CN112176093A

CN112176093A - Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物及其分子检测方法

Info

Publication number: CN112176093A
Application number: CN202011165598.1A
Authority: CN
Inventors: 罗爱民; 邓锐杰; 朱小颖; 吴茗花
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-01-05

Abstract

本发明公开了两条Wxc型糯高粱的ARMS‑PCR引物及其分子检测方法，本发明属于糯高粱甄选检测技术领域。Wxc型糯高粱的ARMS‑PCR分子检测方法，包括如下步骤：(1)ARMS‑PCR引物对Wxc‑F、Wxc‑R的设计；(2)样品总DNA的提取，利用S1的引物进行ARMS‑PCR扩增反应；(3)采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，根据凝胶成像系统上成像判定检测结果，若有条带生成，则表明该样品中含Wxc型糯高粱；若无条带生成，则表明该样品中不含Wxc型糯高粱。本发明不需要限制性内切酶进行切割，且适用于大量样品分析。

Description

Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物及其分子检测方法

技术领域

本发明属于糯高粱甄选检测技术领域，具体涉及Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物及其分子检测方法。

背景技术

高粱为世界重要粮食作物之一，与许多禾谷类作物一样，其种子的胚乳具有糯性和粳性之分，这是由胚乳中直链淀粉和支链淀粉含量及比例决定的。颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)是淀粉合成途径中的关键酶，它直接参与直链淀粉的生物合成。高粱糯性性状分为4种类型Wxa、Wxb、Wxc和Wxd。Wxc是由GBSS基因第九内含子上有1个G缺失，导致阅读框的转变和早期翻译终止。该缺失位于原核生物和真核生物高度保守的区域。

糯高粱是酿造白酒的主要原料，国酒茅台、五粮液、郎酒等名酒的酿酒工艺对高粱有着特殊要求。选育具有高乙醇转化率、高产量、高品质等优良籽粒性状的糯性高粱越来越受到白酒行业的重视。据有关文献报道，我国西南地区白酒酿造用糯高粱主要为Wxa型和Wxc型糯高粱。

过去糯高粱的鉴别方法主要为碘染色法、双波长比色法等，仪器简单、操作方便，但存在无法通量检测、效率低的问题，随着生物检测技术的发展，生物检测技术也应用在了糯高粱甄选上。目前，针对高粱糯性性状鉴别普遍采用普通PCR法和全基因组测序法。①普通PCR法：是一种在体外对特定的DNA片段进行扩增的技术，可以将少量的DNA片段进行放大扩增。PCR技术的操作简便，只需将反应液和引物加入PCR仪中，大部分过程都能由仪器自动完成，扩增过程也较为迅速，一般只需要3个小时左右即可完成扩增。不过，PCR反应产物需要用限制性内切酶对产物进行酶切，进行观察实验结果。其反应耗材较多，操作复杂。②全基因组测序法：全基因组测序包含糯高粱个体的核DNA的全部遗传信息，与参考粳高粱基因组比对可以获得非常全面的遗传标记信息，如SNP等分子标记。但其成本高、时间周期长，不适用于大量样品分析，因此很难在大多数检测部门推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物及其分子检测方法，以解决现有酿酒高粱检测技术存在成本高、时间周期长，不适用于大量样品分析，因此很难在大多数检测部门推广使用的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物，包括Wxc-F、Wxc-R，其核酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

Wxc型糯高粱的ARMS-PCR分子检测方法，包括如下步骤：

(1)ARMS-PCR引物对Wxc-F、Wxc-R的设计；

(2)样品总DNA的提取，利用S1的引物进行ARMS-PCR扩增反应；

(3)采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，根据凝胶成像系统上成像判定检测结果，若有条带生成，则表明该样品中含Wxc型糯高粱；若无条带生成，则表明该样品中不含Wxc型糯高粱。

本发明中ARMS-PCR，又称扩增受阻突变PCR(amplification refractorymutation system PCR)，其特点是引物3’末端最后一个碱基和待鉴别物种完全匹配，而不和其他物种匹配。用这样的引物进行PCR扩增，待鉴别物种的片段被扩增出来而非目的物种的DNA不能扩增，从而达到鉴别的目的。为了增强鉴别的准确性和重复性，可在特异性引物的3’末端引入错配的碱基。对于野生型模板，有2个错配碱基，扩增效率明显下降；而对于Wxc型突变的模板，只有1个错配，且不在3’末端，仍能特异性扩增。ARMS-PCR利用将等位基因的突变碱基设计在引物3’的最后一个碱基上，用这样的引物进行PCR扩增，如得到特异性扩增条带，则表明被测样品含有这种突变，反之不含突变。ARMS-PCR扩增产物不需要限制性内切酶进行切割，且适用于大量样品分析。

作为优选地，步骤(2)中，所述扩增反应的体系：10μL 2×PCR Master，1μL DNA模板，1μL Wxc-F，1μL Wxc-R，Sterile ddH₂O补齐到20μL。

作为优选地，步骤(2)中，所述扩增反应的条件为：94℃预变性3min，之后进行32个循环的94℃30s、50℃30s、72℃30s，最后进行72℃终止延伸7min。

作为优选地，步骤(3)中，所述琼脂糖凝胶电泳判别的方法是：取5μL的ARMS-PCR扩增产物，加入1μL 6×Loading buffer，混匀，加入到3％的琼脂糖凝胶中，于150V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、成本低廉：所需试剂都是常用PCR试剂(如Taq酶)，不需要额外的限制性内切酶；

2、灵敏度高：该检测方法灵敏度高，最低检测限达到了0.1ng/μL；

3、操作简单：运用实验室常用的PCR仪等即可完成，不需要复杂的仪器操作步骤；且只需要设计两条引物，不需要设计四条引物；

4、准确性高：ARMS-PCR方法检测结果和测序结果比对结果一致性高达100％；

5、特异性强：前引物3’末端最后一个碱基与DNA模板突变位点一致保证了ARMS-PCR方法扩增的高度特异性；

6、快速省时：用时短，通常在90min内完成反应，通过观察条带数量情况即可判断样品是否为Wxc型糯高粱，而不需要对扩增产物进行测序。

附图说明

图1：Wxc型高粱、野生型高粱的ARMS-PCR琼脂糖凝胶电泳结果。图中：泳道M：DNAMarker0.5K；1为Wxc型高粱；2为野生型高粱；3为水；

图2：ARMS-PCR方法的敏感性实验结果。图中：泳道M：DNA Marker；1-4模板分别为初浓度为40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、2ng/μL的DNA。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

对Wxc型糯高粱的检测

1、高粱样品总DNA的提取

采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒对高粱种子进行DNA的提取。具体步骤如下：⑴将100-200mg的新鲜植物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至2ml的离心管中；⑵向离心管中加入1mL GMO Buffer和20μL proteinase K，充分振荡混匀，65℃水浴30min，间或振荡混匀。⑶12000rpm离心10min，吸取全部上清。⑷向上清中加入400μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中。⑸向上清中加入2倍体积的GMP Buffer，充分混匀，12000rpm离心5min，弃上清。⑹向沉淀中加入350μL DRL Buffer，充分悬浮沉淀物。⑺向上述溶液中加入300μL无水乙醇，充分混匀，将其全部转移至吸附柱中，室温放置2min，10000rpm离心2min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。⑻向吸附柱中加入500μLWash Solution，10000rpm离心1min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。⑼重复步骤8一次。⑽将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。⑾取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL TE buffer，静置3min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续实验。

2、基因的选择

根据已知文献公布的Wxc型GBSS基因以及Gene Bank公布的野生型GBSS

基因，再用Snapgene软件进行序列比对，结果发现基因序列除了Wxc突变型的一个碱基G缺失外表现出高度的保守性。因此选择碱基缺失附近的基因序列作为引物设计的候选模板。

3、引物设计

根据相关引物设计原则，利用Primer 5.0软件设计了特异性前引物和共用后引物，其中特异性前引物保证其特异位点设计在引物3’末端最后一个碱基上。由上海生工生物技术公司合成如下引物。

前引物Wxc-F如SEQ ID NO：1所示；

后引物Wxc-R如SEQ ID NO：2所示。

4、ARMS-PCR扩增

ARMS-PCR反应体系：①10μL 2×PCR Master，1μL DNA模板，1μL Wxc-F，1μL Wxc-R，Sterile ddH2O补齐到20μL。混合并充分振荡混匀；②将上述20μL总反应液分别放置到PCR仪里，按照94℃预变性3min，之后进行32个循环的94℃30s，50℃30s，72℃30s，最后进行72℃终止延伸7min。③琼脂糖凝胶电泳：取5μL最终反应产物，加入1μL 6×LoadingBuffer，混合摇匀，加入到3％的琼脂糖凝胶中，于150V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。

5、ARMS-PCR反应扩增产物分析

成像结果判定:若出现条带，则表明该样品中含有Wxc型糯高粱；若未出现条带，则表明该样品中不含Wxc型糯高粱。

实施例2

Wxc型糯高粱检测方法特异性试验

1、按照实施例1的方法分别提取Wxc型糯高粱、野生型高粱样品中总DNA模板。

2、采用实施例1中的引物对和方法进行ARMS-PCR扩增和检测。

结果如图1，可以看出，对Wxc型糯高粱、野生型高粱目的条带清晰，并无杂带或拖尾，说明本方法具有较好的特异性。

3、Wxc型糯高粱和野生型高粱GBSS基因gDNA的测序鉴定：

将扩增的88bp条带处的PCR产物20μL送测。将测序结果导入NCBI数据库进行序列比对，从而鉴定出gDNA为Wxc型和野生型两种类型，这两种类型的DNA序列差异分别如SEQID NO：3、如SEQ ID NO：4所示。

表1两种高粱的序列差异

高粱类型	基因序列
		Wxc型	GTGTCAACGGTGAGCTTTGC
野生型	GTGTCAACGTGAGCTTTGC

实施例3

ARMS-PCR方法检测Wxc型糯高粱敏感性试验

将10μL 2×PCR Master，1μL Wxc-F，1μL Wxc-R，1μL DNA模板(提取出的DNA模板梯度稀释)，7.0μL Sterile ddH2O，混合并轻微震荡摇匀；②将上述20μL总反应液分别放置到PCR仪里，按照94℃预变性3min，之后进行32个循环的94℃30s，50℃30s，72℃30s，最后进行72℃终止延伸7min。③琼脂糖凝胶电泳：取5μL最终反应产物，加入1μL 6×LoadingBuffer，混合摇匀，加入到3％的琼脂糖凝胶中，于150V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。

ARMS-PCR方法在DNA模板终浓度为0.1ng/μL仍可检测到微弱条带，其结果如图2。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物，包括Wxc-F、Wxc-R，其核酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

2.Wxc型糯高粱的ARMS-PCR分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)ARMS-PCR引物对Wxc-F、Wxc-R的设计；

(2)样品总DNA的提取，利用S1的引物进行ARMS-PCR扩增反应；

3.根据权利要求2所述的Wxc型糯高粱的ARMS-PCR分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增反应的体系：10μL 2×PCR Master，1μL DNA模板，1μL Wxc-F，1μL Wxc-R，SterileddH₂O补齐到20μL。

4.根据权利要求2或3所述的Wxc型糯高粱的ARMS-PCR分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增反应的条件为：94℃预变性3min，之后进行32个循环的94℃30s、50℃30s、72℃30s，最后进行72℃终止延伸7min。

5.根据权利要求2所述的Wxc型糯高粱的ARMS-PCR分子检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述琼脂糖凝胶电泳判别的方法是：取5μL的ARMS-PCR扩增产物，加入1μL 6×Loadingbuffer，混匀，加入到3％的琼脂糖凝胶中，于150V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。