーンＦＣＦ、０．６ｇのクロモトロープ２Ｒ及び０．６ｇのリンタングステン酸を１００ｍ１の二重蒸留水に順次加え溶解させ、更に２ｍ１の氷酢酸を加え、ｐＨ値を３．４に調整した。該染色液は室温で二週間保存でき、保存時間が長すぎ又はｐＨ値が変わった場合、染色は紫がかる。緑色が浅くなる。（３）０．３％の氷酢酸溶液は使用時に調製した。
Ｍｅｙｅｒ等の実験方法を参照し適切に改良した。（１）切片を従来のようにｄｄＨ２Ｏになるまで脱ろうする。（２）ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン液で５分間染色する。（３）二重蒸留水で５分間洗浄し、顕微鏡で青化程度を制御する。（４）三色液で３０分間染色する。（５）０．３％氷酢酸で２回洗浄し、１回２０秒とする。切片組織が脱色しなくなるまで、流水で５−１０分間洗浄する。（７）脱水、透明化、ニュートラルバルサム（Ｎｅｕｔｒａｌ ｂａｌｓａｍ）によるシーリングをする。
結果を図５に示す（Ａ．キトサンマイクロスフェアカテーテル群；Ｂ．本発明の組織工学的神経６実験群；Ｃ．自家神経群；Ｄ．正常群、図中、紫赤色はシュワン細胞核、緑色は神経軸索を示す。）。結果から明らかなように、本発明の組織工学的神経６実験群の再生神経幹のミエリン鞘形成状況は、キトサンマイクロスフェア群より有意に優れ、陽性対照とする自家神経群に近い。
３．データ統計
本実験はグループ設計であり、形態計量分析のデータについてＳＴＡＴＡ７統計分析ソフトウェアで一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行ったところ、グループ間の差が統計的に有意である場合、更にＴｕｒｋｅｙ’ｓ法で二つずつ比較した。得られた結果は平均値±標準偏差（Ｘ±ＳＤ）を示し、ｐ＜０．０５は差が統計的に有意であることを示す。
本実験はグループ設計であり、形態計量分析のデータについてＳＴＡＴＡ７統計分析ソフトウェアで一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行ったところ、グループ間の差が統計的に有意である場合、更にＴｕｒｋｅｙ’ｓ法で二つずつ比較した。得られた結果は平均値±標準偏差（Ｘ±ＳＤ）を示し、ｐ＜０．０５は差が統計的に有意であることを示す。
Claims (10)
- 組織工学的神経構築及び末梢神経欠損修復におけるマイクロＲＮＡ遺伝子の使用であって、前記マイクロＲＮＡ遺伝子がＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１、又はｍｉＲ−２２２のうちの１種又は複数種であることを特徴とする、使用。
- 前記マイクロＲＮＡ遺伝子の発現を制御することにより、前記末梢神経再生及び組織工学的神経構築を促進することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- 前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を末梢神経再生促進成分として、組織工学的神経移植片の外及び／若しくは内表面又は空隙内部に被覆又は吸着させることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- 前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物の組織工学的神経ステント材料での用量が、１０μｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
- ナノスフィア技術により、前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物をナノスフィアに包埋することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- 前記マイクロスフェアは、前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤又はｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２の模倣物を担持した、生体適合性のフィブロネクチンとヘパリンから構成される高分子材料ナノスフィアであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
- 前記フィブロネクチンとヘパリンとの質量比は１：１０〜１：１であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
- 前記Ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲ−２１模倣物、又はｍｉＲ−２２２模倣物は、
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４；
ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５；
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ｒｎｏ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ：ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７；
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ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−５ｐ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−９８−３ｐ：ＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−５ｐ：ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２１−３ｐ：ＣＡＡＣＡＧＣＡＧＵＣＧＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−５ｐ：ＧＧＣＵＣＡＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３；
ｒｎｏ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ：ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４；
であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。 - 組織工学的神経移植片において、外及び／若しくは内表面又は空隙内部にＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物のうちの１種又は複数種が被覆又は吸着されることを特徴とする、組織工学的神経移植片。
- 前記組織工学的神経移植片の外及び／若しくは内表面又は空隙内部にＬｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいはｍｉＲ−２１若しくはｍｉＲ−２２２又はその模倣物を担持した、生体適合性のフィブロネクチンとヘパリンから構成される高分子材料ナノスフィアが被覆又は吸着されることを特徴とする、請求項９に記載の組織工学的神経移植片。
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