CN107022618B - 无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒，包括以下组份：针对21号、18号或13号染色体中的一条或几条设计的上下游引物对PP三体；针对除21号、18号及13号染色体外的其它常染色体中的任一条设计的上下游引物对PP常；其中任一对PP三体与PP常需满足以下条件：①四条引物两两之间的熔点差值在4℃以内，②扩增子长度≤150bp，且不产生非目的产物，③两个扩增子的熔点差值在2℃以上，④两个扩增子的熔解峰明显分离，不形成肩峰。本发明的试剂盒简便快速，准确度和灵敏度高，误差小，精度高；使有效唐筛的孕周时间提前至少三周。

Description

无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于产前诊断胎儿21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征的试剂盒，具体是一种定量检测孕妇血液中存在三体可能性的异常染色体与正常染色体相对含量的试剂盒及其使用方法。
背景技术
染色体异常遗传病是一类由染色体数目异常和形态畸变引起的疾病，易引发自发性流产、死胎和早夭，是先天性心脏病、智力发育障碍的重要原因之一。随着生物医学技术的发展，越来越多的染色体畸变型疾病被发现。其中较为特殊的是一类常染色体三体类疾病，主要包括21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征。21-三体综合征，即唐氏综合征(Down’s Syndrome)，是一种染色体异常引起的不可治愈的先天愚型疾病，主要是因患者多了一条21号染色体，核型为46，XX(或XY)，+21；患者的平均寿命只有16.2岁，并且患者的白血病发病率是普通人的15倍左右(黄心宇.唐氏综合征产前筛查测试系统的研究与设计[D].福州大学,2004.)。18三体综合征，又称Edward综合征，80％患者核型为47，XY(或XX)，+18；患儿大多在2－3个月内死亡，平均存活71天。13三体综合征，又称Patau综合征，80％的病例为游离型13三体，核型为47，XX(或XY)，+13；45％的患儿在出生后一个月内死亡，90％在6个月内死亡，存活至3岁者少于5％，平均寿命为130天。因此，这类三体类染色体异常疾病的产前筛查引起了社会和家庭的广泛关注。
目前，孕妇产前筛查的手段包括创伤性和无创性两类。其中，创伤性检测手段是指羊水、脐血穿刺或绒毛膜取样，给孕妇造成较大痛苦。因此，创伤性检查主要针对高危人群，可能遗漏不属于高危孕妇的患者。无创性检查包括超声检查、血清学检测和血液标识性核酸检测等。超声检查作为一种非侵入性的检查方法，针对“超声孕周”(10-13周)的胎儿进行颈部半透明层厚度(Nuchal Translucency,NT)检测，因为唐氏综合征患儿颈部软组织多有水肿体征(宋文龄.超声产前筛查唐氏综合症[D].吉林大学,2005.)。目前，应用较广泛的血清学检测标记物有以下四种，分别是妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、游离β-人类绒毛膜促性腺激素(F-β-hCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(uE3)和抑制素-A(Inhibin-A)。由于这类血清标记物单独使用都存在检出率低、假阴性或假阳性高等问题，所以近期实际检测采用多项标记联合筛查的手段。目前，应用最广泛的筛查方案是在孕早期进行PAPP-A+β-HCG二联筛查，孕中期(15～20周)采用AFP+β-hCG+uE3三联和AFP+β-hCG+uE3+Inhibin-A四联筛查，其中孕早期检出率只有60％～65％，孕中期检出率能达到60％～80％，但假阳性率高，绝大部分唐筛高危孕妇需要经历羊水穿刺诊断(刘维娜.唐氏综合征产前筛查的研究进展[J].中国医药导报,2011,08(1):13-15.；梁雄,朱锋,朱兰芳,等.3195例孕中期唐氏综合征的血清筛查和产前诊断临床分析[J].中国现代医学杂志,2005,15(20):3079-3081.；Wald N J,Huttly W J,Hackshaw A K.Antenatal screening for Down's syndrome with thequadruple test.[J].Lancet,2003,361(9360):835-6.)。除此之外，研究者还发现妊娠妇女血浆和血清中存在细胞游离胎儿DNA和RNA，可以此为依据进行无创性检查。Lo等研究证实母体血浆中的PLAC4mRNA来源于胎儿，而血液中没有或极少来源于母亲的同样基因的mRNA。这样，采用质谱分析对其SNP位点定量分析，就可以用于检测唐氏综合征。例如，在21三体胎儿中的AAG基因型等位基因G/A比率为0.5，而正常(二倍体)婴儿G/A比率为1(Lo YM.Noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidies bymaternal plasma nucleic acid analysis:a review of the current state of theart.[J].BJOG:An International Journal of Obstetrics&Gynaecology,2009,116(Supplement):152-7.)。采用这种方法，母体血浆RNA-SNP分析法灵敏度可达到90％，特异性可达到96.5％。
现有的羊水、脐血穿刺或绒毛膜取样检测准确度高，但是容易对妊娠妇女造成较大伤痛。而无创性类的检测手段中超声检测准确度低，适用于辅助筛查；血清学检测中单一标记物难以实现检测要求，而多标记物联合检测方法繁琐、血清学检测复杂，准确度有限。妊娠妇女血浆和血清中游离胎儿DNA和RNA的检测手段对研究人员的技术水平要求高，检测方法的灵敏度90％左右，而且往往需要借助昂贵的高通量检测平台或质谱检测平台。现有的技术仍无法实现高效、精确、快速、简便的检测要求。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一种简单方便、检测快速、且准确率和灵敏度高的无创血液产前诊断孕妇胎儿三体综合征(21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征)的试剂盒及其使用方法。
一种无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒，其特征在于，主要包括以下组份：针对21号、18号或13号染色体中的一条或几条设计的上下游引物对PP三体；针对除21号、18号及13号染色体外的其它常染色体中的任一条设计的上下游引物对PP常；其中任一对PP三体与PP常需满足以下条件：①四条引物两两之间的熔点差值在4℃以内，②扩增子长度≤150bp，且不产生非目的产物，③两个扩增子的熔点差值在2℃以上，④两个扩增子的熔解峰明显分离，不形成肩峰。
由于母体血清中游离胎儿DNA长度一般<300bp，因此在设计引物时将扩增子长度控制在150bp以内。
进一步地，引物对PP三体与PP常中任一条引物需满足以下条件：引物长度22±2nt，引物Tm 58±2℃。
进一步地，引物对PP三体与PP常的获得方式为：
(a)针对21号、18号或13号染色体和其它常染色体中的任一条或数条分别设计并合成数对引物；
(b)用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，加上步骤(a)的不同对引物分别配制PCR反应体系并进行单重PCR反应；取PCR产物进行电泳检查PCR产物单一性，选取产物单一的引物留用；
(c)用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，对步骤(b)中筛选到的引物进行单重荧光定量PCR及高分辨率熔解曲线(HRM)分析，从而获得相应扩增子的熔点(Tm)，选取21号、18号或13号染色体和其它常染色体扩增子熔点差值在2℃及以上的组合，作为双重PCR的引物组合；
(d)用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，对步骤(c)中筛选到的引物组合进行双重荧光定量PCR及高分辨率熔解曲线分析，如果HRM结果显示具有与单重PCR产物Tm相对应的两个熔解峰(Tm差值±0.5℃以内认为溶解峰对应)，峰型尖锐、无杂峰、无肩峰，且峰高比值的范围是0.5-2.0，则将这对引物作为可用的引物组。
进一步地，已证实可用的引物组合有：序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4的组合；SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的组合；SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的组合；SEQ ID No.11、SEQID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的组合；SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18的组合。
进一步地，所述试剂盒中还包含有荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂包括荧光染料、Taq DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTPs、K+溶液或Mg2+溶液中的一种或几种。所述荧光染料选自Eva Green、LC Green或Sybr Green I，所述反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液。本发明的试剂盒在使用时，可根据实际需要取适量的各组份配制荧光定量PCR反应体系。本发明的引物组合是试剂盒的核心组份，还可以根据其使用过程中所需应用的试剂来添加其它相关试剂，也可自行配备。
上述无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测孕妇血清DNA作为检测三体综合征的双重PCR的模板，同时提取怀有正常胎儿孕妇的血清DNA或未孕健康妇女血清DNA作为阴性对照；
(2)分别以步骤(1)的待检测DNA和对照DNA作为模板，以引物对PP三体与PP常作为同一反应体系中的双重引物，进行双重荧光定量PCR及高分辨率熔解曲线(HRM)分析；每个样品进行10-100次平行试验(为的是使下步峰值计算时峰高比值的误差小于1％，避免误差对检测结果的影响)；
(3)熔解曲线进行微分运算(荧光值F相对温度T的一阶微分求导的负数，可用荧光定量PCR仪自带的软件或其它运算软件如Origin进行计算)后，计算21号、18号、13号染色体和其它常染色体PCR产物微分曲线的峰高并分别取平均值H21、H18、H13和HcNo；然后计算H21、H18、H13与HcNo比值(H21/HcNo、H18/HcNo、H13/HcNo)。
进一步地，三体综合征阳性孕妇的H21/HcNo、H18/HcNo、H13/HcNo值比怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女高2％以上，根据这一指标确定是否有三体综合征。
进一步地，步骤(2)中的双重荧光定量PCR采用两步法PCR或三步法PCR，两步法PCR的程序为：92-95℃预变性2-5min，两步扩增92-95℃ 10-30s→52-60℃ 20-60s，25-35个循环；三步法PCR的程序为：92-95℃预变性2-5min，三步扩增92-95℃ 10-30s→52-60℃ 10-20s→72℃20-60s，25-35个循环。
进一步地，步骤(2)中的双重荧光定量PCR的反应体系为：模板DNA 1pg-20ng/μL，每条引物0.1-1μM，dNTP各0.1-1mM，MgCl2 1-10mM，45-55mM KCl，8-12mM Tris-HCl，0.01-0.1U/μL Taq DNA聚合酶，0.5～2×荧光染料，水余量。
进一步地，步骤(2)中HRM的条件为：首先将荧光定量PCR产物于50～60℃温育1～5min，然后从50～60℃缓慢升温至90～95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集，温度维持时间2s。
进一步地，步骤(2)中双重荧光定量PCR的循环数比Ct值高3-5个循环。
本发明中所述怀有正常胎儿孕妇的血清是产下正常胎儿产妇的孕期血清。
三体综合征阳性孕妇的H21/HcNo、H18/HcNo、H13/HcNo值比怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女高的原因在于：在母体血清中，母体自身的21号、18号或13号染色体与其它常染色体的比例理论上是1：1，而健康胎儿的血清中也是1：1，所以怀有健康胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清中21号染色体与其它常染色体的比例理论上是1：1。而患有三体综合征的胎儿的核型中多了一条21号、18号或13号染色体，所以患病胎儿的血清中的比例是3：2，而孕妇血液中所含胎儿血液比例为5％～10％，所以在怀有三体综合征胎儿的孕妇血液中该比例大于1。本申请人经大量实验验证，实际双重PCR检测中，21号、18号或13号染色体与其它染色体的比例不一定是1：1，但是怀有三体综合征胎儿的孕妇血液中该比例大于怀有健康胎儿的孕妇，比怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女高2％以上。
如图1所示的为21号染色体与22号染色体不同含量配比的样品荧光熔解曲线和微分曲线：样品A(A)中21号与22号染色体模板相对拷贝数配比为1：1，样品B(B)中21号染色体与22号染色体模板含量配比1.05：1；PCR扩增所用引物序列为引物对组合19/46；21号染色体PCR产物熔点为77.4℃，22号染色体PCR产物熔点为81.1℃；H21和H22分别代表21号染色体和22号染色体PCR产物在微分曲线中的峰高。从图1中可以看出，B样品的H21/H22值与A样品相比明显偏高，说明唐氏阳性孕妇的H21/H22值与怀健康胎儿孕妇相比偏高。
本发明的试剂盒及其使用方法具有以下优势：
(1)本试剂盒的组成简单，成本低廉，适于推广使用；
(2)使用本试剂盒可以使有效唐筛的孕周时间提前至少三周；
(3)本试剂盒的检测结果不存在假阴性和假阳性的问题，其使用方法采用的是双重PCR，从本质上避免了假阴性和假阳性扩增；
(4)本试剂盒的使用方法简便快速，引物对PP三体与PP常可以通用，具体检测时仅涉及双重PCR和高分辨率熔解曲线分析，检测时间不超过1.5小时。
(5)本试剂盒采用高分辨率熔解曲线进行分析，准确度和灵敏度高；采用双重产物峰高比值作为检测指标，误差小，精度高。
附图说明
图1 21号染色体与22号染色体不同含量配比的样品荧光熔解曲线和微分曲线；
图2 19/46引物组对孕周18周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图3 19/46引物组对孕周16周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图4 19/46引物组对孕周14周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图5 19/46引物组对孕周13周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图6 19/46引物组对孕周12周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图7 31/33引物组对孕周12周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图8 2/33引物组对孕周12周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图9 55/68引物组对孕周14周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图10 91/105引物组对孕周14周孕妇血清DNA进行双重荧光定量PCR-HRM结果；
图2-10中，A：产下健康胎儿产妇的孕期血清或未孕健康妇女血清；B.羊水穿刺检测为三体综合征的孕妇血清。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒的制备(针对21三体综合征)
引物对PP三体与PP常的设计、合成及筛选步骤如下：
(a)以人体21号染色体和随机选取的22号染色体为对象，从NCBI人类基因组数据库中下载相应染色体序列信息“NC_000021.9Homo sapiens chromosome 21,GRCh38.p2”和“NC_000022.11Homo sapiens chromosome 22,GRCh38.p2”。采用引物设计软件PrimerPremier6.0对下载的DNA序列分别设计21号和22号染色体的引物对，为保证两个染色体的引物能够在同一个条件下具有相近的扩增效率，将两者引物对的设计条件限定一致：①引物熔点58±2℃，②引物长度20-22nt，③扩增子长度100bp。针对21号染色体共设计并合成32对引物，如表1所示，针对22号染色体共设计并合成15对引物，如表2所示。
表1针对21号染色体设计的引物对PP三体序列信息
Figure BDA0001282033890000061
Figure BDA0001282033890000071
注：*标记为单重PCR和高分辨率熔解曲线分析筛选到的合格引物对；“-”为产物HRM有杂峰。
表2针对22号染色体设计的引物对PP常序列信息
Figure BDA0001282033890000072
注：*标记为单重PCR和高分辨率熔解曲线分析筛选到的合格引物对。
(b)用怀有正常胎儿的孕妇血清DNA做模板，加上表1、2中的不同对引物分别配制PCR反应体系并进行单重荧光定量PCR反应(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上下游引物分别0.2μM，1×PCR master mix(Biotium，#31042-1)，共10μL；PCR的程序为：95℃预变性3min，两步扩增95℃ 15s→60℃ 45s，30个循环)。一方面取PCR产物进行电泳检查PCR产物单一性，另一方面对PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析(HRM的条件为：首先将荧光定量PCR产物于60℃温育2min，然后从50℃缓慢升温至90℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集，温度维持时间2s，留取峰型尖锐、无杂峰的引物对)，从而获得相应扩增子的熔点(Tm)，如表1-2所示。结果发现，针对21号染色体设计的32对引物对中有17对可用于后续双重PCR检验；而针对22号染色体设计的15对引物对中有6对可用于后续双重PCR检验，见表1-2中带*标记的引物对，将这些引物对留用。
(c)选取21号染色体和22号常染色体扩增子熔点差值在2℃及以上的引物对组合共35对：2/33，2/38，3/33，4/38，5/33，10/33，10/38，10/46，11/39，11/41，12/38，14/33，14/46，16/38，17/33，17/38，17/46，18/33，18/38，18/46，19/33，19/38，19/39，19/40，19/41，19/46，23/33，23/38，23/46，31/33，31/38，31/39，31/40，31/41，31/46，作为双重PCR的引物组合。
(d)用怀有正常胎儿的孕妇血清DNA做模板，对步骤(c)中筛选到的引物组合进行双重荧光定量PCR(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCRmaster mix(Biotium，#31042-1)，共10μL；PCR程序为：95℃预变性3min，两步扩增95℃ 15s→60℃ 45s，30个循环)及高分辨率熔解曲线分析，其中引物对组合2/33，2/38，3/33，4/38，17/38，17/46，19/33，19/38，19/39，19/40，19/41，19/46，23/33，23/38，23/46，31/33，31/38，31/39的HRM结果显示与单重PCR两个产物的Tm分别相对应的两个熔解峰，且峰型良好，峰高比值在0.5-2.0之间，因此将这些对引物作为可用的引物组。
实施例2：利用实施例1的试剂盒对孕中期(18周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用19/46的引物对组合。
21号染色体引物对19：上游引物5’-GTCCCTTCACTGTCTGCCTACT-3’(SEQ ID No.1)，下游引物5’-GCCAAGACTTGAGCCCATACTG-3’(SEQ ID No.2)；
22号染色体引物对46：上游引物5’-TCGGTGAGGCACATCAGCAT-3’(SEQ ID No.3)，下游引物5’-GGACAGGACATGGTTGGTGAGA-3’(SEQ ID No.4)；
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕中期血清(孕周18周)，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕中期血清(孕周18周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为15.3ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL：模板DNA 0.5ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR master mix(Biotium，#31042-1)；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→60℃ 45s共30个循环，得到PCR产物，每个样品进行10次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为78.0℃和81.4℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕中期(孕周18周)血清H21/H22分别为0.90±0.01和0.95±0.01(如图2所示)。结果表明，本发明试剂盒的19/46引物组可以实现对孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，能够区分孕18周的怀有健康胎儿的孕妇与怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异。
实施例3：利用实施例1的试剂盒对孕中期(16周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用19/46的引物对组合。
模板样品：a.未孕健康妇女的血清，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕中期血清(孕周16周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为11.9ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 1.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→55℃ 15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行10次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为78.0℃和81.4℃，未孕健康妇女及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕中期(孕周16周)血清H21/H22分别为0.90±0.01和0.96±0.01(如图3所示)。结果表明，本发明试剂盒的19/46引物组可以实现对孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，能够区分未孕健康妇女与孕16周的怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异。
实施例4：利用实施例1的试剂盒对孕早期(14周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用19/46的引物对组合。
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周14周)，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕早期血清(孕周14周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为17.9ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 2.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→55℃15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行10次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为78.0℃和81.4℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕早期(孕周14周)血清H21/H22分别为0.90±0.01和0.97±0.02(如图4所示)。结果表明，本发明试剂盒的19/46引物组可以实现对孕早期14周孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异。一般唐氏三联筛查在孕周15～20周内才可进行，本发明试剂盒可以将诊断时间提前至少1周。
实施例5：利用实施例1的试剂盒对孕早期(13周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用19/46的引物对组合。
模板样品：a.未孕健康妇女的血清，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕早期血清(孕周13周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为10.5ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 3.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→55℃ 15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行15次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为78.0℃和81.6℃，未孕健康妇女及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕早期(孕周13周)血清H21/H22分别为0.90±0.01和0.98±0.01(如图5所示)。结果表明，本发明试剂盒的19/46引物组可以实现对血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分未孕健康妇女的血清与孕13周的怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异，本发明试剂盒可以将诊断时间提前至少2周。
实施例6：利用实施例1的试剂盒对孕早期(12周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用19/46的引物对组合。
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周12周)，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕早期血清(孕周12周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为10.8ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 4.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→55℃15s→72℃ 45s共35个循环，每个样品进行20次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为78.0℃和81.4℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕早期(孕周12周)血清H21/H22分别为0.92±0.02和0.99±0.02(如图6所示)。结果表明，本发明试剂盒的19/46引物组可以实现对孕早期12周孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异，本发明试剂盒可以将诊断时间提前至少3周。
实施例7：利用实施例1的试剂盒对孕早期(12周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用31/33的引物对组合。
21号染色体引物对31：上游引物5’-CGCAACCCTTCTTGTCCCTATC-3’(SEQ ID No.5)，下游引物5’-ACTGTCTACGCTTCTGGATGCT-3’(SEQ ID No.6)；
22号染色体引物对33：上游引物5’-CGGCTGGCACAGTAACATCAAT-3’(SEQ ID No.7)，下游引物5’-CACGAGACGGTGTGGAGGAT-3’(SEQ ID No.8)；
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周12周)，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕早期血清(孕周12周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为10.1ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 5.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→60℃ 45s共30个循环，每个样品进行20次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为76.6℃和81.8℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕早期(孕周12周)血清H21/H22分别为0.81±0.02和0.88±0.01(如图7所示)。结果表明，本发明试剂盒的31/33引物组可以实现对孕早期12周孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异，可以将诊断时间提前至少3周。此外，还说明本发明试剂盒的引物设计较为普遍适用。
实施例8：利用实施例1的试剂盒对孕早期(12周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿21三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用2/33的引物对组合。
21号染色体引物对2：上游引物5’-TGGGACCCTGGATAGCAATAGC-3’(SEQ ID No.9)，下游引物5’-TGTATCTGGACAGCACCGAAGT-3’(SEQ ID No.10)；
22号染色体引物对33：上游引物5’-CGGCTGGCACAGTAACATCAAT-3’(SEQ ID No.7)，下游引物5’-CACGAGACGGTGTGGAGGAT-3’(SEQ ID No.8)；
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周12周)，b.羊水穿刺检测为21三体综合征的孕早期血清(孕周12周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为9.3ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 6.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→55℃15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行20次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于60℃温育2min；然后从60℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，21号和22号染色体PCR产物熔点分别为79.1℃和81.8℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为21三体综合征孕妇的孕早期(孕周12周)血清H21/H22分别为1.05±0.01和1.12±0.01(如图8所示)。结果表明，本发明试剂盒的2/33引物组可以实现对孕早期12周孕妇血清中21号与22号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有唐氏胎儿的孕妇血清中21号与22号染色体相对含量差异，可以将诊断时间提前至少3周。此外，还说明本发明试剂盒的引物设计较为普遍适用。
实施例9：无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒的制备(针对18三体综合征)
引物对PP三体与PP常的设计、合成及筛选步骤如下：
(a)以人体18号染色体和随机选取的9号染色体为对象，从NCBI人类基因组数据库中下载相应染色体序列信息“NC_000018.10Homo sapiens chromosome 18,GRCh38.p7”和“NC_000009.12Homo sapiens chromosome 9,GRCh38.p7”。采用引物设计软件PrimerPremier6.0对下载的DNA序列分别设计18号和9号染色体的引物对，要求同实施例1。针对18号染色体共设计并合成15对引物，如表3所示，针对9号染色体共设计并合成15对引物，如表4所示。
表3针对18号染色体设计的引物对PP三体序列信息
Figure BDA0001282033890000141
Figure BDA0001282033890000151
注：*标记为单重PCR和高分辨率熔解曲线分析筛选到的合格引物对。
表4针对9号染色体设计的引物对PP常序列信息
Figure BDA0001282033890000152
注：*标记为单重PCR和高分辨率熔解曲线分析筛选到的合格引物对。
(b)用未孕健康妇女血清DNA做模板，加上表3-4的不同对引物分别配制PCR反应体系并进行单重PCR反应(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上下游引物分别0.2μM，1×PCRmaster mix(Biotium，#31042-1)，共10μL；PCR的程序为：95℃预变性3min，两步扩增95℃15s→60℃ 45s，30个循环)。一方面取PCR产物进行电泳检查PCR产物单一性，另一方面对PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析(HRM的条件为：首先将荧光定量PCR产物于60℃温育2min，然后从50℃缓慢升温至90℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集，温度维持时间2s，留取峰型尖锐、无杂峰的引物对)，从而获得相应扩增子的熔点(Tm)，如表3-4所示。结果发现，针对18号染色体设计的15对引物对中有9对可用于后续双重PCR检验；而针对9号染色体设计的15对引物对中有10对可用于后续双重PCR检验，见表3-4中带*标记的引物对，将这些引物对留用。
(c)选取18号染色体和9号常染色体扩增子熔点差值在2℃及以上的引物对组合48/64、48/67、48/68、48/70、48/71、48/72、48/73、48/74、49/64、49/67、49/68、49/70、49/71、49/72、49/73、49/74、50/64、50/67、50/70、50/72、50/73、51/64、51/67、51/70、51/72、51/73、55/64、55/67、55/68、55/70、55/71、55/72、55/73、55/74、56/64、56/67、56/68、56/70、56/71、56/72、56/73、56/74、57/64、57/67、57/70、57/72、57/73、59/64、59/65、59/66、59/67，作为双重PCR的引物组合。
(d)用未孕健康妇女血清DNA做模板，对步骤(c)中筛选到的引物组合进行双重荧光定量PCR(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR master mix(Biotium，#31042-1)，共10μL；PCR程序为：95℃预变性3min，两步扩增95℃ 15s→60℃45s，30个循环)及高分辨率熔解曲线分析，其中引物对组合48/64、48/68、48/70、48/73、、49/64、49/67、49/68、49/72、49/73、49/74、50/64、50/67、50/70、50/72、51/64、51/73、55/64、55/67、55/68、55/70、55/71、55/72、55/73、55/74、56/72、56/73、56/74、57/64、57/67、57/70、57/72、57/73、59/64的HRM结果显示与单重PCR两个产物的Tm分别相对应的两个熔解峰，且峰型良好，峰高比值在0.5-2.0之间，因此将这些对引物作为可用的引物组。
实施例10：利用实施例9的试剂盒对孕早期(14周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿18三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用55/68的引物对组合。
18号染色体引物对55：上游引物5’-AAGCTGGCTCCTCTACTGATGC-3’(SEQ IDNo.11)，下游引物5’-TGCCTGCCTGGATCATGGTAAG-3’(SEQ ID No.12)；
9号染色体引物对68：上游引物5’-CATACTGCCGTTCATCGCCTG-3’(SEQ ID No.13)，下游引物5’-GCTGCTCTTGCCACCTCTGT-3’(SEQ ID No.14)；
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周14周)，b.羊水穿刺检测为18三体综合征的孕早期血清(孕周14周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为15.7ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 7.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→56℃15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行20次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于50℃温育1min；然后从50℃缓慢升温至90℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，18号和9号染色体PCR产物熔点分别为78,2℃和82.7℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为18三体综合征孕妇的孕早期(孕周14周)血清H18/H9分别为0.98±0.01和1.07±0.01(如图9所示)。结果表明，本发明试剂盒的55/68引物组可以实现对孕周14周孕妇血清中18号与9号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有Edward综合征胎儿的孕妇血清中18号与9号染色体相对含量差异，实现对胎儿18三体综合征的早期检测。
实施例11：无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒的制备(针对13三体综合征)
引物对PP三体与PP常的设计、合成及筛选的步骤如下：
(a)以人体13号染色体和随机选取的17号染色体为对象，从NCBI人类基因组数据库中下载相应染色体序列信息“NC_000013.11 Homo sapiens chromosome 13,GRCh38.p7”和“NC_000017.11Homo sapiens chromosome 17,GRCh38.p7”。采用引物设计软件PrimerPremier 6.0对下载的DNA序列分别设计13号和17号染色体的引物对，要求同实施例1。针对13号染色体共设计并合成15对引物，如表5所示，针对17号染色体共设计并合成15对引物，如表6所示。
表5针对13号染色体设计的引物对PP三体序列信息
Figure BDA0001282033890000171
Figure BDA0001282033890000181
表6针对17号染色体设计的引物对PP常序列信息
Figure BDA0001282033890000182
(b)用怀有正常胎儿的孕妇血清DNA做模板，加上表5-6的不同对引物分别配制PCR反应体系并进行单重PCR反应(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上下游引物分别0.2μM，1×PCR master mix(Biotium，#31042-1)，共10μL。一方面取PCR产物进行电泳检查PCR产物单一性，另一方面对PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析(HRM的条件为：首先将荧光定量PCR产物于60℃温育2min，然后从50℃缓慢升温至90℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集，温度维持时间2s，留取峰型尖锐、无杂峰的引物对)，从而获得相应扩增子的熔点(Tm)，如表5-6所示。结果发现，针对13号染色体设计的15对引物对中有5对可用于后续双重PCR检验；而针对17号染色体设计的15对引物对中有4对可用于后续双重PCR检验，见表5-6中带*标记的引物对，将这些引物对留用。
(c)选取13号染色体和17号常染色体扩增子熔点差值在2℃及以上的引物对组合78/94、78/103、80/93、80/94、80/103、80/105、81/93、81/94、81/105、86/94、86/103、91/93、91/94、91/103、91/105，作为双重PCR的引物组合。
(d)用怀有正常胎儿的孕妇血清DNA做模板，对步骤(c)中筛选到的引物组合进行双重荧光定量PCR(PCR体系为：模板DNA 1.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCRmaster mix(Biotium，#31042-1)，共10μL；PCR程序为：95℃预变性3min，两步扩增95℃ 15s→60℃ 45s，30个循环)及高分辨率熔解曲线分析，其中引物对组合78/94、78/103、80/93、80/94、86/103、91/93、91/94、91/103、91/105的HRM结果显示与单重PCR两个产物的Tm分别相对应的两个熔解峰，且峰型良好，峰高比值在0.5-2.0之间，因此将这些对引物作为可用的引物组。
实施例12：利用实施例11的试剂盒对孕早期(14周)妊娠妇女进行采血诊断胎儿13三体综合征
(1)材料
本实施例中选择采用91/105的引物对组合。
13号染色体引物对91：上游引物5’-TGAGGTGCTGTGGAAGTGGAG-3’(SEQ ID No.15)，下游引物5’-GGCAAGGTGAGACATCCATCCA-3’(SEQ ID No.16)；
17号染色体引物对105：上游引物5’-ATCCTCCCACCTCAGCCTTTG-3’(SEQ IDNo.17)，下游引物5’-CACAATGAAACCGCCGTCTCTT-3’(SEQ ID No.18)；
模板样品：a.产下健康胎儿产妇的孕早期血清(孕周14周)，b.羊水穿刺检测为13三体综合征的孕早期血清(孕周14周)。
(2)模板DNA提取
采用QIAamp DNA Kits(Qiagen，#51304)提取妊娠妇女血清DNA，所得DNA样品浓度为20.6ng/μL。
(3)双重荧光定量PCR
反应体系10μL，模板DNA 8.0ng/μL，上述四条引物分别0.2μM，1×PCR mastermix；反应条件95℃ 3min，95℃ 15s→58℃15s→72℃ 45s共30个循环，每个样品进行20次平行试验。
(4)高分辨率熔解曲线分析
将上步骤得到的PCR产物置于荧光定量检测仪，首先于55℃温育5min；然后从55℃缓慢升温至95℃，温度每升高0.1℃进行一次荧光信号采集(温度维持时间2s)。
(5)熔解曲线结果分析
熔解曲线进行微分运算后可知，13号和17号染色体PCR产物熔点分别为81.0℃和77.5℃，产下健康胎儿及羊水穿刺为13三体综合征孕妇的孕早期(孕周14周)血清H13/H17分别为1.24±0.02和1.29±0.01(如图10所示)。结果表明，本发明试剂盒的91/105引物组可以实现对孕早期14周孕妇血清中13号与17号染色体相对含量的精确定量，并且能够区分此孕期怀有健康胎儿的孕妇与怀有Patau综合征胎儿的孕妇血清中13号与17号染色体相对含量差异，实现对胎儿13三体综合征的早期检测。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛千卓分子生物科技有限公司
<120> 无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒及其使用方法
<130> 2017
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtcccttcac tgtctgccta ct 22
<210> 2
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gccaagactt gagcccatac tg 22
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<213> Homo sapiens
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cgcaaccctt cttgtcccta tc 22
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<400> 13
catactgccg ttcatcgcct g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gctgctcttg ccacctctgt 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
tgaggtgctg tggaagtgga g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ggcaaggtga gacatccatc ca 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
atcctcccac ctcagccttt g 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
cacaatgaaa ccgccgtctc tt 22

Claims (3)

1.一种无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒，其特征在于，主要包括以下组份：
针对21号、18号或13号染色体中的一条或几条设计的上下游引物对PP三体；针对除21号、18号及13号染色体外的其它常染色体中的任一条设计的上下游引物对PP常；其中任一对PP三体与PP常需满足以下条件：①四条引物两两之间的熔点差值在4oC以内，②扩增子长度≤150bp，且不产生非目的产物，③两个扩增子的熔点差值在2oC以上，④两个扩增子的熔解峰明显分离，不形成肩峰；
所述引物对PP三体与PP常中任一条引物需满足以下条件：引物长度22±2nt，引物T m 58±2oC；
所述引物对PP三体与PP常的获得方式为：
（a）针对21号、18号或13号染色体和其它常染色体中的任一条或数条分别设计并合成数对引物；
（b）用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，加上步骤（a）的不同对引物分别配制PCR反应体系并进行单重PCR反应；取PCR产物进行电泳检查PCR产物单一性，选取产物单一的引物留用；
（c）用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，对步骤（b）中筛选到的引物进行单重荧光定量PCR及高分辨率熔解曲线分析，从而获得相应扩增子的熔点，选取21号、18号或13号染色体和其它常染色体扩增子熔点差值在2oC及以上的组合，作为双重PCR的引物组合；
（d）用怀有正常胎儿的孕妇或未孕健康妇女血清DNA做模板，对步骤（c）中筛选到的引物组合进行双重荧光定量PCR及高分辨率熔解曲线分析，如果HRM结果显示具有与单重PCR产物T m相对应的两个熔解峰，峰型尖锐，无杂峰、无肩峰，且峰高比值的范围是0.5-2.0，则将这对引物作为可用的引物组；
其中，可用的引物组为：序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4的组合；SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的组合；SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的组合；SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的组合；SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQID No.18的组合。
2.根据权利要求1所述的无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂包括荧光染料、Taq DNA 聚合酶、反应缓冲液、dNTPs、K+溶液或Mg2+溶液中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的无创产前诊断孕妇胎儿三体综合征的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自Eva Green、LC Green或Sybr Green I，所述反应缓冲液为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844408A (zh) * 2006-02-10 2006-10-11 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法
CN102409088A (zh) * 2011-09-22 2012-04-11 郭奇伟 一种基因拷贝数变异的检测方法
CN106191233A (zh) * 2016-07-06 2016-12-07 上海桀蒙生物技术有限公司 多重实时定量pcr检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040086867A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-06 Jian Han Method for detecting nucleic acid
CN1683566A (zh) * 2005-03-17 2005-10-19 刘敬忠 唐氏综合征基因诊断新技术及其应用
CN102146462B (zh) * 2011-01-27 2012-12-05 郭辉 一种唐氏综合征sybr荧光筛查试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844408A (zh) * 2006-02-10 2006-10-11 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法
CN102409088A (zh) * 2011-09-22 2012-04-11 郭奇伟 一种基因拷贝数变异的检测方法
CN106191233A (zh) * 2016-07-06 2016-12-07 上海桀蒙生物技术有限公司 多重实时定量pcr检测染色体非整倍体的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid Diagnosis of Aneuploidy by High-Resolution Melting Analysis of Segmental Duplications;Qiwei Guo等;《Clinical Chemistry》;20121231;第58卷(第6期);第1019-1025页 *
Rapid Prenatal Diagnosis of Common Numerical Chromosomal Abnormalities by High-Resolution Melting Analysis of Segmental Duplications;Yulin Zhou等;《GENETIC TESTING AND MOLECULAR BIOMARKERS》;20141231;第18卷(第3期);第141-148页 *

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