CN106191233B - 多重实时定量pcr检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用 - Google Patents

多重实时定量pcr检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用。该试剂盒包括以下引物对和探针：用于扩增目标染色体的多个基因和非基因位点的n1对引物对和相关的探针；所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体；以及用于扩增参照染色体的多个基因和非基因位点的n2对引物对和相关的探针；所述参照染色体为一个或多个常染色体；其中，n1、n2分别≥1。本发明可以对妊娠妇女进行包括唐氏综合症，爱德华氏综合症，帕陶氏综合症和其他染色体异常疾病无创产前筛查。该试剂盒具有早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用等优点，能避免妇女妊娠中后期胎儿宫内感染、流产、死亡，达到优生优育目的。

Description

多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及一种利用早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用的多重实时定量PCR(Multiplex real-time quantitativePCR，mqPCR)检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用。该试剂盒对正常妊娠妇女进行无创产前检测(Non-invasive prenatal testing，NIPT)包括唐氏综合征，爱德华氏综合征，帕陶氏综合征和其他多倍染色体疾病筛查。
背景技术
中国每年新增出生缺陷约90-120万例，约占出生人口总数的4-6％。现有8000多万残疾人中，约3000万人是出生缺陷所致。出生缺陷目前已成为儿童致病、致残，甚至死亡的重要原因，其中染色体异常疾病为主要疾病。孕前和孕早期保健以及产前筛查，是避免与降低新生儿缺陷和实行优生优育的最重要关卡。1966年，研究发现了孕妇高龄与唐氏综合症胎儿出生的相关性，此后，产前筛查得到迅速发展。产前筛查是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等方面进行检测诊断。从而掌握时机，对可治疗疾病，选择及时进行宫内治疗；对于不可治疗性疾病，如染色体异常疾病等，能够做到知情选择和预防。
染色体异常疾病，是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条染色体上，但多发于如21三体(唐氏综合征)，18三体(爱德华氏综合征)，13三体(帕陶氏综合征)和性染色体异常等，在自发性流产、死胎、早夭中占50％以上，新生儿中发病率约1％，是先天性心脏病、智能发育不全、性发育异常及男女不孕不育等的重要原因。随着染色体分带技术，PCR技术，DNA测序技术等的快速发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日益加深，染色体异常疾病检测日趋增多。约15％的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异常所致，即约为5％-8％的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90％以上已有自然流产或死产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。染色体异常疾病，迄今尚无有效的治疗方法，只能通过产前筛查/诊断等手段进行一定程度的预防。但目前传统的产前诊断多采用羊膜穿刺等侵入性取样方法，胎儿宫内感染或流产等的风险增加。
上述传统侵入性产前诊断的缺点，导致染色体异常疾病无创产前筛查方法的出现。目前通用的方法包括以细胞为主体的和脱细胞方法，尤以后者居多。胎儿游离DNA在妊娠母体血液中的存在(Lo YM et al，Lancet 1997,350:485-487)，和新一代DNA检测技术的不断改进，使得无创产前筛查更加容易开展。仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行检测分析从而检测胎儿是否患染色体异常疾病。但妊娠早期，主要来自胎盘细胞的胎儿游离DNA只占母体血浆DNA的10-20％。而目前常用的新一代DNA测序技术，检测耗时较长，需用复杂的仪器和生物信息学软件分析大量的DNA序列，1-2周获检测结果，且耗费许多试剂和耗材，价格昂贵。
Kary Mullis于1983年发明了DNA聚合酶链反应(PCR)，使DNA的常规研究变得更加实用。科研人员能从复杂的遗传物质中使某个特定的DNA片段在几小时内扩增百万倍，从而提供足够的遗传物质来研究基因功能和基因突变，为基础研究和诊断领域开辟了新的途径。尽管取得了这些进展，在细胞中用PCR定量DNA或RNA仍然很困难。直至1993年，Russel等引入了实时，或动力学监测PCR扩增的概念。实验显示，目标DNA的含量与生成特定数量的扩增循环后的PCR产物含量之间的关系是线性的。实时荧光定量PCR(qPCR)技术因此而发展起来。该技术的整个操作过程在封闭状态下进行，有效避免了出现“假阳性”的实验结果。同时，荧光探针的使用提高了PCR检测的灵敏度和特异性。在有已知参照物DNA浓度的情况下，能准确定量样品的模板数。PCR扩增后不需进行电泳等实验后处理，而直接定量样品模板数，使其具有快速、重复性好、省力、费用低廉等优点。
由于受到技术本身灵敏度的限制，实时定量PCR最多只能有效检测DNA含量1.5倍以上的差异，即可以在有创羊水穿刺情况下，取胎盘细胞进行PCR扩增，从而检测出21三体胎儿(Zimmermann B et al，Methods Mol Biol 2006，336:83-100)。但如前所述，在妊娠早期，胎儿游离DNA只占母体血浆DNA的10-20％，含正常二倍体胎儿的母体血浆DNA与含21三体胎儿的母体血浆DNA相比，其差异要低于正常实时定量PCR能有效检测的1.5倍的差异。本领域已有研究人员提出通过不同的富集手段，富集孕妇外周血浆或血清中游离胎儿DNA，运用实时定量PCR，以常染色体上单基因位点作为参考，检测21号染色体上的单基因位点DNA扩增(中国专利申请CN200610003103)。该专利申请说明书呈现的实验数据，提出待测孕妇的常染色体单基因片段和21号染色体单基因片段的CT值之差的绝对值大于怀正常胎儿孕妇的CT值的平均值与2SD之和，则该待测孕妇的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿。我们经过认真比对研究，认为该专利申请寻求保护的权利要求超出了前述的实时定量PCR理论检测范围，实践上不具备可行性。此外，CN200610003103专利申请要求保护的技术方案还存在以下需要改进的几个方面：
1、在目标染色体和参照染色体仅限于单个基因位点扩增，因而PCR反应敏感性降低。
2、只能以21号染色体为目标染色体，以其他常染色体作为参照染色体，因此只能检测21三体，检测范围局限性较大。
3、富集胎儿DNA的方法较复杂。
4、同管PCR反应只采用1个荧光强度阈值，PCR反应的准确性不高。
因此本领域迫切需要开发一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用的多重实时定量PCR新方法。
发明内容
本发明解决的技术问题之一是提供了一种多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒。该试剂盒具有早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用等优点，能避免妇女妊娠中后期胎儿宫内感染、流产、死亡，达到优生优育目的。
本发明解决的技术问题之二是提供了一种应用多重实时定量PCR技术检测染色体非整倍体的方法。
本发明第一方面，提供了一种引物和探针集合，所述的引物和探针集合包括以下引物对和探针：
(i)用于扩增目标染色体的多个基因和非基因位点的n1对引物对和相关的探针；所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体；以及
(ii)用于扩增参照染色体的多个基因和非基因位点的n2对引物对和相关的探针；所述参照染色体为一个或多个常染色体；
其中，n1、n2分别≥1。
在另一优选例中，所述的引物和探针集合中的引物或探针经荧光标记。
在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。
在另一优选例中，所述的n1对引物对中的每对引物能特异性扩增目标染色体的多个基因和非基因位点，所述目标染色体包括21号染色体、18号染色体、13号染色体和x染色体；具体包括但并不限于21号染色体的Usp25(NCBI#NM_001283041)、C21orf37(NCBI#LN608865)、C21orf58(NCBI#NM_058180)、Setd4(NCBI#NM_017438)、或C21orf62(NCBI#AF231922)基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括但并不限于18号染色体的Setbp1(NCBI#NM_015559)、Potec(NCBI#NM_001137671)、Malt1(NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdh19(NCBI#NM_021153)基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括但并不限于13号染色体的Sacs(NCBI#NM_014363)、Cenpj(NCBI#NM_018451)、Foxo1(NCBI#NM_002015)、Smad9(NCBI#NM_001127217)、或Fgf14(NCBI#NM_004115)基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括但并不限于X染色体上的特异基因位点及其他基因和非基因位点。
在另一优选例中，所述的n2对引物对中的每对引物能特异性扩增参照染色体的多个基因和非基因位点，所述的参照染色体包括13号染色体、18号染色体、21号染色体、或其他常染色体。
在另一优选例中，所述用于扩增目标染色体的多个基因的引物对序列如SEQ IDNO.:1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.:3所示，来自21号染色体的Usp25基因位点及其他基因和非基因位点，或18号染色体的基因和非基因位点，或13号染色体的基因和非基因位点，或X染色体的基因和非基因位点；和/或
所述用于扩增参照染色体的多个基因的引物对序列如SEQ ID NO.:4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.:6所示，来自18号染色体的Setbp1基因位点及其他基因和非基因位点，或来自其他常染色体的基因和非基因位点。
本发明第二方面，提供了上述引物和探针集合在制备检测染色体非整倍体和/或筛查染色体数量异常疾病的试剂或试剂盒中的应用。
在另一优选例中，所述的染色体数量异常疾病包括单倍体疾病或多倍体疾病。
在另一优选例中，所述的单倍体疾病包括5q-综合征。
在另一优选例中，所述的多倍体疾病包括21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征。
本发明第三方面，提供了一种多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物和探针集合。
作为本发明优选的技术方案，所述的n1对引物对和/或n2对引物对所扩增的实时定量PCR产物中，有两种以上引物或探针经荧光标记。
作为本发明优选的技术方案，所述n1对引物对和n2对引物对所扩增的实时定量PCR产物的长度为50-150bp，较佳地60-120bp。
本发明第四方面，提供了一种体外非诊断性的检测染色体非整倍体的方法，包括步骤：
(a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠母体外周血样本。
(b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的样本中通过过滤离心、甲基化分离等方法富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％，得到DNA样本。
(c)将所述富集后的DNA样本分为实验组和对照组，其中，
在实验组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用目标染色体多个基因和非基因位点如21号染色体，或18号染色体，或13号染色体，或x染色体的n1对引物对进行qPCR，并记录CT值，记为CTA(例如，21号染色体)，其中n1≥1；
在对照组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用参照染色体多个基因和非基因位点如18号染色体，或13号染色体，或其他常染色体的n2对引物对进行实时定量PCR，并记录CT值，记为CTB(例如，18号染色体)，其中n2≥1；
实验组和对照组实时定量PCR应在同一PCR管内运行，即为多重实时定量PCR；其中，一种或一种以上实验组和一种或一种以上对照组所用引物或探针经不同荧光标记，即同一PCR管内包括两种以上引物或探针荧光标记。
(d)将来自同一PCR反应至少4个不同荧光强度阈值(thresholds)的CT值进行比较，从而确定目标染色体的倍数：
ΔCT＝CTB(18号染色体)–CTA(21号染色体)
ΔΔCT，已校准＝ΔCT(样品)–ΔCT(校准样品)。
其中，ΔCT(校准样品)是染色体二倍体样品的平均ΔCT值。
当多重实时定量PCR具100％效率，并且富集的胎儿DNA达100％时，则有下列等式：2(0.58)＝1.5，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.58，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.58，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体。
当多重实时定量PCR具100％效率，但富集的胎儿DNA只占50％时，则有下列等式：2(0.32)＝1.25，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.32，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.32，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体。
在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。
在另一优选例中，所述的胎儿和所述的妊娠母体包括小鼠、大鼠、或人，优选地，为人。
在另一优选例中，所述步骤(b)还包括步骤(b1)：将所述的DNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的DNA样本。所述的片段化处理包括物理和生化处理，如碎化、超声处理和酶切。
在另一优选例中，所述的片段化的DNA样本大小≤1000bp。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次提出应用多重实时定量PCR技术在孕妇外周血液中进行染色体异常疾病无创产前筛查，从而开发出一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用的新试剂盒。该试剂盒利用多重技术富集胎儿游离DNA，同时利用不同引物和不同浓度荧光标记探针组合，进行多重实时定量PCR。在此基础上完成了本发明。
定义
“无创产前筛查”是指仅需采取妊娠母体外周血液，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的胎儿游离DNA片段进行检测分析，从而检测胎儿是否患染色体异常疾病—唐氏综合症(21三体)、爱德华氏综合症(18三体)、帕陶氏综合症(13三体)和其他染色体非整倍体异常疾病。
“染色体异常疾病”或“染色体非整倍体异常疾病”是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条染色体上。通常，所述的染色体数量异常疾病包括单倍体疾病或多倍体疾病。例如，所述的单倍体疾病包括5q-综合征。所述的多倍体疾病包括21三体(唐氏综合症)，18三体(爱德华氏综合症)，13三体(帕陶氏综合症)和性染色体异常等。
qPCR
qPCR是一种实时荧光定量核酸扩增检测系统。检测时间短，只须一小时左右；操作简单，加样等前处理后，样本插入PCR仪一小时后计算机能给出报告，无须开盖，避免污染；结果精确，实时荧光qPCR是在扩增的每一时刻连续检测各样本荧光值的变化，正常情况下，可有效检测DNA含量1.5倍以上的差异。qPCR技术因此被广泛应用于科研和临床。
检测染色体非整倍体的试剂盒
本发明提供了一种用于体外非诊断性检测染色体非整倍体的或用于对染色体异常疾病进行无创产前筛查的试剂盒。
本发明的试剂盒包括步骤：
(a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠母体外周血样本。
(b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的样本中通过过滤离心、甲基化分离等方法富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％，得到DNA样本。
(c)将所述富集后的DNA样本分为实验组和对照组，其中，
在实验组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用目标染色体多个基因和非基因位点如21号染色体，或18号染色体，或13号染色体，或x染色体的n1对引物对进行qPCR，并记录CT值，记为CTA(例如，21号染色体)，其中n1≥1；
在对照组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用参照染色体多个基因和非基因位点如18号染色体，或13号染色体，或其他常染色体的n2对引物对进行实时定量PCR，并记录CT值，记为CTB(例如，18号染色体)，其中n2≥1；
实验组和对照组qPCR应在同一PCR管内运行，即为实时定量PCR；其中，一种或一种以上实验组和一种或一种以上对照组所用引物或探针经不同荧光标记，即同一PCR管内包括两种或两种以上引物或探针荧光标记。
(d)将来自同一PCR反应至少4个不同荧光强度阈值(thresholds)的CT值进行比较，从而确定目标染色体的倍数：
ΔCT＝CTB(18号染色体)–CTA(21号染色体)
ΔΔCT，已校准＝ΔCT(样品)–ΔCT(校准样品)。
其中，ΔCT(校准样品)是染色体二倍体样品的平均ΔCT值。
当多重实时定量PCR具100％效率，并且富集的胎儿DNA达100％时，则有下列等式：2(0.58)＝1.5，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.58，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.58，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体。
当多重实时定量PCR具100％效率，但富集的胎儿DNA只占50％时，则有下列等式：2(0.32)＝1.25，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.32，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.32，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体。
其中，优选地，步骤(b)中所述的细胞为血液样本中的完整或破碎的血细胞，主要包括红细胞、白细胞、血小板等，此外还可以包括血浆蛋白等。去除方法可以通过本领域常规技术进行。经去除细胞的DNA样本为富集的DNA样本。
此外，更优选地，步骤(b)中的DNA样本是经过片段化处理后的样本。可用于片段化处理的方法没有特别限制，为本领域技术人员熟知的方法，例如物理或生化处理，如碎化、超声处理、酶切等等。经过片段化处理后的片段化的DNA样本，通常其大小不超过1000bp。
本发明方法中，所述的目标染色体通常为现有发现的出现染色体数量变异并导致染色体异常疾病的染色体，优选地包括21号染色体、18号染色体、13号染色体、性染色体。而所述的参照染色体则为已知正常数目的染色体。例如，当目标染色体为21号染色体是，可以采用其它任意一条染色体(如18号、13号)等为参照染色体。此外，可用于本发明的参照染色体为一个或多个。
引物和探针集合
本发明还提供了一种引物和探针集合，采用本发明引物和探针集合可以用于完成本发明体外非诊断性检测染色体非整倍体的或用于对染色体异常疾病进行无创产前筛查的试剂盒。
本发明的引物和探针集合中，包含了扩增目标染色体的引物对和相关探针，以及扩增参照染色体的引物对和相关探针，二者引物对的数量分别为n1对和n2对。其中，n1和n2分别为≥1的正整数。
可用于扩增本发明目标染色体和参照染色体基因及非基因位点的引物和探针集合通常没有特别限制。为任何现有技术中可以根据目标染色体基因及非基因位点和参照染色体基因及非基因位点为模板而设计的引物对和探针。可用于本发明的目标染色体和参照染色体没有特别限制，具体可如上文所定义。可用于本发明的目标染色体基因和非基因位点没有特别限制，可以为目标染色体上任意的基因和非基因位点。本领域技术人员可以根据本发明提供的方法来判断确定目标染色体和参照染色体。当确定了目标和/或参照染色体后，可以选取所述染色体上相应的基因和非基因位点作为模板，然后通过常规方法设计用于扩增所述模板的相应引物和探针。
通常，当目标染色体为21号染色体时，可选用的基因包括Usp25(NCBI#NM_001283041)、C21orf37(NCBI#LN608865)、C21orf58(NCBI#NM_058180)、Setd4(NCBI#NM_017438)、C21orf62(NCBI#AF231922)等及其他基因和非基因位点；当目标染色体为18号染色体时，可选用的基因包括Setbp1(NCBI#NM_015559)、Potec(NCBI#NM_001137671)、Malt1(NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdh19(NCBI#NM_021153)等及其他基因和非基因位点；当目标染色体为13号染色体时，可选用的基因包括Sacs(NCBI#NM_014363)、Cenpj(NCBI#NM_018451)、Foxo1(NCBI#NM_002015)、Smad9(NCBI#NM_001127217)、Fgf14(NCBI#NM_004115)等及其他基因和非基因位点。而参照染色体则只需选择与目标染色体不同的染色体，并进一步选择参照染色体上相应的基因及其他基因和非基因位点。
优选地，引物和探针集合中每对引物所扩增的基因模板长度为50-150bp，较佳地，为100-120bp。优选地，当目标染色体为21号染色体时，用于扩增目标染色体基因的引物对序列如SEQ ID NO.:1-2所示，所针对的基因为Usp25，及来自其他基因和非基因位点；和/或当参照染色体为18号染色体时，所述用于扩增参照染色体基因的引物对序列如SEQ IDNO.:4-5所示，所针对的基因为Setbp1，及来自其他基因和非基因位点。
此外，用于qPCR检测的引物对中，通常会采用标记物的形式来测定所扩增产物的相对值或绝对值并用于和对照进行比对。可用的标记物没有特别限制，可用是优选地，用于参照染色体和目标染色体的各引物对或探针中至少一条连接有荧光标记，例如采用荧光标记探针进行引物扩增结果的显示，优选地，含有荧光标记探针的引物或探针中，探针序列如SEQ ID NO.:3(目标染色体)或6(参照染色体)所示，及来自其他基因和非基因位点。
采用本发明提出的mqPCR方法，在含富集胎儿游离DNA的妊娠母体外周血标本中能同时检测同一条染色体上不同的基因和非基因位点。例如，正常整倍体妊娠母体血浆样品每100微升含10个基因组当量(genome-equivalents，GE)(其中1个当量来自于胎儿游离DNA)，即每100微升含21染色体拷贝数为20(18母体拷贝数+2胎儿拷贝数)，而21三体妊娠每100微升含21染色体拷贝数为21(18母体拷贝数+3胎儿拷贝数)，常规定量PCR尚不能这样精细分析20拷贝与21拷贝之间的细微区别。但采用本发明提出的mqPCR方法，通过富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％，及同时检测同一条染色体上多个不同的基因和非基因位点，能精确分析样本染色体二倍体和三倍体之间的细微区别。
试剂盒
本发明提供了检测染色体非整倍体和/或筛查染色体数量异常疾病的试剂盒。其中，所述的试剂盒中含有本发明的引物和探针集合以及说明书。
本发明试剂盒中含有的说明书记录了本发明检测染色体非整倍体的方法和/或对染色体异常疾病进行无创产前筛查的方法。
本发明具有以下主要优点：
(1)早期检测。正常妊娠情况下，胎儿细胞经过胎盘渗透至母体血液，细胞被母体免疫系统破坏，胎儿DNA游离于母血中。据报道，胎儿游离DNA最早在母血中能测到的时间为妊娠5周，而含量只有母血DNA的5-10％，随着孕周增加而增多，妊娠中期时可达25％，但存在个体差异。游离DNA半衰期短，分娩后短时间内消失。再加上其DNA片段较小，平均166bp，常规PCR方法通常很难检测，而本发明所提出的mqPCR新方法，结合富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％，具高灵敏性和特异性，能进行早期检测。
(2)安全无创。只需抽取5-10ml母体外周血进行检测，同时避免胎儿宫内感染和孕妇流产。
(3)准确。采用新的mqPCR技术，由于检测的是染色体疾病发生的根本原因(DNA变化)，而不是其结果(生化指标筛查)，检出率可达99％以上，假阳性率不超过1％。
(4)快速。检测结果通常6小时内获得，价格只是新一代DNA测序技术的四分之一。并且，操作简便，不像新一代测序技术那样需PCR预扩增、建立DNA文库，因而结果更加可靠。
(5)多位点和多阈值(threshold)检测。本发明试剂盒能同时检测同一条染色体上不同的基因和非基因位点，增加PCR反应敏感性，比单个基因位点扩增敏感性增加10倍以上。并且，本发明试剂盒同管PCR反应采用4个不同荧光强度阈值，增加PCR反应的准确性。
(6)富集方法简便。本发明提出的胎儿游离DNA的富集方法更为敏感、简便。
(7)目标染色体检测与参照染色体检测互为对照。本发明试剂盒以21号染色体和18号染色体或13号染色体互为对照，从而增加同管PCR多重性，减少PCR反应复杂性。
(8)适合大规模检测和临床应用。mqPCR所具的多重性，高通量及高灵敏性，能将多种DNA片段在同一反应单元内同时检出，节省时间、试剂耗材和经费。其适应症包括所有妊娠妇女，尤其是试管婴儿治疗和多次流产的孕妇，35岁以下错过染色体疾病筛查机会的孕妇，35岁以上超过染色体疾病筛查适应年龄的孕妇，拒绝羊水穿刺或脐血穿刺的孕妇及有穿刺禁忌症的孕妇等。
表1列出了本发明多重实时定量PCR与现有的新一代测序技术用于无创产前筛查的区别。
表1.本发明多重实时定量PCR与现有的新一代测序技术用于无创产前筛查的区别
由表1可见，本发明多重实时定量PCR与现有的新一代测序技术用于无创产前筛查相比，本发明多重实时定量PCR技术具有明显的优点，例如，检测时间提前，程序简便，检测更快速，检测仪器简单，成本低等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验材料：化学试剂购自Sigma-Aldrich公司；所用内切酶和其他分子生物学试剂购自NEB和Promega公司；引物和探针购自ThermoFisher公司和Roche公司；DNA提取试剂和耗材购自Qiagen公司；PCR试剂和耗材购自ThermoFisher公司。
实施例1.应用mqPCR技术进行21三体和18三体检测
(1)取5ml孕妇外周血液样本。取血前，与每位孕妇签署知情同意书。
(2)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的样本中消化血清或血浆蛋白，提纯DNA样本。
(3)通过过滤离心、甲基化分离等方法富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％。
(4)将所述富集后的DNA样本分为实验组和对照组，其中，
在实验组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用目标染色体基因如21号染色体的n1对引物对进行qPCR，并记录CT值，记为CTA(21号染色体)；其中，21号染色体所选取的n1对基因引物分别为Usp25(NCBI#NM_001283041)、C21orf37(NCBI#LN608865)、C21orf58(NCBI#NM_058180)、Setd4(NCBI#NM_017438)、C21orf62(NCBI#AF231922)等及其他基因位点和非基因位点，Usp25基因引物如SEQ ID NO.:1-2所示，探针如SEQ ID NO.:3所示运行PCR。每样品一式三份重复。
在对照组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用参照染色体基因如18号染色体的n2对引物对进行qPCR，并记录CT值，记为CTB(18号染色体)，其中，18号染色体所选取的基因为Setbp1(NCBI#NM_015559)、Potec(NCBI#NM_001137671)、Malt1(NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdh19(NCBI#NM_021153)等及其他基因位点和非基因位点，Setbp1基因引物如SEQ ID NO.:4-5所示，探针如SEQ ID NO.:6所示运行PCR。每样品一式三份重复。
实验组和对照组mqPCR在同一PCR管内运行；其中，一种或一种以上实验组和一种或一种以上对照组所用引物或探针经不同荧光标记，即同一PCR管内包括两种或两种以上引物或探针荧光标记。
(5)将来自同一PCR反应至少4个不同荧光强度阈值(thresholds)的CT值进行比较，从而确定目标染色体的倍数：
ΔCT＝CTB(18号染色体)–CTA(21号染色体)
ΔΔCT，已校准＝ΔCT(样品)–ΔCT(校准样品)。
其中，ΔCT(校准样品)是染色体二倍体样品的平均ΔCT值。
当多重实时定量PCR具100％效率，并且富集的胎儿DNA达100％时，则有下列等式：2(0.58)＝1.5，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体校准样品校准后大于或小于0±0.58，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.58，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体。
当多重实时定量PCR具100％效率，但富集的胎儿DNA只占50％时，则有下列等式：2(0.32)＝1.25，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体校准样品校准后大于或小于0±0.32，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.32，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体。
(6)结果显示：qPCR能从孕妇血浆中能准确检测21三体和18三体胎儿DNA(详见表2)。这些结果已被DNA测序所证实。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围
表2.多重实时定量PCR结果分析*
*粗黑字体显示核型分析的平均ΔΔCt值。该值离0越近，则越能说明样品的染色体正常与否，即二倍体或三体。结果表明，标本1和2为正常二倍体胎儿，标本3为21三体，标本4为18三体。

Claims (11)

1.一种引物和探针集合在制备多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物和探针集合包括以下引物对和探针：
(i)用于扩增目标染色体的多个基因和非基因位点的n1对引物对和相关的探针；所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体；以及
(ii)用于扩增参照染色体的多个基因和非基因位点的n2对引物对和相关的探针；所述参照染色体为一个或多个常染色体；
其中，n1、n2分别≥1；
所述引物和探针集合在制备多重实时定量PCR检测染色体非整倍体的试剂盒中的应用，具有以下步骤：
(a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠母体外周血样本；
(b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的样本中通过过滤离心、甲基化分离等方法富集胎儿小于500bp的游离DNA片段达50-100％，得到DNA样本；
(c)将所述富集后的DNA样本分为实验组和对照组，其中，
在实验组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用所述n1对引物对进行qPCR，并记录CT值，记为CTA；
在对照组中，以所述富集后的DNA样本为模板，用所述n2对引物对进行实时定量PCR，并记录CT值，记为CTB；
实验组和对照组实时定量PCR应在同一PCR管内运行，即为多重实时定量PCR；其中，一种或一种以上实验组和一种或一种以上对照组所用引物或探针经不同荧光标记，即同一PCR管内包括两种以上引物或探针荧光标记；
(d)将来自同一PCR反应至少4个不同荧光强度阈值的CT值进行比较，从而确定目标染色体的倍数：
ΔCT＝CTB–CTA
ΔΔCT，已校准＝ΔCT(样品)–ΔCT(校准样品)；
其中，ΔCT(校准样品)是染色体二倍体样品的平均ΔCT值；
当多重实时定量PCR具100％效率，并且富集的胎儿DNA达100％时，则有下列等式：2(0.58)＝1.5，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.58，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.58，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体；
当多重实时定量PCR具100％效率，但富集的胎儿DNA只占50％时，则有下列等式：2(0.32)＝1.25，即当PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后接近0，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后大于或小于0±0.32，则显示染色体二倍体；若PCR样品平均ΔΔCT值经正常二倍体校准样品校准后大于或小于0±0.32，而同时PCR样品平均ΔΔCT值经21三体或18三体或13三体校准样品校准后接近0，则显示21三体或18三体或13三体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物和探针集合中的引物对或探针经荧光标记。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述参照染色体为二倍体。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述n1对引物对中的每对引物能特异性扩增目标染色体的多个基因和非基因位点，所述目标染色体包括21号染色体、18号染色体、13号染色体和x染色体；具体包括：
21号染色体的Usp25、C21orf37、C21orf58、Setd4、C21orf62基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括
18号染色体的Setbp1、Potec、Malt1、Dsc3、Cdh19基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括
13号染色体的Sacs、Cenpj、Foxo1、Smad9、Fgf14基因位点及其他基因和非基因位点；和/或包括
X染色体上的特异基因位点及其他基因和非基因位点。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述n2对引物对中的每对引物能特异性扩增参照染色体的多个基因和非基因位点，所述的参照染色体包括13号染色体、18号染色体、21号染色体、或其他常染色体。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于扩增目标染色体的多个基因的引物对序列如SEQ ID NO.:1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.:3所示，来自21号染色体的Usp25基因位点及其他基因和非基因位点，或18号染色体的基因和非基因位点，或13号染色体的基因和非基因位点，或X染色体的基因和非基因位点；和/或
所述用于扩增参照染色体的多个基因的引物对序列如SEQ ID NO.:4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.:6所示，来自18号染色体的Setbp1基因位点及其他基因和非基因位点，或来自其他常染色体的基因和非基因位点。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的n1对引物对和/或n2对引物对所扩增的实时定量PCR产物中，有两种以上引物或探针经荧光标记。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述n1对引物对和n2对引物对所扩增的实时定量PCR产物的长度为50-150bp；优选地，所扩增的实时定量PCR产物的长度为60-120bp。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胎儿和所述的妊娠母体包括小鼠、大鼠、或人。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(b)还包括步骤(b1)：将所述的DNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的DNA样本。
11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述片段化的DNA样本大小≤1000bp。
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