CN111944893B - 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用 - Google Patents

与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用。所述与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物，是由hsa‑let‑7a‑3p、hsa‑let‑7a‑5p、hsa‑let‑7c‑5p、hsa‑let‑7d‑3p、hsa‑let‑7d‑5p、hsa‑let‑7e‑5p、hsa‑let‑7f‑5p和hsa‑miR‑98‑5p 8个miRNA组成。所述的与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。本发明首次发现与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA标志物，并通过实验验证所述miRNA标志物表达异常与唇腭裂胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确。提供唇腭裂产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。为唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。

Description

与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用。
背景技术
唇腭裂是我国常见严重胎儿发育畸形之一，包括唇裂、腭裂和唇腭裂，根据是否合并其它畸形又可分为综合征型和非综合征型。唇腭裂平均发生率在1.7‰左右，亚洲属于高发地区。唇腭裂的发病机制目前尚不清楚，主要由遗传和环境因素共同作用所致。唇腭裂会导致患儿喂养困难和语言发育障碍等，治疗上主要是生后进行多次矫形手术，术后面部瘢痕会影响患儿心理发育和生活质量的提高。因此，研究唇腭裂的胚胎早期无创诊断的方法，使其能够在严重结构异常或不可逆损伤之前获得诊断，制定相应的胚胎早期治疗和预防新策略，是国内外研究的重点方向，对于减少畸形的致残率、提高人口素质具有极其重要意义。
建立无创的唇腭裂早期筛查方法，一直是人们不断追求的理想目标，也是国家中长期科学和技术发展规划纲要中的重点资助领域和优先研究主题。虽然目前影像学技术(超声和MRI)的发展非常迅速，使一些有明显结构异常畸形的诊断时间获得提前，但目前影像学方法只能在畸形结构形成后给予诊断，已失去了最佳预防和治疗的时机，不能达到早期诊断的要求。羊膜穿刺、绒毛膜和胎儿血取样可以对一些明显染色体异常(Down综合征等)或单基因疾病进行早期诊断，但对于唇腭裂这种复杂多基因疾病仍缺乏特异性检测指标。母体血清学检查是一种无创性产前诊断方法，孕妇易接受，适用于大范围产前筛查。但目前为止尚没有唇腭裂有效的产前诊断分子标志物。
近年来，随着各种组学技术突飞猛进的发展，一系列新技术融入到高通量的组学研究中，使疾病诊断分子标志物筛查工作有了新的突破，也为目前大家非常重视的转化医学研究提供了极其重要的手段。利用高通量的组学技术可以充分考虑母体与胎儿两方面因素，从众多复杂的基因和蛋白质中筛选出一组(数十或数百个)改变明显的关键性分子，综合分析其变化规律，将有利于确定疾病早期诊断和预后判定的分子标志物，也是未来将复杂的分子标志物转化为临床应用的趋势所在。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物，是由hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p8个miRNA组成。
所述的与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸，高通量测序平台，通过PCR、原位杂交、荧光原位杂交、免疫透射比浊法、放射免疫法等相关方法对与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物进行检测。
进一步地，所述唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验的标本包括孕妇血液、尿液、羊水和胎儿标本等。
进一步地，所述的唇腭裂包括综合征型唇裂、综合征型腭裂、综合征型唇腭裂、非综合征型唇裂、非综合征型腭裂、非综合征型唇腭裂等。
一种检测所述唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物的试剂在制备唇腭裂胎儿产前无创诊断工具中的应用。
进一步地，所述检测唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物的试剂包括能够定量上述miRNA的试剂。
进一步地，所述能够定量上述miRNA的试剂可以是基因或转录本的特异性引物，也可以是特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
所述引物序列如SEQ ID NO.1-10所示。
一种用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述分子表达量。
进一步，所述工具包括能够定量与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物包括hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p)。
进一步，所述用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断的工具包括芯片、试剂盒、试纸和高通量测序平台。
一种唇腭裂产前筛查、预警和诊断的方法，所述方法包括如下步骤。
(1)获取受试者的样品。
(2)检测受试者样品中与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物表达水平。
(3)将测得的与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物变化趋势与受试者的疾病相关性关联起来。
(4)与正常对照相比，上述与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物表达异常，表明受试者怀有唇腭裂胎儿的风险高。
定量miRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory MutationSystem，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增来制备。
本发明的用于检测上述miRNA表达量的样品的获得是本领域的常规技术，优先可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
所述的样品可以是但不限于孕妇血液(及其外泌体)、尿液(及其外泌体)、羊水(及其外泌体)和畸形胎儿或患儿标本。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知上述分子表达异常与唇腭裂相关也属于使用了本发明的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于上述分子检测来判断唇腭裂的试剂均包含在本发明范围内。本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
本发明的8种miRNA(包括hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p)序列可以在NCBI数据库中进行查询。
本发明中“唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断”包括判断受试者胎儿是否已经发生唇腭裂，判断受试者胎儿是否存在患有唇腭裂的风险。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明首次发现与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA标志物，包括hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p，并通过实验验证所述miRNA标志物表达异常与唇腭裂胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确。
本发明提供的唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA标志物，提供唇腭裂产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。
本发明提供的唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA标志物为唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。
附图说明
图1是唇腭裂胎儿孕妇的外周血的外泌体分离鉴定及其转录组测序结果。
图2是let7家族8个在唇腭裂孕妇血清中差异表达miRNA GO功能分类图(生物学过程)。
图3是let7家族8个在唇腭裂孕妇血清中差异表达miRNA GO功能分类图(细胞组分)。
图4是let7家族8个在唇腭裂孕妇血清中差异表达miRNA GO功能分类图(分子功能)。
图5是利用定量PCR方法对全转录组测序筛选出来的差异表达miRNA(let7家族8个miRNA)在唇腭裂孕妇外周血血浆中进行大样本验证结果。
图6是利用定量PCR方法对全转录组测序筛选出来的差异表达miRNA(let7家族8个miRNA)在唇腭裂孕妇外周血血浆外泌体中进行大样本验证结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例中所用孕妇外周血标本均来源于盛京出生队列样本库，并获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准(批准号：2017PS264K)。
实施例1唇腭裂胎儿母亲外周血的外泌体分离提取及miRNA测序。
1、分离血浆。
采集全血样品，于EDTA抗凝管中，轻柔颠倒混匀后，使用4℃低温离心机，1600×g离心10min，离心后收集上清(血浆)至新的EP管中，16000×g离心10min去除细胞碎片，将血浆分装到多个离心管中。
2、外泌体的分离和鉴定。
采用超高速离心的方法分离血浆外泌体。分离方法如下：10000×g离心1h，4℃，上清液移至新的超高速离心管后，按照100000×g离心4h，4℃。弃上清，用100μl冷的PBS重悬外泌体。采用三种标准方法(透射电镜、粒径分析和外泌体表面标志蛋白)鉴定分离得到的外泌体颗粒。
3、转录组测序和生物信息学分析。
纳入了孕妇年龄和孕周相匹配的5名孕有唇腭裂胎儿的孕妇和5名孕有健康胎儿的孕妇。分离提取血浆和血浆外泌体，质检通过后，进行miRNA测序分析，并进行深入的生信分析筛选唇腭裂孕妇产前诊断miRNA分子标志物。
4、外泌体鉴定与转录组测序结果。
1)外泌体鉴定：透射电镜显示具有完整外膜的外泌体，多数大小为120nm。粒径分析结果显示每毫升有1.0×1010-3.6×1010个外泌体颗粒，平均直径为123.2nm。Western-blot结果显示分离的外泌体表达其表面标志物ALIX、CD81和CD9，以及胎盘外泌体标志物PLAP。表明本研究的外泌体分离方法可以获得纯度较高的外泌体。
2)转录组测序：在血浆外泌体中共发现344个差异表达miRNA，其中247个miRNA为低表达，97个miRNA为高表达。在血浆中共发现189个差异表达miRNA，其中121个miRNA为低表达，68个miRNA为高表达。血浆外泌体中差异表达miRNA多于全血浆，表明外泌体可以更好反映唇腭裂疾病变化。有82个miRNA在血浆外泌体和全血浆中共同表达异常，其中68个miRNA低表达，14个miRNA高表达。由于miRNA家族可以共同调控一个生物学过程或一个信号通路，与单个差异miRNA分子相比对于疾病诊断具有更大的价值。在上述差异表达miRNA中只有Let-7家族存在多个分子的改变，包括包括hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p。而且这8个Let-7家族分子的表达在唇腭裂孕妇血浆外泌体和全血浆中均有改变。这8种差异表达miRNA的靶基因进行GO分析，结果显示基因功能聚类于“发育过程”、“细胞增殖”和“生长”，均与唇腭裂发生有关。
采用超高速离心的方法分离血浆外泌体，并完成外泌体相关鉴定工作。筛选孕妇年龄和孕周相匹配的样本送转录组测序，并结合生物信息学分析，初步筛选可能的分子标志物，如图1-4所示。
实施例2差异表达的miRNA在孕妇血浆和外泌体中的大样本验证。
1、提取血浆和外泌体的miRNA。
利用Qiagen miRNA提取试剂盒提取血浆和外泌体的miRNA，操作按说明书进行。RNA样品的质量分析，使用Nanodrop 2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，OD260/280介于1.8～2.0之间，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
2、miRNA的反转录和扩增实验。
使用生工miRNA加尾法试剂对提取的miRNA进行逆转录。qRT-PCR扩增检验，使用Takara染料法扩增试剂，每个样本设置三个重复孔以保证结果的可靠性。按照说明书配置以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系10μl，ROX 0.4μl，正/反向引物(5μM/μl)各1μl，模板cDNA 2.0μl，无RNA酶水5.6μl。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。管家基因选择U6，扩增该基因的正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.2)。hsa-let-7a-3p基因的正向引物为5’-cggcggCTATACAATCTACTGTCTTTC-3’(SEQ ID NO.3)；hsa-let-7a-5p基因的正向引物为5’-cgcgTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’(SEQ ID NO.4)；hsa-let-7c-5p基因的正向引物为5’-cgcTGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3’(SEQ ID NO.5)；hsa-let-7d-3p基因的正向引物为5’-cCTATACGACCTGCTGCCTTTCT-3’(SEQ ID NO.6)；hsa-let-7d-5p基因的正向引物为5’-CGCCAGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT-3’(SEQ ID NO.7)；hsa-let-7e-5p基因的正向引物为5’-gcgTGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT-3’(SEQ ID NO.8)；hsa-let-7f-5p基因的正向引物为5’-ccgcgTGAGGTAGTAGATTGTATAGTT-3’(SEQ ID NO.9)；hsa-miR-98-5p基因的正向引物为5’-acgcgTGAGGTAGTAAGTTGTATTGTT-3’(SEQ ID NO.10)。以上8个miRNA的反向引物为反转录试剂盒中配套的通用下游引物。各项操作于冰上进行。扩增程序为95℃5min，(95℃15s，60℃45s)*40个循环。在7500荧光实时定量PCR仪器上进行PCR反应，通过溶解曲线和电泳确定目的条带，使用2-△△CT方法进行相对定量。
3、差异表达的miRNA在孕妇血浆和外泌体中的大样本验证结果。
与健康对照组孕妇相比，Let7家族8个miRNA(hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p)在唇腭裂孕妇组中均低表达，尤其在外泌体中下调更明显。ROC曲线下面积分析各个miRNA以及miRNA联合谱在孕妇血浆和外泌体样本中的诊断效能。8个miRNA在外泌体中对唇腭裂的诊断表现要优于血浆，miRNA联合谱检测曲线下面积(AUC)(AUC＝0.992；95％CI，0.978–1.000；P<0.0001)高于单个指标，特异性和敏感性分别为93.3％和100％。
基于转录组学和生信分析结果，发现唇腭裂胎儿孕妇的血浆外泌体和全血浆中miRNA家族中有8个miRNA(属于Let7家族)存在差异表达。进一步利用定量PCR方法在孕妇血浆外泌体和全血浆中分别进行大样本验证，并采用ROC曲线分析其对唇腭裂的诊断效能，如图5-6所示。
序列表
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CTCGCTTCGG CAGCACA 17
<210> 2
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AACGCTTCAC GAATTTGCGT 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggcggCTAT ACAATCTACT GTCTTTC 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgTGAGGT AGTAGGTTGT ATAGTT 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcTGAGGTA GTAGGTTGTA TGGTT 25
<210> 6
<211>23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cCTATACGAC CTGCTGCCTT TCT 23
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
CGCCAGAGGT AGTAGGTTGC ATAGTT 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgTGAGGTA GGAGGTTGTA TAGTT 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgcgTGAGG TAGTAGATTG TATAGTT 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgcgTGAGG TAGTAAGTTG TATTGTT 27

Claims (7)

1.一种定量检测与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物的试剂在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用，所述miRNA分子标志物由hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p 8个miRNA组成。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台，通过PCR、原位杂交、荧光原位杂交、免疫透射比浊法、放射免疫法等相关方法对与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物进行检测。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验的标本包括孕妇血液、尿液、羊水和胎儿标本。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的唇腭裂包括综合征型唇裂、综合征型腭裂、综合征型唇腭裂、非综合征型唇裂、非综合征型腭裂、非综合征型唇腭裂。
5.一种定量检测与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物的试剂在制备唇腭裂胎儿产前无创诊断工具中的应用，所述miRNA分子标志物由hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-98-5p 8个miRNA组成。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述能够定量权利要求5所述的与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物的试剂是其基因或转录本的特异性引物、或特异性识别探针、或同时包括引物和探针。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-10所示。
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