CN104372101A - 一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物及方法 - Google Patents

一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，包括外引物G3935-TWF2和G3935-TWR2；内引物G3935-TNF2和G3935-TNR2；本发明还公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，包括以下步骤：采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA；利用提取的DNA为模板进行特异性PCR扩增；将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。本发明使用四个引物结合一次PCR和电泳，便能在大麦群体中快速且经济地筛选出携带G3935突变为T位点的糯大麦材料，并能作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。

Description

一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物及方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，本发明还涉及一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法。
背景技术
大麦(Hordeum vulgare L.)是全球第四大谷类作物。淀粉是大麦籽粒中的主要成分，通常由直链淀粉(20～30％)和支链淀粉(70～80％)组成。直链淀粉与支链淀粉的比例及其特性是影响大麦等谷类作物籽粒终端利用价值的重要因素。Waxy基因编码颗粒结合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase I，GBSSI)，主要负责直链淀粉的合成。大麦的Waxy基因包含12个外显子和11个内含子，其编码的GBSSI蛋白含有463个氨基酸。Waxy基因的突变通常会影响直链淀粉合成。无直链淀粉或低直链淀粉的大麦通常被称为糯大麦，经碘染实验后籽粒截面呈红色，而普通大麦为黑色。目前已发现大麦Waxy基因5’非编码区(5’UTR)中一段403bp的缺失导致mRNA、GBSSI蛋白表达水平和直链淀粉含量急剧降低。此外，大麦Waxy基因外显子上的三个SNP突变直接抑制籽粒中直链淀粉合成。其中位于外显子10中核苷酸序列第3935位的G3935(核苷酸序列参照X07931，Genebank)突变为T，导致GBSSI蛋白多肽链的第513位的甘氨酸(Gly)突变为色氨酸(Trp)。513th Gly位于GBSSI的糖基转移酶结构域(glycosyltranferase domain，GT-1)中，在许多生物的糖原合酶类蛋白中非常保守，所以该位点的突变可能使GBSSI失活从而不能合成直链淀粉。开发一种分子标记对该SNP位点进行筛选可提高分子标记辅助育种的效率及在优良糯大麦培育过程中的发挥重要作用。目前对于SNP的检测技术主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、寡核苷酸连接分析(OLA)等方法。裂解扩增多态性序列分析(cleaved amplifiedpolymorphic sequence analysis，CAPS)因为操作简便目前广泛用于植物和微生物的SNP检测、基因标记和连锁构图。针对大麦Waxy基因G3935突变为T而使原有的SexAI酶切位点消失，目前已报道了一对CAPS标记对该SNP位点进行筛选，但CAPS标记需进行PCR扩增、酶切、电泳分离酶切片段，检测费时且价格昂贵。PCR-CTPP(Tetra-primeramplification refractory mutation system PCR，Tetra-primer ARMS PCR)又称四引物扩增受阻突变体系PCR。
发明内容
本发明的目的是提供一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物。
本发明的另一目的是提供一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，该方法基于PCR-CTPP的四个引物的核苷酸序列，以及该引物在检测携带G3935突变为T位点的糯大麦(TT型)、携带G3935的普通大麦(GG型)及同时含有G3935和突变T位点的普通大麦杂合型(GT型)的用法。
本发明所采用的第一技术方案是，一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，所述引物序列如下：
外引物G3935-TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’；外引物G3935-TWR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3’；内引物G3935-TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’；内引物G3935-TNR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基。
本发明所采用的第二技术方案是，一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，利用上述的标记引物，具体按照以下步骤实施：
步骤1、采用CTAB法提取大麦品种基因组DNA；
步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。
本发明的特点还在于，
步骤1中采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、取100mg大麦的幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液700ul，混匀；65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次；
步骤1.2、冷却至室温后加入1mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min；
步骤1.3、取上清液，重复步骤1.2，取上清液加入700ul预冷至-20℃的异丙醇，轻摇混匀后于-20℃中静置2小时；
步骤1.4、13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次。晾干后加入100ul ddH2O溶解。
步骤2中特异性PCR反应体系如下：
步骤2中的PCR反应程序为：
PCR反应在GenePCR System 9700型PCR仪中进行。
步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测，
如果扩增产物为861bp和552bp两种片段，显示标记个体基因型为TT型，为糯青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为872bp和350bp两种片段，显示标记个体基因型为GG型，为普通青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为861/872bp、552bp和350bp三条带；显示标记个体基因型为GT型，为普通青稞杂合型，电泳条带为三条带。
CTAB提取液为2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0。
本发明的有益效果是：采用本发明的四个引物，结合一次PCR和电泳，便可以在大麦群体中快速且经济地筛选出携带G3935突变为T位点的糯大麦材料，并且可以作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。
本发明是在突变位点附近设计两个外引物和两个内引物，内引物的3’终末端为突变位点，同时在内引物3’末端引入错配碱基，当引物错配时，延伸效率降低，最后根据扩增片段的数量和大小检测突变是否发生。此方法省去了酶切PCR产物的环节，操作简便、省时且价格低廉。
附图说明
图1是是本发明引物G3935-TWF2、G3935-TWR2、G3935-TNF2和G3935-TNR2在Z999(糯青稞，TT型)(普通青稞，GG型)的F2群体的部分植株中的扩增结果，其中，M1，Marker(Marker 1)；1，TT型；2，GT型；3，GG型；4，GG型；5，GG型；6，GT型；7，GT型；8，GG型；9，TT型；10，TT型；11，GG型；12，GT型；M2，Marker(Trans 2kplus II)
图2是本发明引物G3935-TWF2、G3935-TWR2、G3935-TNF2和G3935-TNR2在突变型(TT型)、野生型(GG型)和杂合型(GT型)中的扩增结果，其中，M1，Marker(Marker 1)；1，GG型；2，GT型；3，GG型；4，TT型；5，TT型；6，TT型；7，TT型；8，GT型；9，TT型；10，TT型；11，GG型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。
实施例1  大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物
本发明提供一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，也是检测携带G3935突变为T位点的糯大麦的特异分子标记引物，两个外引物为G3935-TWF2(如SEQ ID No.1所示)和G3935-TWR2(如SEQ IDNo.2所示)，两个内引物为G3935-TNF2(如SEQ ID No.3所示)和G3935-TNR2(如SEQ ID No.4所示)，G3935-TNF2搭配G3935-TWR2只能对突变型(TT型)特异扩增，Z999WF2搭配G3935-TNR2只能对野生型(GG型)特异扩增。其核苷酸序列分别为：
G3935-TWF2：5’-CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’
G3935-TWR2：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3，
G3935-TNF2(突变型)：5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’
G3935-TNR2(野生型)：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’；
(引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基)：
用这四个引物对大麦Waxy基因进行扩增，糯大麦(TT型)、普通大麦(GG型)和杂合型(GT型)，都能利用G3935-TWF2和G3935-TWR2扩增出大小约为872bp(GG型、GT型)或861bp(TT型、GT型)的条带。此外，糯大麦(TT型)还能利用G3935-TNF2和G3935-TWR2扩增出一条552bp的条带；普通大麦(GG型)能利用G3935-TWF2和G3935-TNR2扩增出一条350bp的条带；普通大麦杂合型(GT型)既能扩增出552bp的条带又能扩增出350bp的条带。因为Waxy基因在所扩增的区域内还存在其它多态性，所以不同大麦在G3935-TWF2、G3935-TWR2、G3935-TNF2和G3935-TNR2四条引物的扩增片段的大小和碱基排列会有微小的变化。
实施例2  大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法的建立
1、采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA，提取步骤如下：
1)取100mg幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)700ul，混匀。65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次。
2)冷却至室温后加入1mL的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min。
3)取上清液，重复步骤2)，取上清液加入700ul预冷至-20℃的异丙醇，轻摇混匀后于-20℃中静置2小时。
4)13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次。晾干后加入100ul ddH2O溶解。
5)1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA浓度及质量。
2、PCR扩增：
PCR反应体系如下：
G3935-TWF2：5’-CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’
G3935-TWR2：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3’
G3935-TNF2(突变型)：5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’
G3935-TNR2(野生型)：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’；
上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基；
PCR反应在GenePCR System 9700型PCR仪中进行。扩增产物于1％左右的琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测，对基因型进行判定：
如果扩增产物为861bp(如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列参照X07931(Genbank)第3609位碱基至第4469位碱基之间的序列，不同材料之间碱基数目和顺序有微小差异)和552bp(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，核苷酸序列参照X07931(Genbank)第3918位碱基至第4469位碱基之间的序列，不同材料之间碱基数目和顺序有微小差异)两种片段，显示标记个体基因型为TT型，为糯青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为872bp(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，核苷酸序列参照X07931(Genbank)第3609位碱基至第4469位碱基之间的序列，不同材料之间碱基数目和顺序有微小差异)和350bp(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，核苷酸序列参照X07931(Genbank)第3609位碱基至第3958位碱基之间的序列，不同材料之间碱基数目和顺序有微小差异)两种片段，显示标记个体基因型为GG型，为普通青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为861/872bp、552bp和350bp三条带；显示标记个体基因型为GT型，为杂合型，电泳条带为三条带。
实施例3  大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法的应用例
以Z999(糯青稞，TT型)为母本，以贡品青稞(普通青稞，GG型)为父本进行杂交，从F2群体中随机选取139株作为检测材料。
1、采用CTAB法提取青稞基因组DNA，提取步骤如下：
1)取100mg幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1MEDTA，pH 8.0)700ul，混匀。65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次。
2)冷却至室温后加入1mL的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min。
3)取上清液，重复步骤2)，取上清液加入700ul预冷至-20℃的异丙醇，轻摇混匀后于-20℃中静置2小时。
4)13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次。晾干后加入100ul ddH2O溶解。
5)1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA浓度及质量。
2、PCR扩增：
反应体系如下：
PCR反应在GenePCR System 9700型PCR仪中进行。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测。
3、测序验证
随机选取TT型、GG型和GT型的各5例送往英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
4、籽粒染色验证
将F2群体中待测的139份青稞材料对应的籽粒分别收集起来，每份青稞材料随机选取20颗籽粒用碘试剂(2％KI，0.0002％I2)染色。
PCR扩增部分结果如图1和图2所示，糯青稞(TT型)能扩增出大小为861bp和552bp的两条带，普通青稞(GG型)能扩增出872bp和350bp的两条带，普通青稞杂合型(GT型)能扩增出861/872bp、552bp和350bp三条带。TT型、GG型和GT型的测序结果与PCR-CTPP带型结果完全一致。TT型的青稞籽粒染色均为红色(糯性)，GG型和GT型的青稞籽粒染色均为黑色(非糯性)，染色结果也再一次验证了G3935-TWF2、G3935-TWR2、G3935-TNF2和G3935-TNR2在鉴定糯青稞(TT型)、普通青稞(GG型)和普通青稞杂合型(GT型)的可靠性。
序 列 表
序列表
 
<110>  中国科学院成都生物所
<120>  一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物及方法
<130>  2014
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
cgggaagaag aagtttgaga                                         20
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
cactacaaca agcggctatc t                                          21
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
tcgtggaggg caagatct                                              18
 
<210>  4
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
gctgaggcgg cccatgtgga atcc                                   24
 
<210>  5
<211>  872
<212>  DNA
<213>  大麦
<400>  5
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<213>  大麦
<400>  6
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tggaacggta aacgcctcac ccttcttgcc agcaactcac ctcatttgca tatccatggc      240
catgaccgaa gtttcttcca aattttaagc cgtgcgtgtg cgcgtccacc ggcgggctcg      300
tcgacacgat cgtggagggc aagacctggt tccacatggg ccgcctcagc gtcgacgtat      360
gctcatcgat cctcttgtgt aaattcattc atcttgttca tcctggctgc tcgatcagac      420
catgaaacgg tttcctttct tcttggtggc cagtgcaacg tggtggagcc ggcggacgtg      480
aagaaggtgg cgaccaccct gaagcgggcc gtcaaggtcg tcggcacgcc ggcgtaccag      540
gagatggtca agaactgcat gatccaggat ctctcctgga aggtacataa ttattttggg      600
tttcacgcag caatttaaag actgcatggc tcaatggtgg tctgggcgta tgctgcaggg      660
acctgccaag aactgggagg acgtgcttct ggaactgggg gtggagggga gcgagccggg      720
gatcgtcggc gaggagatcg cgccgctcgc catggagaac gtcgccgctc cctgaagaga      780
gagaaaaagg aacattctgg tgcatggagc atcttccatc ttcagggttc tcgtatgggg      840
agatagccgc ttgttgtagt g                                         861
 
<210>  7
<211>  552
<212>  DNA
<213>  大麦
<400>  7
tcgtggaggg caagatctgg ttccacatgg gccgcctcag cgtcgacgta tgctcatcga       60
tcctcttgtg taaattcatt catcttgttc atcctggctg ctcgatcaga ccatgaaacg      120
gtttcctttc ttcttggtgg ccagtgcaac gtggtggagc cggcggacgt gaagaaggtg      180
gcgaccaccc tgaagcgggc cgtcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacca ggagatggtc      240
aagaactgca tgatccagga tctctcctgg aaggtacata attattttgg gtttcacgca      300
gcaatttaaa gactgcatgg ctcaatggtg gtctgggcgt atgctgcagg gacctgccaa      360
gaactgggag gacgtgcttc tggaactggg ggtggagggg agcgagccgg ggatcgtcgg      420
cgaggagatc gcgccgctcg ccatggagaa cgtcgccgct ccctgaagag agagaaaaag      480
gaacattctg gtgcatggag catcttccat cttcagggtt ctcgtatggg gagatagccg      540
cttgttgtag tg                                                 552
 
<210>  8
<211>  350
<212>  DNA
<213>  大麦
<400>  8
cgggaagaag aagtttgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagttcc cgggcaaggt       60
gagggccgtg gtcaggttca acgcgccgct agctcaccag atgatggccg gcgccgactt      120
gctcgctgtc accagccgct tcgagccctg cggcctcatc cagctccagg gaatgcgcta      180
tggaacggta aacgcctcac ccttcttgcg agctcctcac ctcatttgca tatccatgtc      240
catgaccgaa gtttcttcca aattttaagc cgtgcgtgtg cgcgtccacc ggcgggctcg      300
tcgacacgat cgtggagggc aagaccggat tccacatggg ccgcctcagc             350

Claims (7)

1.一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：
外引物G3935-TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’；外引物G3935-TWR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3’；内引物G3935-TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’；内引物G3935-TNR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基。
2.一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，利用权利要求1所述的标记引物，具体按照以下步骤实施：
步骤1、采用CTAB法提取大麦品种基因组DNA；
步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。
3.根据权利要求2所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，所述步骤1中采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、取100mg大麦的幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液700ul，混匀；65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次；
步骤1.2、冷却至室温后加入1mL体积比为24：1的氯仿：异戊醇，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min；
步骤1.3、取上清液，重复步骤1.2，取上清液加入700ul预冷至-20℃的异丙醇，轻摇混匀后于-20℃中静置2小时；
步骤1.4、13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次，晾干后加入100ul ddH2O溶解。
4.根据权利要求2所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，所述步骤2中特异性PCR反应体系如下：
5.根据权利要求4所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR反应程序为：
PCR反应在PCR System 9700型PCR仪中进行。
6.根据权利要求5所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，所述步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测，
如果扩增产物为861bp和552bp两种片段，显示标记个体基因型为TT型，为糯青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为872bp和350bp两种片段，显示标记个体基因型为GG型，为普通青稞，电泳条带为两条带；
如果扩增产物为861/872bp、552bp和350bp三条带；显示标记个体基因型为GT型，为普通青稞杂合型，电泳条带为三条带。
7.根据权利要求3所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在于，所述CTAB提取液为2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0。
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