CN102146462B - 一种唐氏综合征sybr荧光筛查试剂盒 - Google Patents

一种唐氏综合征sybr荧光筛查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种唐氏综合征SYBR荧光筛查试剂盒。本发明提供的试剂盒包括序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的专用引物。本发明的试剂盒有如下优点：采用量化标准结果容易判断，准确度高；采用SYBR反应染料省略了荧光定量PCR技术中探针的应用可避免因复序列造成的假阳性结果；引入Dissociation Stage可以有效控制非特异扩增的出现；只需要48小时，可有效减轻孕妇和家人等待染色体报告过程中的焦虑和痛苦；所需检材少，只需要5ml羊水或者0.2ml脐血或者少量绒毛就可以进行检测，减少了取材对胎儿的影响。

Description

一种唐氏综合征SYBR荧光筛查试剂盒
技术领域
本发明涉及一种产前诊断的试剂盒及其专用扩增引物，特别是涉及一种唐氏综合征SYBR荧光筛查试剂盒及其专用扩增引物。
背景技术
唐氏综合征(又称Down综合征或DS)是新生儿中最常见的一种染色体病，出生后将表现为智力低下，部分胎儿伴有畸形。新生儿的唐氏综合症的发生率约为1/1000-2/1000。按目前的出生率，我国平均每20分钟就有一例唐氏患儿出生，全国每年出生的唐氏患儿可多达27000例左右。DS患者尚无有效的治疗方法，这些患者的存在给社会及家庭带来沉重的精神和经济负担。产前诊断并及时淘汰该类胎儿是实现优生优育的主要手段之一。
目前，产前诊断DS的主要方法仍然是已用百年的细胞核型分析方法，即羊水、绒毛或脐血的染色体核型分析。细胞核型分析方法是诊断染色体病的金标准，但该方法程序繁琐，检验周期长，从取材到报告发出至少需要2-3周的时间，等待报告过程中孕妇的焦虑情绪不但会给家庭造成心理负担而且会对胎儿产生不良影响。
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是指基因组DNA中存在一类重复单位长度为2bp-6bp的重复序列，是人类的DNA指纹。
发明内容
本发明的目的是提供一种唐氏综合征SYBR荧光筛查试剂盒。
本发明提供了一种辅助鉴定唐氏综合征患者的专用引物，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
所述专用引物可用于制备辅助鉴定唐氏综合征患者的试剂盒。
本发明还保护一种辅助鉴定唐氏综合征患者的试剂盒，包括所述专用引物。
所述试剂盒还可包括SYBR荧光染料。
所述试剂盒还可包括
Figure BDA0000045658730000011
Premix Ex Taq TM II和ROX Reference Dye II。
所述试剂盒还可包括其它PCR常规试剂和提取的基因组DNA常规试剂。
本发明提供的试剂盒应用STR的荧光定量PCR技术快速诊断唐氏综合征，具有如下优点：采用量化标准，结果容易判断，准确度高；采用SYBR反应染料，省略了荧光定量PCR技术中探针的应用，可以避免因复序列造成的假阳性结果；实验中引入Dissociation Stage，可以有效控制非特异扩增的出现；从取材到报告发出只需要48小时，可以有效减轻孕妇和家人等待染色体报告过程中的焦虑和痛苦；所需检材少，只需要5ml羊水或者0.2ml脐血或者少量绒毛就可以进行检测，减少了取材对胎儿的影响。本发明基于对包括有短串联重复序列的基因区域相对定量分析，以确定是否存在引起DS的异常染色体，从而早期诊断DS，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为样本D12的D19s222参照位点的反应曲线。
图2为样本D12的D19s222参照位点的溶解曲线。
图3为样本D12的D21s1259检测位点的反应曲线。
图4为样本D12的D21s1259检测位点的溶解曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、检测DS的STR专用位点引物的设计
根据对国际STR数据库基因序列分析，以D21s1259为检测位点，D19s222为参照位点，根据SYBR荧光PCR引物设计原则，经NCBI-Blast分析与其他人类基因组无100％同源性序列，理论排除非特异反应的可能性设计引物。
D21s1259检测位点专用引物由正向引物D21s1259-F和反向引物D21s1259-R组成。D19s222参照位点专用引物由正向引物D19s222-F和反向引物D19s222-R组成。
D21s1259-F(序列表的序列1)：5’-TGTTGGTCATAAGCAAAGGTTAAAAT-3’；
D21s1259-R(序列表的序列2)：5’-GGCGCCGTGTGTAAGAGTGT-3’。
D19s222-F：5’-TTTCCTGAAGATTATTTTGGCCTT-3’；
D19s222-R：5’-CTCATTCTCAAACAAAAAAGTCAAGG-3’。
实施例2、应用设计的引物辅助鉴定DS
一、质控品的制备
标准品包括：阴性质控品和阳性质控品。
阴性质控品：取经典染色体检测方法(细胞核型分析方法)确诊为非DS患者的羊水，提取基因组DNA，作为阴性质控品(分装，在-20℃保存)。
阳性质控品：取经典染色体检测方法(细胞核型分析方法)确诊为DS患者的羊水，提取基因组DNA，作为阳性质控品(分装，在-20℃保存)。
阴性质控品和阳性质控品也可以采用体外DNA扩增技术大量制备。
二、应用设计的引物辅助鉴定DS
144个样本分别为参照标准操作规程采集自144个个志愿者的羊水(每个志愿者采集20-25ml)，其中130个为采自经典染色体检测方法(细胞核型分析方法)确诊为非DS患者的羊水，14个为采自经典染色体检测方法(细胞核型分析方法)确诊为DS患者的羊水。
每个样本分别进行如下检测：
1、羊水基因组DNA提取
采用深圳益生堂生物企业有限公司生产的基因组DNA快速提取试剂盒进行羊水DNA的提取。
(1)取10ml羊水至15ml离心管，4500rpm离心5分钟(可见细胞沉淀)，弃上清；加入1mlDEPC处理水，8000rpm离心10分钟(可见细胞沉淀)，弃上清；
(2)加入300ul裂解液，剧烈震荡至细胞团块完全溶解，65℃放置10min(期间混匀2次)，12000rpm离心3分钟，弃上清；
(3)加入400ul洗涤液A，用漩涡震荡器充分悬浮沉淀，12000rpm离心3分钟，弃上清；
(4)加入600ul洗涤液B，用漩涡震荡器充分悬浮沉淀，12000rpm离心3分钟，弃上清；
(5)加入600ul无水乙醇，用漩涡震荡器充分悬浮沉淀，12000rpm离心3分钟，弃上清，用加样器尽可能吸去多余的液体，65℃烤箱开盖放置至沉淀变白(约需10分钟)；
(6)加入200ul TE缓冲液，震荡悬浮沉淀，将样品管65℃放置10分钟(期间混匀2次)，12000rpm离心3分钟，上清液即可作为PCR扩增的模板。
2、荧光定量检测
(1)反应液的制备
反应液甲(检测位点反应液)的制备：总体积为15μl，每份反应液中含下列组分：
Figure BDA0000045658730000031
Premix Ex Taq TM II(2×)10.0μl，D21s1259-F(10μM)0.8μl，D21s1259-R(10μM)0.8μl，ROX Reference Dye II(50×)0.4μl，dH2O(灭菌蒸馏水)3.0μl。
反应液乙(参照位点反应液)的制备：总体积为15μl，每份反应液中含下列组分：
Figure BDA0000045658730000032
Premix Ex Taq TMII(2×)10.0μl，D19s222-F(5μM)0.4μl，D19s222-R(5μM)0.4μl，ROX Reference Dye II(50×)0.4μl，dH2O(灭菌蒸馏水)3.8μl。
(2)荧光定量PCR
使用ABI7500荧光定量PCR仪操作，具体操作过程如下：
①加样
在反应液甲和反应液乙中各加入5μl步骤1制备的模板(将等量阴性质控品作为阴性对照，将等量阳性质控品作为阳性对照，将等量水作为空白对照)，分别加入专用荧光PCR反应8联管中，盖上PCR反应盖(注意：盖反应盖时，手用力方向要垂直，以免损坏管盖)8联管离心机离心1分钟，置于仪器反应槽中。
反应条件为：95℃30s(×1)；95℃5s，62℃32s(×40)；95℃15s，60℃60s，95℃15s(×1)；Dissociation Stage；在反应第二阶段和Dissociation Stage阶段收集荧光信号。
②质量控制
水空白：ΔCT为零；
阴性质控品：ΔCt值大于0.6；
阳性质控品：ΔCT在-0.1-0.3之间。
实验中检测样品除空白对照外增长曲线(反应曲线)均呈S型曲线，Ct值＜37；Dissociation Stage反应曲线(溶解曲线)主峰呈单峰，如为双峰或多峰实验无效。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
③结果分析
反应结束后自动保存检测数据文件，自动分析CT值结果。
记录report下面仪器自动分析计算出的相应标本的检测位点和参照位点的CT值，并计算ΔCT(即同一样本检测位点和参照位点CT值差，即检测位点基因的CT值与参照位点基因的CT值之差)。ΔCt值小于等于0.3判断为阳性，ΔCt值在0.3-0.6之间要重复实验或用染色体鉴定实验判断，ΔCt值大于0.6判断为阴性。
利用本技术检测结果如下表(表1)。
表1实验检测结果
  组别   D21s1259CT值   D19s222CT值   ΔCt
  N1   29.6466   27.1424   2.5042
  N2   30.1046   27.7349   2.3697
  N3   28.6469   28.0458   0.6011
  N4   28.9692   28.2811   0.6881
  N5   28.5324   27.7689   0.7635
  N6   27.0088   26.073   0.9358
  N7   27.7645   25.4193   2.3452
  N8   26.9425   26.5545   0.388
  N9   38.4345   37.9343   0.5002
  N10   22.1013   21.2283   0.873
  N11   21.0422   20.303   0.7392
  N12   20.8969   20.34   0.5569
  N13   23.5788   22.6853   0.8935
  N14   21.9564   21.0281   0.9283
  N15   21.0965   20.4288   0.6677
  N16   22.145   21.4864   0.6586
  N17   21.5163   21.161   0.3553
  N18   22.038   21.0131   1.0249
  N19   21.4898   21.041   0.4488
  N20   21.745   21.374   0.371
  N21   20.8058   20.2652   0.5406
  N22   21.9879   21.2555   0.7324
  N23   20.6752   20.0936   0.5816
  N24   21.7672   21.1328   0.6344
  N25   23.9721   23.2394   0.7327
  N26   21.0293   20.4499   0.5794
  N27   22.4157   21.8879   0.5278
  N28   22.2869   21.6796   0.6073
  N29   21.5394   21.1277   0.4117
  N30   21.81   21.447   0.363
  N31   23.7195   22.2696   1.4499
  N32   22.4477   20.2441   2.2036
  N33   22.7595   20.451   2.3085
  N34   20.819   20.0799   0.7391
  N35   22.3546   21.0837   1.2709
  N36   22.2353   21.336   0.8993
  N37   22.1951   20.8128   1.3823
  N38   23.058   21.0373   2.0207
  N39   22.6384   21.4752   1.1632
  N40   21.437   20.3981   1.0389
  N41   22.0951   20.9992   1.0959
  N42   21.6024   20.1552   1.4472
  N43   22.8521   21.4411   1.411
  N44   21.3133   21.009   0.3043
  N45   21.8707   20.5855   1.2852
  N46   21.4436   20.3205   1.1231
  N47   22.2028   21.459   0.7438
  N48   24.4743   21.4566   3.0177
  N49   24.0511   22.635   1.4161
  N50   22.1666   20.9306   1.236
  N51   22.4396   21.8962   0.5434
  N52   22.3599   21.1945   1.1654
  N53   23.1767   22.1197   1.057
  N54   23.2082   21.2002   2.008
  N55   22.5157   21.7633   0.7524
  N56   22.8286   21.4967   1.3319
  N57   22.4908   21.3458   1.145
  N58   22.4956   21.077   1.4186
  N59   23.0028   21.3962   1.6066
  N60   22.9361   21.1609   1.7752
  N61   22.5437   21.888   0.6557
  N62   23.7292   22.1726   1.5566
  N63   23.6716   22.5557   1.1159
  N64   23.0121   21.5257   1.4864
  N65   22.7888   21.6967   1.0921
  N66   22.1964   21.3867   0.8097
  N67   22.9513   22.0305   0.9208
  N68   21.813   20.6379   1.1751
  N69   22.3704   21.2305   1.1399
  N70   22.3615   21.7072   0.6543
  N71   22.7676   21.3461   1.4215
  N72   23.5394   22.7402   0.7992
  N73   23.1721   21.5563   1.6158
  N74   24.1301   22.8681   1.262
  N75   25.3723   23.2621   2.1102
  N76   26.1764   23.6597   2.5167
  N77   27.2821   25.3007   1.9814
  N78   23.4042   22.0805   1.3237
  N79   24.4766   22.6194   1.8572
  N80   23.2561   21.7059   1.5502
  N81   23.197   21.7768   1.4202
  N82   23.8357   22.5093   1.3264
  N83   23.6192   22.2882   1.331
  N84   23.316   22.0923   1.2237
  N85   24.3168   22.3816   1.9352
  N86   24.7814   22.4968   2.2846
  N87   24.5552   22.168   2.3872
  N88   24.5519   22.0087   2.5432
  N89   23.0311   22.0576   0.9735
  N90   24.7893   22.8199   1.9694
  N91   23.2348   21.4699   1.7649
  N92   23.3148   21.906   1.4088
  N93   23.2799   22.2279   1.052
  N94   24.4156   22.7498   1.6658
  N95   23.4979   22.1489   1.349
  N96   24.696   22.8203   1.8757
  N97   22.3994   21.2177   1.1817
  N98   23.0597   22.0177   1.042
  N99   22.7188   21.0297   1.6891
  N100   23.8236   22.3739   1.4497
  N101   24.3979   22.967   1.4309
  N102   27.1127   21.7713   5.3414
  N103   24.3047   22.2104   2.0943
  N104   21.8031   21.3993   0.4038
  N105   22.2523   19.4841   2.7682
  N106   23.9109   21.6132   2.2977
  N107   21.4439   20.0489   1.395
  N108   24.3835   23.2421   1.1414
  N109   23.2247   22.0979   1.1268
  N110   23.1199   20.6635   2.4564
  N111   23.3166   21.6314   1.6852
  N112   24.0963   22.1851   1.9112
  N113   27.1585   21.2628   5.8957
  N114   23.5091   23.0084   0.5007
  N115   24.7441   22.434   2.3101
  N116   23.4119   21.0561   2.3558
  N117   24.0028   22.1686   1.8342
  N118   24.4757   22.8058   1.6699
  N119   26.0994   24.7122   1.3872
  N120   26.1205   24.0224   2.0981
  N121   25.3897   23.2761   2.1136
  N122   25.265   22.6608   2.6042
  N123   26.7319   24.6663   2.0656
  N124   25.2093   23.9375   1.2718
  N125   27.5955   25.3194   2.2761
  N126   28.4543   26.5181   1.9362
  N127   26.4288   24.7497   1.6791
  N128   24.5956   23.1456   1.45
  N129   24.7202   23.5688   1.1514
  N130   25.4888   24.0935   1.3953
  D1   28.4086   28.9833   -0.5747
  D2   29.6466   29.2073   0.4393
  D3   28.8636   28.5655   0.2981
  D4   31.2484   31.1467   0.1017
  D5   29.9729   30.2477   -0.2748
  D6   26.8465   28.1737   -1.3272
  D7   29.3373   29.6767   -0.3394
  D8   28.9945   29.0956   -0.1011
  D9   28.6891   28.7164   -0.0273
  D10   29.6314   29.5196   0.1118
  D11   22.6019   23.1766   -0.5747
  D12   23.5842   23.6853   -0.1011
  D13   22.3327   22.6075   -0.2748
  D14   22.705   23.0444   -0.3394
注：D字母开头的编号为病人，N字母开头的编号为正常人。
SYBR荧光筛查方法检测结果：正常人组130例(其中114ΔCt均大于0.6一次判断为阴性，16例大于0.3小于0.6重复实验后ΔCt均大于0.6判断为阴性)完全与经典染色体检测方法结果一致；病人组14例(13例ΔCt均小于0.3)中13例与典染色体检测方法结果一致，其中1例大于0.3小于0.6重复实验后仍然大于0.3小于0.6判断为可疑)。样本D12的D19s222参照位点的反应曲线见图1，D19s222参照位点的溶解曲线见图2，D21s1259检测位点的反应曲线见图3，D21s1259检测位点的溶解曲线见图4。
Figure IDA0000045658800000011

Claims (4)

1.辅助鉴定唐氏综合征患者的专用引物，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
2.权利要求1所述专用引物在制备辅助鉴定唐氏综合征患者的试剂盒中的应用。
3.一种辅助鉴定唐氏综合征患者的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SYBR荧光染料。
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