CN103114129A - 一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种大麦种资资源的分子标记方法，属于植物分子育种领域。大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提，并用化学显色的方法进行LOX-1活性鉴定，最终筛选出LOX-1活性缺失的自然变异材料。根据已经报道的LOX-1基因序列，设计基因特异性引物，对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增利克隆测序，最终确定导致LOX-1活性缺失的突变位点；同时，从发芽后的大麦组织中提取mRNA，反转录为cDNA，对上述功能突变材料的LOX-1基因进行测序，并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析，进一步开发出改功能位点的多态性分子标记，实验验证该分子标记用于辅助育种的可靠性和有效性。

Description

一种大麦脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法

技术领域

本发明涉及一种大麦脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷的基因变异及其应用。

背景技术

以脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)为核心的脂质降解途径是影响以大麦为主要原料的诸如啤酒等饮料的风味的一项重要因素，同时，也是导致谷物储藏期间品质变劣、产生陈味的根源。在啤酒工业中，反式-2-壬烯醛(T2N)是由脂质降解产生的一种典型的风味老化物质，被认为是啤酒老化的指示剂，严重影响啤酒长期储存的商品性(刘明丽等2011，酿酒科技5：98-102)。在脂质降解途径中，脂肪氧化酶分别将亚油酸转化为9-氢过氧化十八碳二烯酸(9-HPOD)和13-氢过氧化十八碳二烯酸(13-HPOD)的双加氧作用。在酿酒工业中，9-HPOD为主要的脂肪氧化酶通路代谢产物，通过进一步酶促或自发反应导致反式-2-壬烯醛(T2N)的产生(Kuroda等2003，Biosci Biotechnol Biochem 67：691-697)。在谷物储藏过程中，脂肪氧化酶促进氧元素与多链不饱和脂肪酸结合，形成双链的氢过氧化物，进一步转变成一些挥发性的醛、酮类气体化合物，从而导致谷物变质和变味；缺失脂肪氧化酶的稻米与未缺失的品种相比耐储藏性更好，同时品质、发芽率更高，虫害率更低(Zhang等2007，Journal of Stored Products Research 43：87-91)。目前，大麦中已知有3个脂肪氧化酶基因(Lox-1或LoxA，Lox-2或LoxC以及Lox-3或LoxB)(Van Mechelen等1999，Plant Mol Biol.39(6)：1283-1298)，其中Lox-1是影响大麦麦芽脂肪氧化酶活性的主要基因(Kuroda等2005，EBC Congress，750-756)。已有报道称，经通过人工诱变获得的LOX-1基因失活的变异(US20030167544A1)，此外还有筛选种质资源发掘到的自然变异(Hirota等2005，Theor Appl Genet，111：1580-1584)，并随即用于高品质啤酒大麦新品种的选育。研究表明，这些LOX-1基因失活的大麦原料均可显著降低啤酒中T2N的含量，经过长时间储存也不会显著增加，从而保证啤酒风味不发生改变(US20090285932A1)。目前丹麦嘉士伯啤酒公司以及日本札幌啤酒有限公司已分别经过人工化学诱变以及筛选自然的LOX-1基因合成缺陷型突变体，并对相关基因变异申请了专利保护。

发明内容

针对上述现有技术的缺点，本发明从中国大麦品种中发掘出的LOX-1合成缺陷型自然变异，位于第二内含子中，与其他已有报道的变异位点均不属于同一位点，为新的基因变异类型，且已同步开发出特异的功能性分子标记用于辅助快速育种。

为实现本发明的目的，从大麦种质资源中筛选获得脂肪氧化酶活性缺失的自然变异材料，进一步获得LOX-1基因突变位点，并开发相应的单核苷酸多态性分子标记(SNP Marker)。具体地说，对1000份原产于我国的大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提，并用化学显色的方法进行LOX-1活性鉴定，最终筛选出LOX-1活性缺失的自然变异材料。根据已经报道的LOX-1基因序列，设计基因特异性引物，对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增和克隆测序，最终确定导致LOX-1活性缺失的突变位点；同时，从发芽后的大麦组织中提取mRNA，反转录为cDNA，对上述功能突变材料的LOX-1基因进行测序，并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析。进一步开发出改功能位点的多态性分子标记，实验验证该分子标记用于辅助育种的可靠性和有效性。

大麦粗提蛋白的脂肪氧化酶活性分析结果显示，第二内含子中642bp处的单个碱基突变(G型)的大麦种质资源LOX-1活性缺失，而对照的正常的野生型(C型)则表现为活性正常，说明这是进行LOX-1活性缺失大麦新品种选育的新的基因资源。

此外，本发明通过开发该SNP位点的特异性分析标记，可用于分子标记辅助育种。采用LOX-1活性缺失的啤酒大麦原料，能够使酿酒者生产出即使经长期储藏，T2N特异性的陈腐异味水平也不明显增加的啤酒；并能够辅助培育耐储藏的高品质食用大麦(青稞)和饲用大麦新品种。

附图说明

图1为LOX-1活性缺失材料的筛选示意图

图2为大麦脂肪氧化酶基因LOX-1的基因结构及其功能变异位点

样品1～4为大麦LOX-1活性缺失型大麦品种(G型)；5-8为活性正常大麦品种(C型)

图3为Lox1基因组第二内含子单碱基变异导致内含子剪切位点改变示意图

图4为Lox1基因第二内含子剪切位点改变导致所编码蛋白变异的示意图

样品1-3(G型)的Lox-1基因由于发生移码突变和提前终止，导致编码LOX-1蛋白失活；样品4(G型)的Lox-1基因由于发生提前终止，导致编码LOX-1蛋白失活；样品5-8(C型)的Lox-1基因可编码有活性的LOX-1蛋白；

图5为Lox-1基因SNP特异性分子标记检测不同大麦样品的电泳图谱

M：分子量标准(2000bp Ladder)；样品1～4为大麦Lox1基因的突变型大麦品种(G型)，其PCR产物(Lox1.FL.2F/RNR)为720bp；样品5-8为没有突变的野生型大麦品种(C型)，其PCR产物(RNF/Lox1.FL.1R)为320bp；样品9-12为杂交种(F1型)，其PCR产物两条电泳谱带均有。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

1.大麦LOX-1突变材料的快速定性筛选

称取0.1g的大麦粉溶于1ml的蒸馏水中，用涡旋震荡器混合均匀后，3000rpm离心2min，取50ul上清至另一2ml的离心管中；向2ml的离心管中一次加0.5ml的A溶液(10ml 20mmDMAB/100mm磷酸缓冲液，0.4ml 25mm亚油酸底物和9.6ml双蒸水，现用现配，避光保存)，反应20分钟，再加入0.5ml的B溶液(0.4ml 10mm MBTH，0.4ml 5mg/ml血红蛋白，19.2ml双蒸水，现用现配，避光保存)反应10分钟，最后用0.5ml 1％的SDS终止反应。如果离心管中呈深蓝色，表明LOX-1活性正常，如果呈现浅蓝或者无色，表明LOX-1活性低或者无活性。最终筛选到4份LOX-1活性缺失的大麦种质。

2.大麦LOX-1突变材料和野生型材料的DNA提取和基因组序列的获取

取0.1g发芽后的新鲜大麦叶片，液氮速冻研磨后采用标准CTAB法进行大麦DNA提取，经RNA酶纯化后定量稀释为50ng/ul的工作液；根据NCBI数据库中的Lox-1基因组序列(GenBank：L35931.1)，采用Primer 3在线引物设计服务器，设计覆盖整个基因编码区的PCR引物(表1)，并采用ABI 3900基因合成仪合成相应寡核苷酸探针。以上述提取的DNA工作液为模板，利用Taq聚合酶对这些大麦材料的Lox-1基因进行PCR扩增和克隆测序。PCR扩增反应的条件为95℃3min，(95℃20s，58℃20s，72℃2min)共35个循环，72℃延伸7min后终止反应。

表1本发明用于基因组DNA和cDNA克隆测序及SNP鉴定的引物列表

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离回收后，连接载体pGEM-T后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，待检测获得阳性单克隆后，用ABI3730测序仪进行序列测定。采用VecScreen在线服务器进行载体去除，采用DNAstar软件进行序列拼接。

3.大麦RNA提取、反转录cDNA和Lox-1基因序列的获得

取0.1g发芽后的新鲜大麦叶片，液氮速冻研磨后采用Qiagen RNeasy^TM mini kit进行总RNA提取和纯化，然后采用Promega公司M-MLV反转录酶合成cDNA。PCR扩增反应和克隆测序方法同上。

4.导致LOX-1活性缺失的SNP位点的确定

对测序获得的基因组DNA序列和cDNA序列，进行多序列比对，同时比较这些cDNA翻译成蛋白质的序列变异情况，最终找到引起大麦LOX-1活性缺失的功能位点，结果表明，在步骤1中获得的四份活性缺失大麦种质，在Lox-1基因第二外显子中的一个单碱基突变(C-＞G)，而其他10份活性正常的大麦种质均为未发生突变，说明这一SNP与LOX-1活性缺失性状高度相关；cDNA测序结果也表明该基因在这个碱基突变位点处，内含子剪切位点发生两种类型的改变，导致其中3份材料所翻译蛋白质发生移码突变，另有一份材料翻译提前终止，最终使这些材料中LOX-1活性缺失。

5.SNP位点特异性分子标记的开发和有效性检测

针对该SNP位点，开发出特异性分子标记(参见表1RNF和RNR)，对4个LOX-1活性缺失材料和4个活性正常的材料以及杂交组配获得的F1代DNA，进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，拥有G型变异的4个LOX-1活性缺失材料均可以扩增出720bp左右的特异性目的条带，4个活性正常材料均可扩增出320bp的C型特异目的条带。不仅如此，对4个杂交获得的F1代进行PCR鉴定，能同时得到G型和C型两种类型的目的条带，说明本发明所开发的功能型分子标记可有效区分纯合和杂合突变位点，能够用于优质新品种选育的分子标记辅助选择，实现分子标记辅助进行大麦品质改良的育种目标。

Claims (3)

1.一种大麦脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：对大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提，并用化学显色的方法进行LOX-1活性鉴定，筛选出LOX-1活性缺失的自然变异材料，设计基因特异性引物，对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增和克隆测序，最终确定导致LOX-1活性缺失的突变位点；同时，从发芽后的大麦组织中提取mRNA，反转录为cDNA，对上述功能突变材料的LOX-1基因进行测序，并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析，进一步开发出改功能位点的多态性分子标记，其中基因组DNA测序引物为：

Lox1.1 GTCCGATCCATCTCTCCAAA TCGATCTGCACCAAACCATA

Lox1.2 CTTTCATTTTCACCGCCTTC GGCACGTAGATCTGCTCCA

Lox1.3 CGCTACGACGTCTACAACGA GCGCGTTTCAATCAATCATA

Lox1.4 GTACGTTCTCCACGGTCGAT AGCAATTCGTTCCGCTTAAA

cDNA克隆测序引物：

Lox1.FL1 AGCAGTGAAAGCGAGGAGAG TGATGGAGTAGCCCAGGAAG

Lox1.FL2 CGCCAACTCATGGATCTACC GAACGCCCTTTATTCATCCA

SNP鉴定引物：

RNR CACTAGTGATTCTGCGAGTGTGGAGCCC

RNF AAAACATAACTTTTTAATAGTAATGTTGCAC。

2.如权利要求1所述的一种大麦脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法，其特征在于：所述的化学显色方法为：称取大麦粉溶蒸馏水中，混合均匀后离心，取上清至另一离心管中；向离心管中一次加A溶液，反应20分钟，再加入的B溶液反应10分钟，最后用SDS终止反应，如果离心管中呈深蓝色，表明LOX-1活性正常，如果呈现浅蓝或者无色，表明LOX-1活性低或者无活性，其中反应溶液A：10ml 20mmDMAB/100mm磷酸缓冲液，0.4ml 25mm亚油酸底物和9.6ml双蒸水；反应溶液B：0.4ml 10mm MBTH，0.4ml 5mg/ml血红蛋白，19.2ml双蒸水。

3.如权利要求1或2所述的一种大麦脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法，其特征在于：区分纯合和杂合突变位点，能够用于优质新品种选育的分子标记辅助选择，实现分子标记辅助进行大麦品质改良的育种目标上的应用。 

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