TWI462741B - 使用微rna 195提供神經保護作用的方法 - Google Patents

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Description

使用微RNA 195提供神經保護作用的方法
本發明關於一種提供神經保護作用的方法，包含向一個體投予有效量的miRNA或其經修飾過的微RNA(microRNA)。尤其，神經保護作用可以用來治療和/或預防中風。
中樞神經系統(CNS)的一個關鍵特徵是分化的神經元基本上不能再生。因此十分嚴重的腦部損傷將可能造成永久喪失功能的結果。因此，需要一種手段來保護中樞神經系統的細胞在受傷後免於死亡。在中樞神經系統中對不同類型細胞的損傷，如窒息的、創傷的、毒的、感染的、退行性的、代謝的、缺血的或缺氧的損害，可能會導致感覺、運動或認知缺陷。
微RNA(miRNA)的長度約21-23核苷酸的單股RNA分子。一個miRNA會與一或多個訊息RNA(mRNA)的3端非轉譯區域(3’-UTR)互補。miRNA與mRNA之間的黏著(annealing)會抑制蛋白轉譯及/或促進mRNA的分解。近來研究顯示miRNA可能藉由影響血管平滑肌細胞(VSMCs)及內皮細胞之基因表現而在動脈粥樣硬化的進程上扮演一個關鍵性的角 色(Y.Suarez et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,14082,2008；L.Poliseno et al.,Blood 108,3068,2006；and X.Liu et al.,Circ.Res.104,476 2009 )。例如，miR-145被發現是一個存在於VSMC的一個微RNA且具調節血管內膜新生的能力(Y.Cheng et al.,Circ.Res.105,158,2009 )。急性心肌梗塞的病患中也證實有幾個在血漿的miRNA會有濃度升高的表現，表示血液中的miRNA可作為心血管疾病的生物標記(Y.D'Alessandraet al. ,Eur.Heart J. 31,2765,2010)。然而，miRNA在動脈粥樣硬化的研究中仍然處於非常早期的階段。
Xu T等人指出微RNA-195能抑制腫瘤生成並調節人類肝癌細胞於細胞週期之的G1/S轉換(Xu Tet al. ,Hepatology.2009 Jul；50(1)：113-21 )。Huaqing Zhu等人報導微RNA-195透過下調Sirt1來促進棕櫚酸誘導的心肌細胞凋亡(Xu Tet al. ,Cardiovasc Res(2011)first published online May 27,2011 )。Sekiya Y等人報導微RNA-195下調週期素E1(cyclin E)表現會導致干擾素-β抑制肝星狀細胞增殖(Sekiya Y et al.,J.Cell.Physiol.Vol.226,No.10,pp.2535-2542,2011 )。
美國專利申請第12/635,178(申請於2009年12月10日)揭露微RNA-195可用於治療動脈粥樣硬化。有幾個危險因素會增加中風的風險。藉由減少這些危險因素可以預防中風。今日藥物發現 期刊中有一篇文獻(Drug Discovery Today,Volume 17,Numbers 7/8,April 2012,pp.296-309)說明中風的預防方法。然而，該文獻也只指出對於急性中風只有少數為有效的治療(見第299頁)。該領域中熟諳此技藝者將瞭解中風的預防不等同於急性中風的治療。在美國國家中風協會(National Stroke Association)的網址 (http：//www.stroke.org/site/PageServer？pagename=treatment)可以找到關於治療中風的其他資訊。因此，發現miR-195的抗動脈粥樣硬化效果並不能將其外推到miR-195對急性中風的治療效果。
Kandiah Jeyaseelan等人報導miRNA參與調節腦的病理機制與中大腦動脈梗塞(MCAo)相關，並指出與對應的DNA微陣列數據比較顯示出標的mRNA的表現量與miRNA的調節相關(Kandiah Jeyaseelan et al.,Stroke,March 2008,pp.959-966)。該文獻亦報導在腦部缺血時，某些高度表現的miRNAs可同時在血液樣本中被檢測出；例如，在48小時再灌流的血液樣本及腦樣本中都可發現微RNA-195。然而，在其研究報告中微RNA-195的表現在不同時間點偵測卻有相反的趨勢。因此，即使是該領域中熟諳此技藝者亦無法預測在缺血性中風後微RNA-195是否具有神經保護作用。
綜上所述，沒有前案教導或暗示增加微RNA-195的表現量可引發神經保護作用的效果。
本發明驚訝地發現到增加微RNA-195可提供神經保護作用。
除非另有說明，本文中所使用之所有專門術語、符號或其他科學名詞或術語具有本發明所屬領域中熟諳此技藝者習知之含意。在某些情況下，具有習知含意之術語係在本文中界定以達到明確及/或即時參考之目的，且本文中所納入的這些定義應被解釋為不一定與該領域中習知之意義有 實質差異。本文中所敘述或引用之許多技術與程序均為大眾所習知且時常為該領域中之技術人員以常規方法使用。在適當情況下，除非另有說明，市售套組和試劑的使用程序一般均根據製造商界定的使用說明及/或參數來進行。
術語「一」及「一個」意指文章中的文法對象為一或多個(即至少一個)。
本文在申請專利範圍中所使用之術語「或」意指「及/或」，除非有明確表示要僅僅意指另一個選擇，或除非其他的選擇互相排斥。
術語「治療」意指減少病人所經歷的神經元或神經系統損害的症狀的頻率、範圍、嚴重程度及/或持續時間。
術語「預防」意指降低招致神經元或神經系統疾病的可能性。
本文中所使用之術語「個體」意指接受微RNA或微RNA擬態物治療或基於如本文中所述之類似目的而提供之治療的任何接受者。
術語miRNA、miR及微RNA可以互換使用並且意指來自內源基因具有21-23個核苷酸的非編碼RNA，作用為基因表現的後轉錄調控。彼等係經RNAse III酶Dicer由稱作miRNA前體的較長(ca 70-80 nt)髮夾狀前驅物切割而得。MiRNA組合成稱作miRNP的核糖核蛋白複合物，並且經由反義互補辨識彼等之標靶位置，從而介導彼等之標靶基因的下調。MiRNA與其標靶位置之間接近完全的互補或完全互補會造成標靶mRNA分裂，而 miRNA與其標靶位置之間有限的互補則會造成標靶基因的轉譯抑制。本文中可互換使用之「miR基因產物」、「微RNA」、「miR」或「miRNA」意指miR基因未加工或加工過的RNA轉錄物。因為miR基因產物並未轉譯成蛋白質，術語「miR基因產物」並不包括蛋白質。未加工過的miR基因轉錄物亦稱作「miR前體」且一般包含長約70-100個核苷酸的RNA轉錄物。該miR前體可經RNAse(例如Dicer、Argonaut、RNAse III(如大腸桿菌RNAse III))加工切割成21-23個核苷酸的活性RNA分子。該21-23個核苷酸的活性RNA分子亦稱作「加工過的」miR基因轉錄物或「成熟的」miRNA。
Pri-miRNA意指初級miRNA轉錄物。一開始，miRNA基因先被RNA聚合酶II轉錄成長條初級miRNA(pri-miRNA)。接著逐步分區地將這些pri-miRNA加工為最終的成熟miRNA。在動物中，pri-miRNA在細胞核中由RNase III酶Drosha加工成為70-80個核苷酸的前體miRNA(pre-miRNA)。
術語「miRNA前體」意指一源自基因組DNA的轉譯物，其包含一非編碼的結構RNA且該結構RNA包含一或多個miRNA序列。例如，在某些實施例中一miRNA前體係pre-miRNA。而在某些實施例中一miRNA前體係pri-miRNA。「pre-miRNA」或「pre-miR」意指一具有髮夾結構且含有miRNA的非編碼RNA。在某些實施例中，pre-miRNA係pri-miR經被稱為Drosha的雙股RNA特定核糖核酸酶切割後的產物。
術語「有效量」意指miRNA或其擬態物能有效抑制及/或治療及/或預 防神經元或神經系統損傷的量。例如，miRNA的有效量可預防神經元或神經系統損傷及/或在一定程度上緩解與神經元或神經系統損傷所引起的疾病相關的一或多個症狀。
本發明的其中一個面向係提供一種提供神經保護作用的方法，包含向一個體投予有效量的微RNA，該微RNA係選自miRNA-195、經修飾的miRNA-195及彼等之組合。
根據本發明，本文中所述之miRNA意指miRNA-195或其經修飾的微RNA或彼等之組合。
在一實施例中，至少一經修飾的部份包含一鍵結至胺基酸殘基的鹼基以作為骨幹單元。具有至少一鍵結至胺基酸殘基的鹼基的經修飾部份將在本文中被稱為肽核酸(peptide nucleic acid(PNA))部份。這些部份具有核酸酶抗性，並為該領域中所習知。具有PNA部份的分子通常被稱為肽核酸(Nielson,Methods Enzymol.313,156-164(1999)；Elayadi,et al,id.；Braasch et al.,Biochemistry 41,4503-4509(2002),Nielsen et al.,Science 254,1497-1500(1991))。
根據本發明，該「miRNA-195」意指一原始的miRNA-195、一經修飾的miRNA-195(例如一pre-miRNA-195，或miRNA中的嘧啶核苷酸均被彼等之2'-O-甲基類似物取代以提昇miRNA的穩定性)或一miRNA-195之擬態物(例如一合成的雙股miRNA-195)。
在一實施例中，可基於一現有的、可在細胞內裂解成miR-195的RNA種類，經過本文中所述之適當修改後，設計出可用於本發明之miR-195擬態物以及選擇miR-195擬態物之標靶序列。經修改的miR包括含有核苷酸類似物的分子，其包括在核鹼基、糖或骨幹上有添加、刪除、及/或取代的分子；以及交聯或經過化學修飾的分子。修飾過的核苷酸可能在該miR-195分子的某些部份或整條miR。例如，該miR-195分子可在下列區域被修飾(或含有修飾過的核酸)：其5'端、其3'端或兩者都有，及/或導引股(guide strand)內、過渡股(passenger strand)內或兩者之內，及/或伸出5'端、伸出3'端或伸出5'端及3'端之核苷酸內。
在一實施例中，該miRNA-195可包含一原始的人類miRNA-195(該原始的人類miRNA-195之序列為UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC，即SEQ ID NO：1)、一經修飾的人類miRNA-195，例如人類pre-miRNA-195(該人類pre-miRNA-195之序列為AGCUUCCCUGGCUCUAGCAGCACAGAAAUAUUGGCACAGGGAAGCGAGUCUGCCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCCAGGCAGGGUGGUG，即SEQ ID NO：2)或一人類miRNA-195之擬態物。
在一實施例中，該經修飾的單股微RNA分子可以是任何的微RNA分子、髮夾前體分子(hairpin precursor molecule)或上述之等同物，但前提是該經修飾的分子包含至少一經修飾的部分(moiety)(即至少一部分不是未經修飾的去氧核糖核苷酸部分或未經修飾的核糖核苷酸部分)。在此實施例中，該經修飾的微RNA分子包含最少十個部分，較佳為最少十三個部分，更佳為最少十五個部分，再更佳為最少十八個部分，且最佳為最少二 十一個部分。
該經修飾的微RNA分子較佳包含最多五十個部份，更佳為最多四十個部份，再更佳為最多三十個部分，最佳為最多二十五個部分，且最最佳為最多二十三個部分。結合上述任何最小值與上述任何最大值可得到部分之最少與最多數目的合適範圍。
各個經修飾的部分包含一鍵結至骨幹單元的鹼基。該骨幹單元可為任何能穩定鍵結至一鹼基且能形成一低聚鏈(oligomeric chain)的分子單元。在本說明書中，一經修飾部分的骨幹單元不包括通常在天然存在的DNA或RNA分子中發現的骨幹單元。
該些經修飾的微RNA分子已經增加了核酸酶抗性。因此，該分子的核酸酶抗性與僅含未經修飾的核糖核苷酸部分、未經修飾的去氧核糖核苷酸部分或上述兩者的序列相比是增加的。該些經修飾的部分係該領域中所習知並經過回顧，例如Kurreck,Eur.J.Biochem.270,1628-1644(2003)。
一經修飾的部分可出現在微RNA分子上的任何位置。例如，為了保護微RNA分子免於受到3'→5'外核酸酶的傷害，該分子可在分子的3'端具有至少一個經修飾的部分，較佳地係在3'端具有至少兩個經修飾的部分。如果希望保護該分子免於受到5'→3'外核酸酶的傷害，該微RNA分子可在分子的5'端具有至少一個經修飾的部分且較佳地係具有至少兩個經修飾的部分。該微RNA分子也可在分子的5'端與3'端之間具有至少一個經修飾的部分且較佳地係具有至少兩個經修飾的部分以增加該分子對 核酸內切酶的抗性。較佳地係至少約10%的部分被修飾，更佳地係至少約25%的部分被修飾，還更佳地係至少約50%的部分被修飾，進一步更佳地係至少約75%的部分被修飾，且最佳地係至少約95%的部分被修飾。在一實施例中，所有的部分均被修飾。
在一經修飾的微RNA分子的實例中，該分子包含至少一個經修飾的去氧核糖核苷酸部分。合適的經修飾的去氧核糖核苷酸部分為該領域中所習知。這些經修飾的去氧核糖核苷酸部分包含例如硫代磷酸化去氧核糖基團(phosphorothioate deoxyribose group)作為骨幹單元。另一個經修飾的去氧核糖核苷酸部分的合適實例為N'3-N'5醯胺代磷酸化(phosphoroamidate)去氧核糖核苷酸部分，其包含N'3-N'5醯胺代磷酸化去氧核糖基團(phosphoroamidate deoxyribose group)作為骨幹單元。
一個經修飾的核糖核苷酸部分的合適實例為在2'-氧原子及4'-碳原子間具有亞甲基橋(methylene bridge)的核糖核苷酸。一個包含在2'-氧原子及4'-碳原子間具有亞甲基橋的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常被稱為鎖核酸(locked nucleic acid(LNA))。例如見Kurreck et al.,Nucleic Acids Res.30,1911-1918(2002)；Elayadi et al.,Curr.Opinion Invest.Drugs 2,558-561(2001)；Orum et al.,Curr.Opinion Mol.Ther.3,239-243(2001)；Koshkin et al.,Tetrahedron 54,3607-3630(1998)；Obika et al.,Tetrahedron Lett.39,5401-5404(1998)。鎖核酸可購自Proligo(Paris,France and Boulder,Colo.,USA.)。本發明中之miRNA及其擬態物可以是一個「LNA修飾過的寡聚物」，其含有至少一或多個LNA單體。在一些實施例中，該LNA修飾過的miR-195序列 包括但不限於下列序列。下列序列中經過該LNA修飾的核苷酸被加上底線。
miR-195 LNA 1：UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC (SEQ ID NO：3)
miR-195 LNA 2：T AGCAGCACAGAAAUAUUGGC (SEQ ID NO：4)
miR-195 LNA 3：T AGCAGCACAGAAAT ATT GGC (SEQ ID NO：5)
miR-195 LNA 4：TA GCA GCACA GAAAT ATT GGC (SEQ ID NO：6)
miR-195 LNA 5：TA GCA GCACA GAAAT ATT GGC (SEQ ID NO：7)
在另一個實施例中，miRNA可以與一奈米粒子結合。因此，本發明提供了一種醫藥混合物，其包含一miRNA或其經修飾過並與一奈米粒子結合的miRNA。較佳地，該奈米粒子為微脂體、微胞、金屬奈米粒子或聚合物奈米粒子。奈米粒子係界定為尺寸範圍為10-1000nm的微粒分散體或固體顆粒。奈米粒子可以經自各種材料(例如脂質、蛋白質、多醣及合成聚合物)製備。根據製備方法可獲得奈米粒子、奈米球或奈米膠囊。奈米膠囊係一種系統，其中的試劑被侷限在一環繞有獨特聚合物膜的腔體中，而奈米球係一種基材系統，其中的藥物被完全均勻地分散。奈米粒子最常利用三種方法來製備：(1)分散預製的聚合物；(2)聚合單體；(3)親水性聚合物的離子凝膠化或凝聚(coacervation)。然而，文獻中亦提及製造奈米粒子的其他方法，例如超臨界流體技術及非潮溼模板中的顆粒複製(particle replication in non-wetting templates(PRINT))。
本發明中的miRNA分子可自miR前體透過自然加工路徑(例如使用完整細胞或細胞裂解物)或是藉由合成加工路徑(例如使用分離的加工酶，如分離的Dicer、Argonaut或RNAse III)取得。應瞭解到miRNA分子也可藉由生物或化學合成來直接製備而不需經過miR前體加工。當在本文中以名稱稱呼miRNA時，除非另有說明，該名稱既對應至該前體也對應至該成熟的形式。
微RNA可以在體內經由稱為Dicer及Drosha的酵素自pre-miRNA產生，該酵素會專一性地將長pre-miRNA加工為功能性miRNA。作為本發明特色的該miRNA或前體miRNA可以在體內經由基於細胞的系統合成或被化學合成。MiRNA可以被合成為包括一個修飾以給予一所希望的特性。例如，該修飾可以增強穩定性、與目標核酸的雜交熱力學、靶向至一特定組織或細胞類型、或是細胞穿透性，例如藉由一依賴內吞作用或獨立於內吞作用的機制。修飾也可增加序列特異性，從而降低靶向至位點外的機率(off-site targeting)。合成及化學修飾方法在下面將有更詳細的描述。
一miRNA或一pre-miRNA可被設計並合成為包括一非互補區(即長度為3、4、5或6個核苷酸的區域)，其兩側為足夠互補區(即長度為7、8、9、10或11個核苷酸的區域)以形成一雙鏈。該miRNA序列可包括2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧乙基、2'-O-胺丙基、2'-胺基及/或硫代磷酸酯聯接以增加核酸酶抗性及/或與目標的結合親和力。寡核苷酸骨幹中嵌入呋喃糖也可降低內核分離(endonucleolytic cleavage)。一miRNA或一pre-miRNA可進一步修飾成包括一3'-陽離子基團，或以一3'-3'聯接反轉在 3'-末端的核苷酸。或者，該3'-末端可以一胺烷基基團阻斷，例如3'-C5-胺烷基dT。其他的3'-共軛物可以抑制3'-5'的核酸外切裂解。
在一實施例中，一miRNA或一pre-miRNA包括一種增強靶向能力的修飾，例如一種上述的靶向能力修飾。讓miRNA分子靶向至特定細胞種類的修飾實例包括碳水化合物糖(如半乳糖、N-乙醯半乳胺糖、甘露糖)；維生素(如葉酸)；其它配體(如RGDS和RGD擬態物)；及小分子或其它已知的蛋白結合分子。
一miRNA或一pre-miRNA可以利用化學合成及/或利用該領域中習知之酵素接合反應(enzymatic ligation reaction)來建構。例如，一miRNA或一pre-miRNA可以利用天然生成的核苷酸或各種經過修飾的核苷酸(設計成可增加該分子的生物穩定性或增加在miRNA或pre-miRNA及目標核酸間所形成之雙鏈的物理穩定性)來被化學合成，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物及經吖啶取代的核苷酸。其他合適的核酸修飾也在本文中敘述。或者，該miRNA或pre-miRNA核酸可利用其中插入有已在反義方向次選殖的核酸的表現載體而被生物性製造，亦即，從插入的核酸轉錄出的RNA將會是感興趣的目標核酸的反義方向。
根據本發明，miRNA或其修飾可用於提供神經保護作用，即意指預防或減少神經細胞(包括神經元和神經膠細胞)死亡或損傷的能力，或是挽救神經細胞或使神經細胞復甦或復原的能力，例如在大腦、中樞神經系統或周邊神經系統之病理或有害的條件下。神經保護作用包括神經細胞的再 生，即疾病或外傷後一群神經細胞的再生長。神經保護作用係在神經系統中用來防止於急性疾病(如中風或腦部或神經系統損傷/創傷、缺氧、脊髓損傷或周邊神經損傷)後或慢性神經變性疾病(如帕金森氏症、阿茲海默症、多發性硬化症)所引起的大腦/神經元損傷或退化的機制及策略。神經保護作用的目標在於限制神經系統損傷後的神經功能障礙/死亡並試圖在大腦中保持盡可能高度完整的細胞相互作用以使神經功能不受干擾。藉由提供神經保護作用，miRNA或其變異體可用來治療神經元損傷(如中風，尤其是缺血性中風、腦損傷、缺氧、脊髓損傷或周邊神經損傷)及治療/或預防神經退化性疾病。因此，在一實施例中，本發明係關於使用微RNA作為製備用於神經細胞再生之藥物中的活性成分。換句話說，本發明係關於用於神經細胞保護及/或再生之微RNA。同樣地，本發明係關於一種保護及/或再生神經細胞的方法，包含向一有需要之個體投予有效量的微RNA或其擬態物。
神經保護作用可藉由例如測量神經元死亡的延遲或預防來直接測定，像是例如在培養的大腦皮質神經細胞中給予壓力後凋亡神經元的數目減少。神經保護作用也可藉由例如在經過該壓力後測量神經系統之組織或器官遭受損害的嚴重性或程度或功能喪失來直接測定，像是例如測量中大腦動脈梗塞(MCAO)或再灌流損傷後腦栓塞大小的減少程度。神經保護作用也可藉由核磁共振造影(測量大腦體積、神經纖維追蹤(tractography)、由光譜看出的N-乙醯基-天門冬鹽酸(N-acetyl-asparte)濃度)或是藉由光學同調成像的視網膜成像(視神經纖維層細化)或視網膜光譜(細胞色素 C、氧合血紅素、乳酸、麩胺酸鹽、iNOS的濃度)來判定。或者，神經保護作用可藉由偵測用於保護神經元的一或多個生物學機制是否活化來間接地判定，包括但不限於偵測Sema3路徑的活化或減少產生自神經元中iNOS的NO的過量生產以停止神經細胞死亡。
根據本發明，該miRNA-195具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示之序列。在另一實施例中，miRNA或其變異體與一奈米粒子結合。較佳地，該奈米粒子為微脂體、微胞、金屬奈米粒子或聚合物奈米粒子。
在一特定實施例中，微脂體係用來將miRNA產物傳送至一個體。微脂體也可增加核酸的血中半衰期。用於本發明的合適微脂體可自標準的成囊泡脂質(vesicle-forming lipid)形成，其通常包括中性或帶負電的磷脂和固醇，如膽固醇。脂質的選擇通常會考慮一些因素，如想要的微脂體大小以及微脂體在血流中的半衰期。用於製備微脂體的各種方法為習知，例如如同在美國專利第4,235,871、4,501,728、4,837,028及5,019,369號中所述，其全部公開內容皆併入本文中作為參考。
經抑制調理作用部分修飾之微脂體留在循環系統中的時間遠久於未經修飾之微脂體。出於這個原因，該些微脂體有時也被稱為「隱形」微脂體(stealth liposome)。已知隱形微脂體會由多孔或「有漏洞」(leaky)的微血管漏出而積聚在組織中。因此，特色為該種微血管缺陷之組織(例如固態腫瘤)將會很快地累積這些微脂體，見Gabizon,et al.(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,18：6949-53。
用於本發明方法中的微脂體可包含一將該微脂體靶向至目標細胞的配體分子。用於本發明方法中的微脂體也可被修飾以避免被單核巨噬細胞系統(MMS)及網狀內皮系統(RES)清除。該些經修飾的微脂體在表面上具有抑制調理作用的部分，或者該抑制調理作用的部分併入到微脂體結構中。在一特定較佳的實施例中，本發明的微脂體可同時包含一抑制調理作用的部分及一配體。
因此，本發明發現miRNA-195在提供神經保護作用上有一些有益的作用和功能，使得miRNA-195可以用來治療神經元或腦損傷以及治療/或預防神經退化性疾病，包括急性或慢性神經變性疾病。
本文中所使用之術語「神經退化性疾病」也用來描述一種由中樞神經系統的損害所引起之急性、漸進性或慢性疾病，且該損害根據本發明可通過微RNA治療來減少及/或減輕，微RNA可直接投入但較佳地係經過全身途徑以允許細胞或其可溶性因子達到病人腦和/或脊髓的受損區域。術語「急性神經退化性疾病」意指突然發生的疾病或病症，其導致相關的神經元死亡或損傷。作為示例的急性神經退化性疾病包括腦血管供血不足(cerebrovascular insufficiency)、局灶性或瀰漫性腦外傷、脊髓損傷、大腦缺血或梗塞(包括栓塞性阻塞(emolic occlusion)及血栓性阻塞(thrombotic occlusion)、週產期之缺氧缺血腦病變(perinatal hypoxic-ischemia)、新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxia-ischaemic encephalopathy)、新生兒周產期窒息(perinatal asphyxia)、心臟驟停(cardiac arrest)、顱內出血(intracranial hemorrhage)、蜘蛛膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage)、中風及創傷性腦 損傷(traumatic brain injury))。在一實施例中，該神經退化性疾病為顱內出血或蜘蛛膜下腔出血。蜘蛛膜下腔出血(SAH)意指血液進入蜘蛛膜下腔一蜘蛛膜與軟腦膜之間環繞腦部的區域。這可能會自發性地發生，通常源自於腦動脈瘤破裂，或可能源自頭部損傷。SAH的症狀包括突發的劇烈頭痛、嘔吐、混亂(confusion)或意識水平下降，有時會癲癇發作。診斷時通常以頭部CT掃描確認，或偶爾會以腰椎穿刺確認。治療係藉由快速的神經外科手術或伴隨藥物的放射線導引介入性治療以及其他治療以幫助預防復發的出血和併發症的復發。SAH是一種急症(medical emergency)並可能導致死亡或嚴重殘疾一即使在早期階段便識別和治療。經歷SAH存活的病人往往有神經上或認知上的功能障礙。
可利用本發明方法治療的神經退化性疾病範例包括但不限於帕金森氏症、杭丁頓症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、阿茲海默症、雷特氏症(Rett Syndrome)、溶素體儲積病(lysosomal storage diseases)(例如如同Folkerth,J.Neuropath.Exp.Neuro.,September 1999,58：9中所述之「白質病(white matter disease)」或神經膠質脫髓鞘症(glial demyelination disease)」)，包括聖菲利柏氏症(Sanfillippo)、高雪氏症(Gaucher disease)、戴薩克斯症(Tay Sachs disease)(β-己醣胺酶缺乏症)、其他的遺傳性疾病、多發性硬化症、缺血引起的腦損傷或創傷、意外事故、來自環境的傷害等等、脊髓損傷、運動失調(ataxia)及酒精中毒。此外，本發明可用於減少及/或減輕中風或心臟病發作的病人對中樞神經系統的影響，或者該影響係因病人的血流量不足或腦部中某個位點缺血所造成，或 者來自腦及/或脊髓的物理損傷。神經退化性疾病亦包括神經發展障礙症(neurodevelopmental disorder)，包括例如腦性麻痺(cerebral palsy)、自閉症及相關神經疾病如在眾多疾病之中的精神分裂症。
本發明進一步提供一種預防或治療神經元退化性疾病(如阿茲海默症(Alzheimer's dementia(AD))或帕金森氏症(Parkinson disease(PD)))的方法，該方法包含提供該mir-RNA、mir-195擬態物以在一個體或病人中抑制Sema3A的表現、累積或活性。
預防或治療AD或PD的方法包含向需要該種治療之病人投予一有效量的mi-RNA或一個mi-RNA物質，該mi-RNA會抑制Sema3A的表現、累積或活性。
一「個體」或「病人」係一可能發展AD或PD的人類或動物，更特定為哺乳類，較佳地為人類、囓齒類動物或靈長類動物，如上面在診斷應用中所述。術語「預防」意指預防AD或PD的發生，即意指預防性地干預造成該疾病的病理機制。在本發明內文中，這樣的病理機制可為Sema3A表現或累積的增加。該病人可為一發展該疾病之風險增加的個體。舉例來說，對於AD而言，該個體可能具有發展澱粉樣變性病(amyloidosis)的遺傳易染病體質，例如來自家族中有成員帶有家族性AD(familial AD(FAD))的人。或者，某人在他(她)七、八十歲時有較高的風險罹患年齡相關性阿茲海默症。
本文中所使用之術語「治療有效量」意指一足夠量或足夠劑量的 miRNA(例如mir-195)，其可減少Sema3A活性程度，例如，減少約10%，較佳約50%且更佳約90%。較佳地，一治療有效量可改善或呈現臨床上有意義地Sema3A的活性、功能和影響的衰退。或者，一治療有效量的miRNA(例如mir-195)足以造成經投予的病患在臨床顯著條件上的改善。
Mir-195的抑制活性可藉由其他細胞內信號傳遞的合作夥伴-CDC42和其下游動器(例如上調的BCL2和下調的半胱天冬酶3(Caspase 3))直接對抗Sema3A以預防神經元凋亡。
在一實施例中，本發明中的miRNA展示了抗發炎特性，可保護神經元免於各種細胞壓力(如興奮性毒性和氧化壓力(oxidative stress)等等)、脊髓損傷、運動失調和酒精中毒，證實了在哺乳動物CNS中會保護數量最多的非興奮性星狀細胞。
在關於活化星狀細胞介導的神經細胞死亡的進一步實例中，本發明的miRNA減少神經元中經由iNOS產生的NO的過度生產，以停止神經細胞死亡。
本發明的miRNA利用活性含氧物產生與抗氧化劑活性之間的不平衡(稱為氧化壓力)來作為有力的自由基清除劑以及抗發炎藥物，並在LPS誘導的iNOS表現測試中證實可減少iNOS活性。因此，本發明的miRNA會減輕神經元損傷導致的缺氧性傷害，並與各式各樣的人類CNS退化性疾病(包括阿茲海默症、帕金森氏症)與病理狀態(如局部缺血)牽連。
本發明的miRNA進一步關於任何合適的局部缺血的治療。本文中所提及之局部缺血(ischemia)係指到器官及/或組織的血流量減少。減少的血流量可能由任何適當的機制所引起，包括一或多條供應血液至該器官及/或組織的血管之部分或全部堵塞(梗塞)、變窄(收縮)及/或缺口/破裂等等。因此，局部缺血可能由血栓、栓塞、動脈粥狀硬化、高血壓、出血、動脈瘤、手術、創傷、藥物及/或其類似物所引起。因此減少的血流量可能為慢性的、短暫的、急性的、偶爾發生的及/或與上述類似的性質。
本發明進一步的目標係提供中風的治療。本文中所提及之中風係因血液供應到部份(或全部)腦部減少所產生之腦缺血。中風產生的症狀可能是突然的(如失去知覺)，也可以是一個為期數小時或數天的漸進式發病。此外，該中風可能是重大的腦缺血發作(全面中風(full stroke))或較輕微的短暫性腦缺血發作等。中風產生的症狀可能包括例如半身輕癱、半身不遂、一側麻木、一側無力、一側麻痺、暫時的四肢無力、四肢發麻、神智不清、說話困難、無法理解別人說的話、單眼或雙眼無法看到、視力模糊、視力減退、行走困難、頭暈、容易跌倒、喪失協調性、突發劇烈頭痛、呼吸聲嘈雜及/或意識喪失。或者，或是此外，症狀可能更容易被檢測出或只能透過試驗及/或儀器檢測，例如缺血試驗(如改變的白蛋白，特別是蛋白異構體、損壞的蛋白質等)、心電圖、腦電圖、運動壓力測試及/或彼等之類似物。
本發明之miRNA提供缺血個體治療以減輕缺血對該個體造成的傷害。本文中所提及之缺血個體係任何有局部缺血、缺血相關病況、缺血歷 史及/或在治療開始之後及在治療仍然有效的一段時間期間內有顯著機會發展缺血之人(人類個體)或動物(動物個體)。
缺血治療對象的選擇可以用任何合適的標準來選擇。標準的範例可能包括任何可檢測出的缺血症狀、缺血歷史、增加(或減少)缺血風險的事件(如外科方法、創傷、藥物投予等)及/或其類似物。缺血歷史可能涉及一或多個先前的缺血性發作。在一些實例中，選擇治療的個體可能在治療開始前的至少約一、二或三小時有出現缺血發作，或是在治療開始前少於約一天、十二小時或六小時內有多個缺血性發作(如暫時性腦缺血)。
一該領域中之熟習技藝人士可藉由考慮如以下之因素：個體的大小和重量；疾病的嚴度程度；該個體的年齡、健康和性別；給藥途徑；和投予為局部或全身，以決定要投予給一給定個體之miRNA產物的有效量。例如，決定miRNA的有效量可基於要投予個體的重量。一基於個體重量的miRNA的有效量範圍可自約1.0奈莫耳(nanomole)/公斤至約15.0奈莫耳/公斤。較佳地，該量係約3.0至約10.0奈莫耳/公斤或約3.0至約7.0奈莫耳/公斤。更佳地，該量係約3.3至約6.6奈莫耳/公斤。
一該領域中之熟習技藝人士亦可輕易地測定在投予分離的miRNA產物至一給定個體時適當的劑量用法。例如，一miRNA可投予至該個體一次或兩次。當一劑量用法包含多次投予時，可瞭解到投予至該個體的miRNA的有效量可包含全部劑量用法期間投予的產物總量。
一miRNA亦可透過任何合適的腸內或腸外給藥路徑投予至一個體。 本方法中合適的腸內給藥路徑包括如口服、直腸、或鼻內給藥。合適的腸外給藥路徑包括如血管內給藥(例如靜脈單次全劑量注射(intravenous bolus injection)、靜脈輸液、動脈內單次全劑量注射、動脈灌注及導管滴注至血管)；組織周圍和組織內注射(例如肌肉內注射、腫瘤周圍和瘤內注射、視網膜內注射或視網膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(如透過滲透幫浦)；直接投予至感興趣的組織，例如透過導管或其他的放置裝置(例如一視網膜顆粒(retinal pellet)或栓劑或包含一多孔、非多孔、或者凝膠狀物質的植入物)；以及吸入。特別合適的給藥路徑為注射、輸液和直接注射到目標。
本文引用的所有出版物的相關教導，若沒有明確地被納入參考，其全部內容仍併入本文中作為參考。雖然本發明已經特別展示及描述供參考的較佳實施例，那些該領域中熟習技藝之人士將瞭解到，在不脫離所附的權利要求包含的本發明範圍的情況下，可以在其中進行形式和細節上的各種改變。
圖1顯示氧糖去除(OGD)3小時及6小時的細胞存活率減少(A小圖)，且經OGD誘導的SH-S5Y5細胞中內生性miR-195下降(B小圖)。
圖2顯示miR-195在OGD 3小時及6小時後增加細胞存活率的效果。細胞存活率在第24小時測量。
圖3顯示miR-195影響幾個參與凋亡路徑的基因的表現。MiR-195增 加了抗凋亡基因(BCL2)的表現但抑制兩個凋亡基因(半胱天冬酶3和FasL)。此外，miR-195對這些基因具有劑量依賴效應。
圖4顯示miR-195在星狀神經膠細胞中對LPS誘導的前發炎反應的效果。
圖5顯示由奈米粒子(NP)攜帶的miR-195在預防OGD後的細胞死亡具有劑量依賴效應。
圖6顯示抑制Sema3A及Cdc42的基因表現會增強SH-S5Y5細胞存活率。
圖7顯示miR-195在調節Sema3A及Cdc42的蛋白濃度上具有劑量依賴效應。
圖8顯示對誘導中風30分鐘後的中風大鼠靜脈內注射由微脂體攜帶的miR-195(1.65-6.6 nanomole/kg；在本發明中，50 nM等同於3.3 nanomole/kg)後減少腦部受損為劑量依賴效應。以大腦總體積的百分比來定量呈現梗塞體積。NC表示一隨機打亂序列的miR。
圖9顯示對誘導中風120分鐘後的中風大鼠靜脈內注射由微脂體攜帶的miR-195(3.3 nanomole/kg；在本發明中，50 nM等同於3.3 nanomole/kg)。
圖10顯示對中風大鼠靜脈內注射LNA1。以大腦總體積的百分比來定量呈現梗塞體積。NC表示一隨機打亂序列的miR。
 實例1 MiR-195的神經保護作用分析試驗
測試miR-195在氧糖去除(oxygen-glucose deprivation(OGD))的神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)中的神經保護效果，作為神經元損傷的體外模型。在OGD 6小時後，miR-195內生性的表現顯著減少(62%)(見圖1B)，且與控制組相比，OGD 3小時後SH-SY5Y的細胞存活率減少35%而OGD 6小時後減少55%(見圖1A)。為了測定miR-195在OGD下SH-SY5Y之保護效果中扮演的角色，用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen,CA,USA)將miR-195擬態物轉染進細胞中。用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT；Sigma-Aldrich,MO,USA)評估miR-195誘導的細胞存活率程度。MiR-195擬態物(濃度在25-100 nM之間)在OGD 3小時和6小時後對細胞存活率的治療效果顯示於圖2。如圖2所見，miR-195在挽救損傷細胞時有劑量依賴效應。因此，該體外研究顯示出miR-195具有神經保護的潛力。
為了研究miR-195對凋亡訊息傳遞路徑的影響，也用西方墨點法評估在OGD誘導的SH-SY5Y細胞死亡中B細胞淋巴瘤2(BCL-2)、Fas配體(FasL)和半胱天冬酶3蛋白濃度的變化。結果發現miR-195的處理會增加SH-SY5Y中Bcl-2(一種抗凋亡因子)的蛋白濃度。MiR-195的處理也大大地降低了凋亡因子FasL和半胱天冬酶3的蛋白濃度(圖3)。
脂多醣(LPS)誘導的星狀神經膠細胞增生(astrogliosis)：經LPS刺激的初代培養的星狀神經膠細胞係一廣泛被接受的體外模型，用來模擬星狀神經膠細胞在腦損傷(包括中風)時的再活化。星狀神經膠細胞中的誘導型一氧化碳合成酶(iNOS)有助於大腦的發炎反應。iNOS可以在缺血性中風後重新被誘導。在缺血性中風的囓齒類動物模型中抑制iNOS活性或iNOS基因缺失提供了神經保護作用。缺血會誘導出COX-2且COX-2在腦損傷後具有興奮性毒性。為了研究miR-195對初代星狀神經膠細胞的影響，將小鼠麻醉然後斷頭。小心地移出大腦皮層並使其均勻化。稀釋細胞懸浮液，將細胞接種在燒瓶中。藉由軌道搖動燒瓶移除小神經膠質細胞和寡樹突細胞。倒出懸浮的細胞以得到附著在底部的純星狀神經膠細胞層。將純化的星狀神經膠細胞進行繼代培養，然後用LPS處理1小時。使用即時PCR以測量誘導型一氧化碳合成酶(iNOS)及COX-2的mRNA濃度。使用西方墨點法以測量iNOS及COX-2的蛋白表現(見圖4)。結果發現miR-195可減少有害的iNOS及COX-2，在星狀神經膠細胞中發揮神經保護作用。
接著，我們使用攜帶有miR-195的奈米粒子(NP-miR-195)來重複相同的OGD細胞研究。在OGD 6小時後，用細胞毒性檢測套組(乳糖脫氫酶，LDH；Roche)分析細胞死亡的資料。6小時的OGD有力地促進了LDH分泌，比基礎濃度多了47%。然而，在NP-miR-195的存在下LDH被有效地抑制49%(25 nM；圖5)。
此外，使用靶向至Sema3A的shRNA(shSema3A)以抑制Sema3A和下游的Cdc42的基因表現，來證實細胞存活率增加。結果顯示抑制Sema3A的基因表現會增強SH-S5Y5的細胞存活率(見圖6)。圖6中，(A)用定量即時PCR測定Sema3A mRNA濃度的改變。(B及C)用細胞計數和LDH的釋放來測量經OGD處理的細胞存活率。(D)用定量即時PCR測定在經3小時及6小時OGD處理的細胞中被shSema3A抑制的Cdc42 mRNA。數據為三個實驗的平均值±SD；*P<0.05及**P<0.01，控制組細胞未暴露在OGD下。使用隨機打亂序列的shRNA作為轉染對照組。以miR-195擬態物或NC-miR轉染經OGD處理3小時或6小時的Sh-S5Y5細胞。在培養第24小時時用西方墨點法檢測細胞中的Sema3A、Cdc42及Nrp-1蛋白濃度。圖7顯示MiR-195會調節Sema3A及Cdc42的蛋白濃度。
實例2 奈米粒子攜帶的miR-195的體內神經保護作用分析試驗
使用SD雄鼠(280至350g)，以先前報導的手術方法誘導中大腦動脈梗塞(MCAO)(Candelario-Jalil,E.et al.Effects of the cyclooxygenase-2 inhibitor nimesulide on cerebral infarction and neurological deficits induced by permanent middle cerebral artery occlusion in the rat.J.Neuroinflammation 2,3,2005 )。將一個尖端經過矽修飾的3-0尼龍細絲(Spratt,N.J.et al.Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats.J.Neurosci.Methods 155,285-290,2006 )插入右頸總動脈(CCA)上的一個小缺口並且推進到超出頸動脈分叉處約22 mm。之後，沿著CCA吻端到 該缺口紮好手術縫合線以固定該尼龍細絲並封住血管。以手術縫合線關閉皮膚切口並用抗生素軟膏局部治療。奈米粒子由於其粒徑小，使得它們較容易通過血腦屏障，因此已被提倡作為一個中樞神經系統疾病理想的藥物載體。微脂體奈米粒子作為一種更理想的藥物載體，被用來攜帶miR-195。在本研究中，使用市售的微脂體來攜帶miR-195。該市售的微脂體奈米粒子係將miR-195併入一半乾燥製劑，其係由天然脂質、非離子清潔劑、油和小分子所組成，來自MaxSuppressor體內RNALancerII套組(BIOO Scientific,Inc.)。簡而言之，在套組的單一玻璃皿中，於無菌無RNA酶的10X PBS存在下，混合微脂體乳液(liposome emulsion)和miR-195(100 μg)(1：2 w/w miR-195-磷脂-乳化油)至一儲存濃度10-20 mg/mL。為了增加包囊效率並減少微脂體的大小，將微脂體乳液在室溫下超聲波水浴中高頻聲波分裂5分鐘。
奈米粒子的實驗結果顯現大有可為且令人興奮。詳細的流程如下：在由MCAO誘導的中風30分鐘或2小時後，經尾靜脈注射(量的大小為150 mm3 )靜脈內(i.v.)投予微脂體所攜帶之配製好的miR-195。
處理二十四小時後，將大鼠安樂死並斷頭。收集大鼠大腦並切成2 mm的冠狀切面，並以0.1%的2,3,5-氯化三苯四銼(TTC)染色(Joshi,C.N.,Jain,S.K.& Murthy,P.S.An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts.Brain Res.13,11-17,2004)。以平台掃瞄器掃描染色好的大腦切片。根據Lin等人的方法，以ImageJ(version 1.40,NIH,Bethesda,MD,USA)測量和處理梗塞的區域(Lin,T.N.,He,Y.Y.,Wu,G., Khan,M.& Hsu,C.Y.Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats.Stroke 24,117-121,1993 )。
測量梗塞的區域。當miR-195在誘導中風的30分鐘後投予，劑量為3.3 nanomole/kg的處理可減少梗塞體積40%，而劑量為6.6 nanomole/kg的處理可減少梗塞體積60%(見圖8)。當miR-195在誘導中風的2小時後投予，劑量為3.3 nanomole/kg的處理仍可減少梗塞體積40%(圖9)。
根據上述提及的大鼠體內神經保護作用分析試驗，使用本發明經LNA修飾的微RNA 195處理中風大鼠。結果顯示經LNA修飾的微RNA 195(如LNA1、LNA2、LNA3、LNA4及LNA5)提供了顯著的治療效果。如圖10所示，與隨機打亂序列的LNA-NC-miR相比，LNA1的平均治療效果為減少梗塞體積30%，而LNA5甚至可減少梗塞體積58%。
<110> 高雄醫學大學
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Claims (25)

  1. 一種微RNA在製備用於提供神經保護作用的藥物的用途，其中該微RNA係選自微RNA-195、經修飾的微RNA-195及彼等之組合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA具有選自SEQ ID NOs：1-7之序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該經修飾的微RNA-195係經鎖核酸(LNA)修飾的微RNA-195。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA係選自由以下所組成之群組：a. 具有SEQ ID NO：3之序列並且在第20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；b. 具有SEQ ID NO：4之序列並且在第1、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；c. 具有SEQ ID NO：5之序列並且在第1、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA； d. 具有SEQ ID NO：6之序列並且在第1、2、5、10、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；及e. 具有SEQ ID NO：7之序列並且在第2、5、10、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之序列。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA的用量範圍係從1.0至10.0奈莫耳/公斤。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA的用量範圍係從3.0至10.0奈莫耳/公斤。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA係得自其擬態物。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA可與一奈米粒子結合。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該奈米粒子係微脂體、微胞、金屬奈米粒子或聚合物奈米粒子。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該奈米粒子係微脂體。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係透過抑制Sema3A的表現或累積。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係透過抑制或預防神經元凋亡。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係透過抗發炎效果來保護神經元免於細胞壓力。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該壓力係興奮性毒性壓力、氧化壓力、或由脊髓損傷、運動失調或酒精中毒所造成之壓力。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係透過減少NO的過度生產。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該微RNA係用來作為自由基清除劑或抗發炎藥物。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係與神經元損傷或腦損傷或神經退化性疾病相關。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之用途，其中該神經退化性疾病係急性或慢性神經退化性疾病。
  20. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該神經保護作用係與腦血管供血不足、局灶性或瀰漫性腦外傷、脊髓損傷、大腦缺血或梗塞、帕金森氏症、杭丁頓症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、阿茲海默症、雷特氏症、溶素體儲積病或多發性硬化症、缺氧、周邊神經損傷或中風。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中該大腦缺血或梗塞係栓塞性阻塞及血栓性阻塞、週產期之缺氧缺血腦病變、新生兒缺氧缺血性腦病、新生兒周產期窒息、心臟驟停、顱內出血、蜘蛛膜下腔出血、中風或創傷性腦損傷。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該中風係缺血性中風。
  23. 一經修飾的微RNA-195，其具有選自由SEQ ID NOs：4-7所組成群組之序列。
  24. 如申請專利範圍第23項之微RNA-195，其係選自由以下所組成之群組： a. 具有SEQ ID NO：4之序列並且在第1、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；b. 具有SEQ ID NO：5之序列並且在第1、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；c. 具有SEQ ID NO：6之序列並且在第1、2、5、10、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA；及d. 具有SEQ ID NO：7之序列並且在第2、5、10、15、17、18、20與21個核苷酸經鎖核酸修飾的微RNA。
  25. 一經修飾的微RNA-195，其具有SEQ ID NO：3之序列並且在第20與21個核苷酸經鎖核酸修飾。
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