CN111630188A - 新的粉质胚乳基因、分子标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定粉质胚乳性状的标志物及其用途。根据本发明，本发明所说明的针对单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组等可用于在育种阶段初期对所有稻品种，特别是粳稻(Japonica)品系的粉质胚乳进行简单且准确的鉴别，具体地，稻品种的粉质胚乳评估可用于筛选早期育种品系或单个F2植物。除此之外，本发明还可以延伸应用于以稻为主要原料的加工产品。

Description

新的粉质胚乳基因、分子标志物及其用途
技术领域
本发明涉及用于确定稻米粉质胚乳性状的新序列的基因、用于检测的分子标志物及其用途，以及检测方法。
背景技术
稻米是农民收入的主要来源，占韩国国内农业收入的70％，但由于饮食结构的西化以及功能性谷物消费的增加，稻米消费量持续减少。根据2017年韩国统计局的数据，人均年稻米消费量从1970年的136.4kg减少到2016年的61.9kg，稻米种植面积随之从1975年的121.8万公顷减少到2016年的77.9万公顷，这导致生产基础十分脆弱。
小麦与稻米一样是主要的粮食作物，小麦经过研磨工艺可以制成面粉，而面粉可以二次加工为食品。即，可以将小麦产业明确划分为育种及研磨等“原料产业”以及开发与供应多种加工产品的“食品产业”，因此，小麦被评价为在市场拓展及附加价值方面具有巨大潜力的农作物。对于稻米而言，除制成米糕外，还能够生产出约300多种加工食品，但实际上，在韩国用于加工的稻米约为22万吨(进口10万吨、国内生产12万吨)，这不到产量的5％。大多数企业都是自己购买精米并研磨成米粉，因此米粉的品质参差不齐，而且稻米制品的销售额(2006年约为1兆韩元)仅为饮料、食品制造业(销售额为49兆韩元)的2％。
由于稻米的谷粒硬度非常高，因此在韩国多采用湿法研磨工艺，即在水中泡开稻米后进行研磨。但利用湿法研磨时，生产100kg的米粉会产生约500升的米水，存在导致环境污染的问题。另外，为了使米粉流通，还必须增加额外工艺对米粉进行灭菌和干燥。因此，使用湿法研磨的米粉的加工成本(500-700韩元/kg)是干法研磨(200-300韩元/kg)的两倍以上。近年来，随着增设大量生产设备，半湿研磨技术已部分投入使用，但仍没有完全解决生产成本提高的问题。
为了生产具有竞争力的高品质米粉，除了研磨方式之外，还需考虑研磨后的粉粒大小(粒度)。由于面团或加工产品的物理、化学性质在很大程度上受粒度分布的控制，因此如何根据用途来构成和保持米粉的粒度非常重要。通常，根据米粉的物理性质，其粉质越细，面团硬度变化越小，和面时的吸水性也越好。因此，米粉的颗粒越细，其质量越高，流通价格也更高。但是，由于稻米的谷粒硬度高，使用低生产成本的干法研磨时，若想获得微小颗粒的米粉需要更大的机械力，这会导致受损淀粉粒的比例迅速增加。受损淀粉粒会导致面团的物理化学性质发生变化，进而导致米粉质量下降。近年来，已经开发出可以精细研磨米粉的喷射研磨(Jet Mill)、涡轮研磨(Turbo Mill)等技术，但是早期设备投资成本和生产成本方面的负担很大。
综上，为了在韩国顺利搭建以米粉为中心的大宗原料供应系统来促进稻米加工食品的开发和消费，需要：1)大幅降低米粉生产过程中的废水处理成本以及流通前的干燥和灭菌成本；以及2)提供可以将稻米粉碎至微小颗粒水平，还能够减少淀粉粒受损的具体方案。考虑到生产成本，1)工艺简单；2)研磨时间短；3)几乎不产生废水的干法研磨更为有利。此外，在韩国，用于研磨小麦的干法研磨设备已形成相当大的规模，这可以显着降低搭建生产设备的成本。
在上述技术背景下，已经积极地展开有关具有粉质胚乳性状的稻品种的开发及相关遗传标志物的研究(韩国授权专利10-1226485)，但仍然十分有限。
发明的内容
要解决的技术问题
本发明用于解决上述技术问题，其目的在于提供一种确定稻的粉质胚乳性状的新基因、由所述基因编码的蛋白、基于所述基因的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物及试剂盒，并且提供用于鉴别的方法。
本发明要解决的技术问题并不受限于上述言及的问题，本领域普通技术人员能够通过下面的说明明确理解未言及的其他问题。
解决问题的技术方案
为实现如上所述的本发明的目的，本发明提供一种确定SEQ ID No.2所示的稻的粉质胚乳性状的胞质型丙酮酸磷酸双激酶(cyOsPPDK，cytosolic pyruvateorthophosphate dikinase)基因。
根据本发明的另一方面，提供一种包括所述基因的重组载体。
根据本发明的又一方面，提供一种包括所述基因或所述重组载体的转化体。
所述转化体可以是稻。
根据本发明的另一方面，提供包括所述基因的植物。
根据本发明的另一方面，提供包括所述基因的稻。
根据本发明的另一方面，提供一种基于所述cyOsPPDK基因的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其包含能够检测存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的试剂。
存在于所述稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的SNP标志物的碱基是A或T。
能够检测所述单核苷酸多态性的试剂是与多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10个至300个连续的核酸序列。
能够检测所述单核苷酸多态性的试剂是由SEQ ID No.SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ ID No.4所示的反向引物组成的引物组；或者由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ ID No.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物以及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
根据本发明的另一方面，提供一种基于cyOsPPDK基因的用于鉴别所述粉质胚乳性状的试剂盒，其包含用于鉴别粉质胚乳性状的组合物。
根据本发明的另一方面，提供一种基于cyOsPPDK基因的粉质胚乳性状的鉴别方法，其包括确认存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的步骤。
存在于所述稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的碱基是A或T。
所述粉质胚乳性状的鉴别方法，还包括：步骤(a)，将从样品分离的基因组DNA作为模板，与和多核苷酸或与其互补的多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物发生反应，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10至300个连续的核酸序列；以及步骤(b)，确认所述反应物。
所述引物是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ ID No.4所示的反向引物组成的引物组；或者由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ ID No.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物以及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
所述粉质胚乳性状的鉴别方法，还包括用限制性酶处理所述步骤(b)的反应物的步骤。
所述限制性酶是Hinf I。
所述粉质胚乳性状的鉴别方法，还包括：步骤(a)，将从样品分离的基因组DNA作为模板，使多核苷酸或其互补多核苷酸与引物进行反应从而实现扩增，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性标志物的多态性位点的10至300个连续的核酸序列；以及步骤(b)，确认扩增的反应物。
所述粉质胚乳性状的鉴别方法，还包括：步骤(a’)，将从样品分离的基因组DNA作为模板，与和多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针进行杂交反应，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10至300个连续的核酸序列。
发明的效果
根据本发明，本发明所说明的确定稻的粉质胚乳性状的新基因可以作为开发具有粉质胚乳性状的植物的主要目标基因，其单核苷酸多态性(SNP)能够在育种阶段初期简单且准确鉴别多种稻品种是否表达粉质胚乳性状。具体地，能够在早期育种品系或单个F2植物的筛选阶段用于植物粉质胚乳评估，除此之外，还可以延伸应用于以稻为主要原料的加工产品，可用于加工稻的加工产业。
附图说明
图1a是显示基于作图的FLO4-4变异复制的附图，在(A)中，利用FLO4-4基因座的精确基因图谱显示出分子标志物及重组体的数量。以2个BAC克隆相重叠部分构成的33kb虚拟重叠群(contig)通过稻参考基因组(Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0)中两个重要标志物的电子定位(e-Landings)进行区分。在(B)中，FLO4-4基因结构及cDNA序列的比较可以显示为第8外显子G->A的碱基变异，野生型的Gly-404在FLO4-4被诱导为Asp-404。附图中，白色框表示未翻译的区域，黑色框表示编码区域，实线表示内含子。
图1b是显示通过比较Namil与Namil(SA)-FLO2的PPDK1(OS05G0405000-02)基因碱基序列来确认单核苷酸多态性位点的结果的附图。
图2是显示在dCAPS Finder 2.0中对探索的Namil，或Namil(SA)-FLO2的单核苷酸多态性位点进行扩增的候选dCAPs引物组的序列的附图。
图3是显示根据本发明的dCAPs引物组所扩增片段的碱基序列及限制性酶(HinfI)处理位点的附图。
图4是显示密阳(Milyang)23号、Namil及Namil(SA)-FLO2(S542)的电泳结果的附图，使用了利用根据本发明的dCAPs引物组及限制性酶的方法。
图5是图示化根据本发明的四引物ARMS引物组所扩增的片段的碱基序列位置的附图。
图6是显示基于根据本发明的四引物ARMS引物组的以下结果：(a)所扩增的片段的碱基序列；及(b)密阳23号、Namil，及Namil(SA)-FLO2(S542)的电泳结果的附图。
图7是显示密阳23号与Namil(SA)-FLO2杂交后代的电泳结果的附图，使用了利用根据本发明的dCAPs引物组及限制性酶的方法。
图8是显示具有类似遗传背景的粳稻品种的电泳结果的附图，使用了利用根据本发明的引物组及限制性酶的方法(1.Anmi、2.Aranghyangchal、3.Baekjinju、4.Baekogkhal、5.Boramchal、6.Boramchan、7.Borami、8.Boseok、9.Boseokchal、10.Boseokheukchal、11.Cheongnam、12.Chindeul、13.chucheong、14.Dabo、15.Danmi、16.Danpyeng、17.Deuraechan、18.Dodamssal、19.Dongjin、20.Dongjin 1、21.Dongjinchal、22.Geonganghongmi、23.Geonyang 2、24.Goami、25.Goami 2、26.Goami4、27.Haepum、28.Haiami、29.Hanam、30.Hanmaeum、31.Heukjinmi、32.Heukhyang、33.Heukjinju、34.Heuknam、35.Heukseol、36.Hongjinju、37.Hopum、38.Hwangkeumnuri、39.Hwaseong、40.Hwawang、41.Hwayeong、42.Hyangnam、43.Hyeonpum、44.Ilmi、45.Ilpum、46.Jukjinju、47.Jukjinjuchal、48.Heukhyangchal)。
图9是显示密阳23号与Namil(SA)-FLO2杂交后代的电泳结果的附图，使用了利用根据本发明的四引物ARMS引物的方法。
图10是显示具有类似遗传背景的粳稻品种的电泳结果的附图，使用了利用根据本发明的四引物ARMS引物组的利方法(1.Anmi、2.Aranghyangchal、3.Baekjinju、4.Baekogkhal、5.Boramchal、6.Boramchan、7.Borami、8.Boseok、9.Boseokchal、10.Boseokheukchal、11.Cheongnam、12.Chindeul、13.chucheong、14.Dabo、15.Danmi、16.Danpyeng、17.Deuraechan、18.Dodamssal、19.Dongjin、20.Dongjin1、21.Dongjinchal、22.Geonganghongmi、23.Geonyang 2、24.Goami、25.Goami2、26.Goami 4、27.Haepum、28.Haiami、29.Hanam、30.Hanmaeum、31.Heukjinmi、32.Heukhyang、33.Heukjinju、34.Heuknam、35.Heukseol、36.Hongjinju、37.Hopum、38.Hwangkeumnuri、39.Hwaseong、40.Hwawang、41.Hwayeong、42.Hyangnam、43.Hyeonpum、44.Ilmi、45.Ilpum、46.Jukjinju、47.Jukjinjuchal、48.Heukhyangchal)。
图11是显示根据本发明的Namil(SA)-flo2(S542)与Namil的表现型分析结果的附图。显示出Namil(SA)-flo2与Namil的糙米及截面图。并且，显示了成熟胚乳的电子显微镜图。如红色箭头所示，淀粉粒松散地填充Namil(SA)-flo2。黄色框显示出(在500μm比例照片中用框表示)放大的区域。
图12是显示在10DAF分析Namil与Namil(SA)-flo2之间的FLO4-4表达结果的附图，其中所示的值为平均值±SD(n＝3)。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
本发明提供确定稻的粉质胚乳性状的新序列的基因。本发明的新序列基因是确定稻的粉质胚乳性状的SEQ ID No.2所示的胞质型丙酮酸磷酸双激酶(cytosolic pyruvateorthophosphate dikinase，cyOsPPDK)基因。
在本发明中使用的术语“粉质胚乳(floury endosperm)”是指具有与糯稻类似的乳白且不透明的外观，同时具有淀粉粒松散排列的特性的突变。在米粉制造中多使用干法及湿法研磨，其中，干法研磨工艺简单，但存在增加受损淀粉粒的缺点；相反，湿法研磨加工性良好，但具有浸泡和干燥过程消耗时间与费用的限制因素。为了在激活稻米加工产业方面作出贡献，需要开发出针对不同用途具有相应特性的用于加工的多种品种以及制粉性质优秀的品种，而这样的粉质胚乳性状是克服现有干法研磨缺点的重要特性。
一方面，本发明的Namil(SA)-FLO2稻植物是指如下品系：利用将Namil种子沉浸在起到化学致突变作用的叠氮化钠(Sodium azide；NaN3)稀释溶液的方法来诱导突变，并使其经过发芽期及育苗期生长到植物(M1)，从M1植物收获M2种子后利用系统育种法将子代发展到M7，由此获得的遗传性固定的突变品系。与现有Namil相比，所述Namil(SA)-FLO2具有类似的直链-支链淀粉含量组成，但其谷粒硬度比普通稻低，使用干法研磨也能够获得粉质均匀且受损淀粉粒少的高品质米粉。但目前没有在育种阶段初期简单准确地鉴别上述品种的技术，具体地，不了解相关基因标志物。
为此，本发明的发明人通过分析Namil(SA)-FLO2稻品种的碱基序列，鉴别出确定粉质胚乳性状的基因(实验例1)，并鉴别出与所述粉质胚乳性状密切相关的单核苷酸多态性位点(实验例2)。并且，最早开发出针对所述单核苷酸多态性位点的引物组，并且通过实验证明了本发明的利用引物组的技术能够有效鉴别粳稻(Japonica)品系的稻品种的粉质胚乳性状。
本发明的粉质胚乳性状由新序列的PPDK基因决定。所述丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK)能够可逆转换丙酮酸(pyruvate)、ATP及磷酸(orthophosphate)并在多种植物细胞中执行多种功能，并编码靶向胞质溶胶及叶绿体的PPDK蛋白(分别为cyOsPPDK及chOsPPDK)。chOsPPDKmRNA在光合机构结构性表达，cyOsPPDK仅在授粉后生长的稻种子(grain)中表达。通常，在稻种子的生长时期中，cyOsPPDK在乳熟期表达最强，在授粉后10天左右cyOsPPDK蛋白表达水平最高，之后，在苏氨酰-磷酸化(threonyl-phosphorylation)及蛋白分解的翻译后，cyOsPPDK蛋白水平与活性根据组合机制均出现迅速下降。在日本晴(Nipponbare)中，cyOsPPDK的全长基因组是7656bp，cDNA包括19个外显子且为2649bp，并编码882个氨基酸蛋白。
本发明的cyOsPPDK包括对野生型cyOsPPDK基因的变异，并由此确定稻的粉质胚乳性状。本发明的cyOsPPDK基因的等位基因是隐性基因。本发明的变异基因cyOsPPDK在乳熟期之后(授粉后10日之后)，在灌浆期(grain filling stage)期间，相比野生型保持高水平表达。
特别是本发明的cyOsPPDK基因的第8外显子位点存在G->A的单核苷酸多态性(SNP)(在等位基因中从C变异到T)，由此，在本发明的cyOsPPDK基因所编码的蛋白的氨基酸序列中，存在从甘氨酸(G，Gly)到天冬氨酸(D，Asp)的变异(对应于所述单核苷酸多态性的位置404处氨基酸)。由此，在稻的灌浆期能够保持蛋白的表达及活性的同时还参与稻种子的生长，从而显示粉质胚乳性状。从这一层面，本发明的cyOsPPDK可以指cyOsPPDK变异基因、cyOsPPDK变异蛋白或cyOsPPDK mRNA变异基因。在本发明中，确定粉质胚乳性状的变异基因被命名为cyOsPPDK、Namil(SA)-flo2、flo7或FLO4-4，上述名称可以相互指代。
本发明的cyOsPPDK基因表示为SEQ ID No.2，并以登记编号MG267058储存在基因银行(GenBank)。
可以基于稻注释计划数据库(Rice Annotation Project Database,RAP-DB,http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/？name＝chr02％3A1..105000)表示本发明的cyOsPPDK基因的位置。本发明的cyOsPPDK基因座存在于BAC克隆OSJNBb0006J12与OJ1174_H11之间，粉质胚乳性状由cyOsPPDK变异基因的第8外显子的单核苷酸多态性(G->A)确定。
通过与稻参考基因组(IRGSP 1.0)比较来显示所述单核苷酸多态性，其存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置，其位置对应于SEQ IDNo.1所示的基因序列中4055号碱基。
本发明的术语“基因”作为确定性状的因子是指遗传单位，可视为对蛋白进行编码的核酸分子或多核苷酸。本发明的基因可以包含与上述SEQ ID No.2的碱基序列基本上同源的碱基序列。本发明所述的基本上同源的碱基序列是指以下碱基序列：对不同于本发明碱基序列的任意序列进行排列使其最大程度地对应本发明的碱基序列，然后利用本领域通常使用的程序(例如：DNASIS及ClustalX)对排列的序列进行分析，其中包含存在于本发明基因的单核苷酸多态性的同时，保持最低80％的同源性、更优选地最低90％的同源性、最优选地最低95％的同源性的碱基序列。
根据本发明的另一方面，提供一种包含所述基因的重组载体。可以利用本领域公知的多种方法构建本发明的载体系统，具体方法公开于冷泉港实验室出版社(2001)出版的Sambrook等人的分子克隆实验指南(Sambrook等人,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))中，该文作为参考并入本文。
本发明的载体可以是典型的用于克隆的载体或用于表达的载体。并且，本发明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主。
本发明中，所述载体作为用于改变性状的双元载体，可以使外源基因在所导入的植物中永久表达，通过在启动子下游(downstream)有效连接编码目标蛋白的基因来制备载体。
本发明的载体以用于蛋白表达的现有载体为基本框架，通过插入本发明的启动子，以及插入在所述启动子下游(downstream)对蛋白进行编码的碱基序列(基因)来构建。为了表达目标基因，所述重组载体可以包括特定启动子。
根据本发明的又一方面，本发明提供一种包含所述基因或载体的转化体。
本发明中术语“转化体”包括按照基因工程方法将本发明的基因作为外源基因插入宿主之后的个体；还包括如下个体，即为了对包括基于本发明的基因确定的粉质胚乳性状的后代个体进行育种，将至少一个包括本发明的基因的个体与其他个体进行杂交，从而具有本发明的基因的后代品系的个体。
可以按照本领域通常的公知方法制备本发明的转化体。
根据本发明的优选具体示例，所述转化体是植物，更优选地可以是稻。
基于这一方面，本发明可以提供cyOsPPDK变异基因；或具有SEQ ID No.2所示序列的稻。
在本发明的一具体示例，可以确定粉质胚乳性状的基因是变异cyOsPPDK，并且，是根据cyOsPPDK变异基因的第8外显子的单核苷酸多态性(G->A或C->T)确定粉质胚乳形状。
从这一方面，根据本发明的另一方面，可以提供对于确定粉质胚乳性状的新序列基因的单核苷酸多态性。
具体地，以稻参考基因组(IRGSP 1.0)信息为基础，基于第5号染色体的PPDK1候选基因的转录组信息，根据OS05G0405000-02(19,718,538-19,737,605bp)的碱基序列分析Namil与本发明的FLO4-4(Namil(SA)-flo2)的PPDK1内19,718,785-19,726,340(7,556bp)的碱基序列，并与参考基因组日本晴(IRGSP 1.0)进行比较，其结果，在Namil与Namil(SA)-flo2之间发现1个SNP，所述SNP存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置，这对应于SEQ ID No.1(Namil来源的多核苷酸序列，ch5:19,726,340-19,718,785)或SEQ ID No.2的序列中4055号碱基、SEQ ID No.9的4093号碱基。
更具体地，存在于所述稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的SNP标志物的碱基可以是A。更具体地，是所述SEQ ID No.1的多核苷酸序列中4055号位置；SEQ ID No.9的多核苷酸序列中4093号位置的G被置换为A，由此，在所述基因编码的蛋白序列中，作为氨基酸的甘氨酸(Gly，G)变异为天冬氨酸(Asp,D)，从而出现粉质胚乳性状。
由此，所述单核苷酸多态性中所述SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的4055号位置的G变为A，或者，SEQ ID No.9所示的多核苷酸序列的4093号位置的G变为A。
本发明中使用的术语“单核苷酸多态性(Single Nucleotide polymorphism，SNP)中，“多态性”是指一个基因座(locus)中存在两个以上的等位基因(allele)，在所述多态性位点中，仅单个碱基不同被称为单核苷酸多态性。并且，“等位基因(allele)”是指存在于相同染色体的相同基因座的一个基因的多种形态，SNP具有双等位基因(biallele)。
本发明的单核苷酸多态性可以用于鉴别粉质胚乳性状，根据本发明的另一方面，提供基于权利要求1的基因的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其包含一种试剂，所述试剂能够检测出存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物。
根据本发明的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物可用于鉴别包括粳稻(Japonica)品系在内的所有稻品种的粉质胚乳性状，根据一具体示例，可以鉴别Namil突变后代品系Namil(SA)-FLO2的粉质胚乳，但并非限定于此。并且，不仅可以将所述组合物应用于两种以上稻品种杂交的后代品系，还能够延伸适用于前述的以稻品种为主要原料生产的加工产品。
能够检测所述单核苷酸多态性的试剂是与多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10个至300个连续的核酸序列。
本发明中使用的术语“引物”是具有短的游离态3末端羟基(free 3'hydroxylgroup)的碱基序列，可以形成互补的模板(template)和碱基对(base pair)，起到复制模板链的起点作用的短序列。引物的长度根据使用目的有所不同，通常由15至30个碱基构成。引物序列不需要与模板完全互补，其互补程度应足够与模板杂交。所述引物可以扩增DNA片段，该DNA片段通过与包含多态性位点的DNA序列杂交从而具有多态性位点。
根据本发明的目的，所述引物能够扩增与粉质胚乳性状密切相关的单核苷酸多态性位点，作为非限制性示例，所述引物可以是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ IDNo.4所示的反向引物组成的引物组；或由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ ID No.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物，及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
或者，能够检测所述单核苷酸多态性的试剂能够是与多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物，其中，所述多核苷酸由包括存在于SEQID No.1或SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列的4055号位置、或SEQ ID No.9所示的多核苷酸序列的4093号位置的单核苷酸多态性位点的10个至300个连续的核酸序列。
根据本发明的一具体示例，所述试剂能够是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQID No.4所示的反向引物组成的引物组；或由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ IDNo.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物，及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
或者，优选地，所述引物组能够由与SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示的各个碱基序列具有80％以上同源性、更优选为90％以上同源性、进一步优选为95％以上同源性、最优选为99％以上同源性的任意碱基序列组成，所述引物组能够不受限制地包括扩增前述单核苷酸多态性位点的碱基序列。
优选地，所述引物组能够由与SEQ ID No.5至SEQ ID No.8所示的各个碱基序列具有80％以上同源性、更优选为90％以上同源性、进一步优选为95％以上同源性、最优选为99％以上同源性的任意碱基序列组成，所述引物组能够不受限制地包括扩增前述单核苷酸多态性位点的碱基序列。
可以使用亚磷酰胺固体支持方法或其他公知方法化学合成本发明的引物或探针。也可以使用本领域许多公知手段修饰此类核酸序列。上述修饰的非限制性示例包括：甲基化、加帽、用同源物置换一个或多个天然核苷酸，以及核苷酸之间的修饰，例如通过不带电的连接体(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)或带电的连接体(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)修饰。
并且，根据本发明的另一方面，提供一种基于确定稻的粉质胚乳性状的cyOsPPDK(cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase)基因的用于鉴别粉质胚乳性状的试剂盒，其包含所述用于鉴别粉质胚乳性状的组合物。
根据本发明的试剂盒，除了所述组合物之外，还可以额外地包含有助于执行PCR反应的DNA聚合酶、dNTP，及PCR缓冲液，不仅如此，本发明的试剂盒还能够包括用于执行确认PCR产物是否扩增的电泳所需的组成成分，或公知品种的识别参考表。并且，所述试剂盒还能够包括有助于探针反应的公知构成。
并且，根据本发明的另一方面，提供一种基于权利要求1所述的基因的粉质胚乳性状的鉴别方法，该方法包括确认存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的步骤。
所述单核苷酸多态性能够存在于SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列的4055号位置；或SEQ ID No.9所示的多核苷酸序列的4093号位置。
本发明的粉质胚乳性状的鉴别方法利用上述鉴别粉质胚乳性状的组合物中的组成成分，因此，为了防止说明书过于复杂，省略了对于共同适用内容的说明。
所述多态性位点的碱基通过在从样品分离的核酸样品中，与能够扩增单核苷酸多态性标志物的多态性位点，或能够检测单核苷酸多态性标志物的探针进行杂交，从而确认多态性位点的碱基。
例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、转录扩增(transcription amplification)、自主序列复制及核酸序列依赖性扩增(NASBA)对多态性位点进行扩增。
对于确认多态性位点的碱基的方法，其非限制性示例包括：测序分析、微阵列(microarray)杂交、等位基因特异性PCR(allele specific PCR)、动态等位基因特异性杂交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)、PCR延伸分析、单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应分析(PCR-RFLP)、TaqMan技术、SNPlex平台(Applied Biosystems公司)、质谱分析(例如Sequenom公司的MassARRAY系统)、微型测序方法(mini-sequencing)、Bio-Plex系统(BioRad公司)、CEQ和SNPstream系统(Beckman公司)、分子反转探针技术(Molecular Inversion Probe，例如Affymetrix公司的基因芯片)和Bead芯片(Illumina公司的HumanOmni2.5-8)。例如，可以利用SNP芯片确认多态性位点的碱基。SNP芯片是指可以一次性确认数十万个SNP各自的碱基的DNA微阵列。
测序分析可以使用确定碱基序列的一般方法，并且可以使用自动化遗传分析仪来执行。另外，等位基因特异性PCR是指用引物组扩增所述SNP所在的DNA片段的PCR方法，其中，所述引物组包括以所述SNP所在的碱基作为3'末端设计的引物。所述方法的原理如下：例如，对于特定碱基从G被置换为A的情况，当利用包括作为3'末端碱基的G的引物和能够扩增合适大小的DNA片段的反向引物进行PCR时，SNP的碱基为G时可以正常扩增并观察到所期望位置的带，当碱基被置换为A时，引物可以与模板DNA互补结合，但3'末端无法互补结合，因此无法正常执行扩增。可以通过常规方法进行DASH，优选通过例如Prince等人的方法进行。
PCR延伸分析首先使用引物来扩增包含单核苷酸多态性碱基的DNA片段，然后通过对反应中的所有核苷酸进行脱磷酸来使其失活，然后通过添加SNP特异性延伸引物、dNTP混合物、双脱氧核苷酸、反应缓冲液和DNA聚合酶进行引物延伸反应。此时，延伸引物将紧邻SNP碱基的5'方向的碱基作为3'末端，并且从dNTP混合物中排除了具有与双脱氧核苷酸相同的碱基的核酸，其中，所述双脱氧核苷酸是从表示SNP的碱基种类中选择的一种。例如，当从A置换到G时，将dGTP、dCTP与TTP混合物，以及ddATP添加到反应中时，则发生置换的碱基上的引物会被DNA聚合酶延伸，引物延伸反应在经过几个碱基之后A碱基首次出现的位置上被ddATP终止。如果不发生所述置换，则在该位置终止延伸反应，因此可以通过比较延伸引物的长度来对具有SNP的碱基类型进行鉴别。
在这种情况下，当对延伸引物或双脱氧核苷酸进行荧光标记时，可以使用一般测序中使用的基因分析仪(例如，ABI公司的3700型号)检测荧光，由此检测所述SNP；当使用未标记的延伸引物及双脱氧核苷酸时，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrixassisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF)技术测量分子量，由此检测所述SNP。
作为本发明的一具体示例，所述粉质胚乳性状的鉴别方法包括以下步骤：(a)将从样品分离的基因组DNA作为模板，与和多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物进行PCR，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10至300个连续的核酸序列；以及步骤(b)，确认由所述PCR扩增的反应物，由此鉴别样品个体是否具有粉质胚乳性状。当所述PCR反应物结果与具有cyOsPPDK基因的个体(Namil(SA)-FLO2)相同时，所述样品的植物个体具有粉质胚乳性状。
或者，根据本发明的另一具体示例，所述粉质胚乳性状的鉴别方法还包括以下步骤：(a’)将从样品分离的基因组DNA作为模板，用与多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针进行反应，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10至300个连续的核酸序列。
所述粉质胚乳性状的鉴别方法还包括，用限制性酶处理所述步骤(b)的扩增产物的步骤。更具体地，所述限制性酶可以是Hinf I。当通过所述限制性酶处理，PCR扩增反应物被剪切为2个以上片段时，可以确定为具有粉质胚乳性状。然而，根据所设计的引物特性，限制性酶的种类及其反应状态会有所不同。
作为本发明的一具体示例，所述(a)中能够检测单核苷酸多态性的试剂可以是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ ID No.4所示的反向引物组成的引物组；或由SEQ IDNo.5所示的外部正向引物、SEQ ID No.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物，及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
可以从包括粳稻(Japonica)品系的全部稻品种(候选品种)或Namil突变后代品系Namil(SA)-FLO2中获得本发明的样品，不仅如此，也能够从以上述稻品种为主原料制作的加工产品中获得本发明的样品。
在本发明中，可以使用SDS提取法、CTAB分离法(十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide))或市场中销售的DNA提取试剂盒等本领域通常使用的方法，从样品中分离基因组DNA。
本发明中的PCR可以使用对上述候选品种或样品中的单碱基多态性位点进行扩增的任何方法，其非限制性示例包括选自由实时PCR、qRT-PCR或多重PCR组成的群组中选择的任一种。与此同时，可以用限制性酶另外处理PCR产物，其中，所述限制性酶可以是Hinf I，但并非受限于此。
在本发明中，确认PCR扩增产物的步骤可以通过DNA芯片、凝胶电泳、放射性测量、荧光测量或磷光测量来进行，但并非受限于上述方法。作为检测扩增产物的方法之一，可以进行凝胶电泳，并且根据扩增产物大小的不同来使用琼脂糖凝胶电泳或丙烯酰亚胺凝胶电泳。
下面，提供优选实施例来帮助理解本发明。但下述实施例仅用于理解本发明，并不用于限定本发明的内容。
实施例
准备例实验准备及方法
准备例1.实验植物及材料
Namil及具有粉质胚乳性状的Namil(SA)-FLO2的DNA，是在分别采集幼叶后，利用CTAB分离法(Murray&Thomason，1980)进行分离。通过0.8％琼脂糖凝胶(agarose gel)电泳检测分离的DNA，利用NanoDrop光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)定量后稀释为5ng/μl来用于PCR。
Namil(SA)-FLO2/密阳23号的F2群体与亲本品系在韩国釜山大学实验基地培育，为了粉质胚乳基因的精确基因图谱绘制，制备了F3:4家族。根据制造公司指南，使用
Figure BDA0002515512920000151
Plant II试剂盒(德国的MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG公司)从所有基因型的新鲜叶子中提取总基因组DNA。
准备例2.重新测序及开发分子标志物
使用Illumina HiSeq 2500测序系统平台(美国的Illumina Inc.公司)，对Namil(SA)-flo2与密阳23的总基因组以平均75倍的覆盖度重新测序。将原(raw)序列读取(read)相对于稻参考基因组(IRGSP 1.0)排序(Kawahara等人，2013)。为了制作与粉质胚乳相关的基因图谱，使用没有缺失值(missing value)的SNP、最小等位基因频率(minor allelefrequency，MAF)>0.05、对双亲本序列的基因型调用(genotype call)。为了缩小目标位点，利用Oligo7.0软件选择SNP，开发出8个切割扩增多态性序列(CAPS，amplifiedpolymorphic sequence)标志物。
准备例3.制作用于确定粉质胚乳的精确基因图谱
将RM18624和RM18639之间的基因组区域为异质的F2子代生长为F3子代。然后，使F3植物自交后获得F3:4种子。剥离亲本品系和随机选择的96个F3:4重组体的外皮后肉眼观察胚乳，并用8个CAPS标志物确定基因型。在MSU稻基因组注释项目数据库(MSU Rice GenomeAnnotation Project Database)(http：//rice.plant biolo gy.msu.edu/)中公开了相应区域的开放阅读框(ORF)和该区域的功能。
进行PCR，反应物总体积为20μl，其中含10ng的DNA模板、各种引物各10pmol、1xPCR缓冲液[50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100和1.5mM MgCl2]、0.2mMdNTP、1单位Taq DNA聚合酶(韩国Nurotics公司)。使用MJ Research PTC-100热循环仪(美国马塞诸塞州Waltham公司)在以下条件下进行PCR：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、共36个循环；58℃退火30秒；72℃延伸1分钟；最后72℃延伸10分钟。用限制性酶(New EnglandBiolabs公司)剪切PCR产物。使用WatCut程序(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php？act＝snp_new)检测包含CAPS标志物的剪切的PCR产物。使用6M尿素和1XTAE在3％聚丙烯酰胺凝胶上以80V分离剪切产物，并使用Molecular
Figure BDA0002515512920000161
Gel DocTM XR系统(美国Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行可视化。
准备例4.基因克隆及变异位置识别
使用CLC Sequence Viewer 7比较了Namil(SA)-flo2和Namil中cyOsPPDK的编码序列。为了确认变异位点，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/)将HinfI限制性酶位点添加到粉质胚乳变异体Namil(SA)-flo2。
使用引物F(CCCAGGTGATGCAGGTGAG；SEQ ID No.32)和R(GCACAGGTCTTGGACATTGC；SEQ ID No.33)，对Namil(SA)-flo2和Namil中含有突变位点的161bp片段进行PCR扩增。在总体积为15μl的溶液中用HinfI(New England Biolabs公司)对PCR产物进行剪切，其中，所述溶液包括：5μl的PCR产物、1.5μl的10X NEBuffer、0.5μl的HinfI、及8μl超纯水，然后在37℃培养2小时。将剪切产物在4％琼脂玫瑰凝胶中分离。dCAPS标志物还用于F3:4家族以及各自具有胚乳表现型的48种韩国稻品种的共分离分析。使用基于日本晴(Nipponbare)的cyOsPPDK基因序列设计的引物，在三个重叠区域克隆了CyOsPPDK基因的总基因组DNA。
[表1]
Figure BDA0002515512920000171
准备例5.分离总RNA及qRT-PCR分析
使用RNeasy Plant Mini试剂盒(德国希尔登QIAGEN公司)，从开花后10天(DAF)的Namil及Namil(SA)-flo2的米粒中分离总RNA。用DNase I(德国希尔登QIAGEN公司)去除基因组DNA，并使用RNA至cDNA EcoDry Premix试剂盒(美国加州山景城Clontech公司)进行逆转录。
使用具有Rotor-Gene Q设备(德国希尔登QIAGEN公司)的QuantiNova SYBR GreenRT-PCR试剂盒(德国希尔登QIAGEN公司)，在以下PCR条件下进行qRT-PCR。95℃ 10分钟；之后95℃ 10秒(共40个循环)；60℃ 20秒。计算相对于Namil的变化倍数。倍数的推导结果是3次重复实验的平均值±标准差，并且将稻肌动蛋白1(OsACT1；Os03g0718150)用作内部对照组。根据FLO4-4的编码序列设计qRT-PCR引物(qOsPPDKB)，并使用表1的引物。
实验例1鉴别确定粉质胚乳性状的基因
实验例1-1.粉质胚乳相关基因座图谱
参考籼稻(Indica)品种密阳23号，对在准备例中重新测序的Namil(SA)-flo2的总基因组进行排列。在所有目标区域中共确认2604个SNP。将RM18624和RM18639之间的基因组序列作为模板设计了8个CAPS标志物(表2)，并对F3:4家族来源的60个粉质胚乳个体和36个正常个体进行基因型分析。对所述重组体的基因型及其后代表现型进行了各种比较。
[表2]
Figure BDA0002515512920000181
由于发现与本发明的粉质胚乳有关的候选碱基受隐性基因调控，如果粉质胚乳个体的CAPS标志物的基因型与密阳23号或杂合子基因型一致，则判断所述CAPS标志物侧翼区不是目标基因位置。另外，在具有野生型胚乳的个体中，如果CAPS标志物基因型与Namil(SA)-flo2相同，同样判断该基因位置不是目标基因位置。
如图1a和图1b所示，识别出了对于CAPS 5-8具有杂合子基因型和粉质胚乳的个体；以及对于CAPS 1-4具有Namil(SA)-flo2基因型和正常胚乳的个体。在用CAPS 8标志物和RM18639标记目标区域两端的33kb区域，用BAC克隆OJ1174_H11和OSJNBb0006J12在图谱上进行标记。
实验例1-2.分析粉质胚乳的候选基因
根据RAP-DB(稻注释项目数据库(Rice Annotation Project Database)，http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/？name＝chr02％3A1..105000)，在上述33kb区域中将四个基因预测为目标基因候选(图2a)。其中，Os05g0404500编码假定蛋白(hypothetical)，Os05g0404700是与甲基化结合蛋白基因MBD1类似的功能基因，Os05g0404901编码保守假定蛋白，Os05g0405000是PPDK基因。
在Namil(SA)-flo2，在四种候选基因和野生型Namil的测序中，PPDK的第8外显子中确认到G/A SNP(图1b的(B))。为了分析稻灌浆期种子的PPDK转录组类型，还利用表1中的三个引物额外确认了Namil(SA)-flo2和Namil的PPDK与PF2/PR3(cyOsPPDK)和PF3/PR3(chOs PPDK)引物组合(Kang等人，2005)。
将Namil(SA)-flo2和Namil的cyOsPPDK碱基序列与日本晴(Nipponbare)碱基序列进行比较，其结果，除了Namil(SA)-flo2之间的编码区的SNP之外，在内含子区域的9个SNP；内含子区域及具有同源突变的编码区域的2个SNP中发现6个插入缺失标记(InDel)。将根据本发明的新序列的隐性粉质胚乳相关基因命名为Floury4-4(FLO4-4)。Namil(SA)-flo2和Namil的FLO4-4的全长编码序列分别以登记编号MG267058和MG267056存放在基因银行。
[表3]
Figure BDA0002515512920000201
实验例1-3.分析粉质胚乳相关基因的表达特性
使用dCAPS标志物，在Namil(SA)-flo2和Namil(Namil)(Mo等人.2013)杂交的94种F2样品中，确认了FLO4--4基因对粉质谷粒(grain)比率变化的影响。
使用qRT-PCR检查灌浆期稻中FLO4-4的转录组类型。Namil(SA)-flo2中FLO4-4的相对表达水平远高于Namil(图11)，这说明FLO4-4表达与灌浆期有关，并且这意味着谷粒的质感差异原于FLO4-4等位基因。综合上述结果表明FLO4-4是负责稻粉质胚乳的基因座(locus)。
实验例2.确定与粉质胚乳性状有关的单核苷酸多态性位点
实验例2-1.通过比较Namil与Namil(SA)-FLO 2的PPDK1(OS05G0405000-02)基因碱基序列确定单核苷酸多态性位点
根据稻参考基因组(IRGSP 1.0)信息，确定了位于5号染色体上的候选基因PPDK1的转录组信息，并根据OS05G0405000-02(19718538-19737605bp，http://ensembl.gramene.org/Oryza_sativa/Transcript/Summary？db＝core；g＝OS05G0405000；m r＝5:19725828-19725829；r＝5:19718000-19733014；t＝OS05T0405000-02；tl＝FRpMRF4sd5cjS Kwa-7218-3304471)的碱基序列合成测序引物(sequencing primer)，分析了Namil及Namil(SA)-FLO2的PPDK1中的19,718,785-19,726,340(7,556bp)的碱基序列。具体地，使用下表1的引物组分为3个区域扩增DNA片段，之后，使用17个测序引物进行碱基序列分析。
对Namil和Namil(SA)-FLO2的PPDK1内OS05G0405000-02(反向链(reversestrand))对应区域(7556bp)的碱基序列进行分析，其结果如下表2所示，与作为参考基因组的日本晴(IRGSP 1.0)相比，Namil中发现了6个InDel和11个SNP、Namil(SA)-FLO2中发现了6个InDel和12个SNP、Namil和Namil(SA)-FLO2之间发现了1个SNP。
另外，如图1b所示，与所发现粉质胚乳性状有关的SNP对应于IRGSP参考基因组中19,722,254bp位置，在Namil中为“G”，在Namil(SA)-FLO2中为“A”。由此可以确认，OS05G0405000-02(反向链)的氨基酸序列从甘氨酸(Gly，G)变异为天冬氨酸(Asp，D)。
实验例2-2.制备用于鉴别Namil(SA)-FLO2的粉质胚乳性状的引物组
1.制备dCAPs引物组
使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)制备用于实施例1中鉴定的SNP的dCAPs引物。利用所发现SNP周围的60bp碱基序列信息探索1bp错配(mismatch)引物，由此如图2所示，通过dCAPS Finder 2.0确认了剪切Namil的正向序列的14个引物，剪切Namil的反向序列的7个引物。此外，还搜索到剪切Namil(SA)-FLO2的正向序列的4个引物和剪切Namil(SA)-FLO2的反向序列的5个引物。最后，如表3所示，选择能够使剪切的具有粉质胚乳性状的Namil(SA)-FLO2与限制性酶(Hinf I)稳定反应的引物组。
[表4]
引物 序列信息
Flo2-Hinf I-F CCCAGGTGATGCAGGTGAG(SEQ ID No.3)
Flo2-Hinf I-R GCACAGGTCTTGGACATTGC(SEQ ID No.4)
进行PCR的反应物总体积为20μl，其中含10ng的DNA、5pmol的正向及反向引物、0.2mM dNTP mix、1X PCR缓冲液[50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、1.5mM MgCl2]及1单位Taq DNA聚合酶(韩国Nurotics公司)。使用
Figure BDA0002515512920000221
Figure BDA0002515512920000222
热循环仪(美国Waltham公司)按照如下进行反应：95℃预变性5分钟；95℃20秒、61℃30秒、72℃60秒，共35个循环，最后72℃反应10分钟。
一方面，使用剪切5'...GAGTC...3'位点的Hinf I作为限制性酶，如图3所示，Namil没有被限制性酶剪切，而Namil(SA)-FLO2由于SNP具有GAGTC序列，因此可被限制性酶剪切。进行限制性酶处理时，总体积为15μl，其中使用1X酶缓冲液[50mM乙酸钾、20mM Tris-乙酸盐、10mM乙酸镁、100μg/ml BSA]、10ng PCR产物、5U Hinf I(英国NEB公司)。使用
Figure BDA0002515512920000223
热循环仪(美国Waltham公司)，在37℃反应120分钟。使用Flagment分析仪(Flagment analyzer，FA)对产物进行电泳，并由此鉴定基因型。
其结果如表5和图4所示，Namil(SA)-FLO2、Namil和参考基因组(IRGSP 1.0，日本晴)的161bp扩增，但由于Hinf I限制性酶，Namil(SA)-FLO2被剪切为17，154bp形式，而Namil和参考基因组(IRGSP 1.0，日本晴)没有被剪切。
[表5]
Figure BDA0002515512920000224
即通过上述差异可知，能够有效鉴别Namil突变后代品系的粉质胚乳性状。
2.制备四引物ARMS引物组
使用Primer1(用于四引物ARMS-PCR的引物，http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html)服务来开发四引物ARMS-PCR引物，该引物可以省略对发现的SNP进行限制性酶处理的步骤。使用包括所述实施例1中鉴定的SNP的940bp碱基序列信息和SNP(G/A)信息(Andrew Collins及Xizyi Ke.开放生物信息学杂志，2012,55-58.(Andrew Collins andXizyi Ke.The Open Bioinformatics Journal,2012,55-58.))，如下表6所示，选择了无需限制性酶处理就能够鉴别具有粉质胚乳性状的Namil(SA)-FLO2的SNP的引物组。
[表6]
Figure BDA0002515512920000231
具体地，当使用FLO2四引物ARMS-PCR引物进行PCR时，如表7和图5所示，具有G等位基因的Namil，显示出基于FLO2-外部-F和FLO2-外部-R的635bpPCR片段以及基于与G等位基因结合的FLO2-内部-F(G)和FLO2-外部-R的307bp片段，与此相反，带有A等位基因的FLO2显示出基于FLO2-外部-F和FLO2-外部-R的635bp的片段，以及基于与A等位基因结合的FLO2-内部-R(A)和FLO2-外部-F的368bp片段。
[表7]
Flo2 Namil 日本晴(IRGSP 1.0)
PCR片段大小(bp) 368+635 307+635 307+635
进行PCR反应，反应物总体积为20μl，其中含10ng的DNA、5pmol的4种引物、0.2mMdNTP mix、1X PCR缓冲液[50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、1.5mMMgCl2]及1单位Taq DNA聚合酶(韩国Nurotics公司)。使用
Figure BDA0002515512920000241
Figure BDA0002515512920000242
热循环仪(美国Waltham公司)进行如下反应：95℃预变性5分钟；95℃20秒、59℃30秒、72℃60秒，共35个循环，最后72℃反应10分钟。使用4％琼脂糖凝胶对结果物进行电泳分析，然后确定基因型。
其结果如图6所示，通过使用制备的FLO2四引物ARMS-PCR引物进行PCR，可以获得Namil(SA)-FLO2特异性片段。即，发现通过这些差异，也可以有效鉴别Namil突变后代品系的粉质胚乳性状。
实验例2-3.验证用于鉴定Namil(SA)-FLO2的粉质胚乳性状的引物效果
1.验证dCAPs引物组的效果
Namil(SA)-FLO2密阳23号杂交后代F2个体中，从在先研究中所述5号染色体相关位点为异质形态的个体收获种子进行培育来获得后代分离群组。在收获后评价种子的胚乳性状并将其播种，并从植物中提取DNA用于基因型评价。此外，为了在具有相似遗传背景的群组中确认筛选效果，从韩国国家食品科学技术院购买了48种韩国国产粳稻品种的DNA(1.Anmi、2.Aranghyangchal、3.Baekjinju、4.Baekogkhal、5.Boramchal、6.Boramchan、7.Borami、8.Boseok、9.Boseokchal、10.Boseokheukchal、11.Cheongnam、12.Chindeul、13.chucheong、14.Dabo、15.Danmi、16.Danpyeng、17.Deuraechan、18.Dodamssal、19.Dongjin、20.Dongjin 1、21.Dongjinchal、22.Geonganghongmi、23.Geonyang 2、24.Goami、25.Goami 2、26.Goami 4、27.Haepum、28.Haiami、29.Hanam、30.Hanmaeum、31.Heukjinmi、32.Heukhyang、33.Heukjinju、34.Heuknam、35.Heukseol、36.Hongjinju、37.Hopum、38.Hwangkeumnuri、39.Hwaseong、40.Hwawang、41.Hwayeong、42.Hyangnam、43.Hyeonpum、44.Ilmi、45.Ilpum、46.Jukjinju、47.Jukjinjuchal、48.Heukhyangchal)。
对于38个密阳23号和Namil(SA)-FLO2的杂交后代F2:4植物，将作为亲本的密阳23号及Namil(SA)-FLO2，以及作为用于突变的原品种的Namil作为比较品种，按照与实施例2相同的条件进行分析。其结果如图7所示，设定A型指未被限制性酶Hinf I剪切，B型指被限制性酶Hinf I剪切为17bp和154bp，密阳23号和用于突变的原品种Namil显示A型，作为粉质胚乳的Namil(SA)-FLO2显示B型。此外，杂交后代F2:4植物的基因型，在具有正常胚乳的19个个体中显示杂合子与A型结果，可知F2:4植物中正常表现型对于粉质胚乳是显性。由此，胚乳表现出粉质性状的19个个体的基因型均为B型。
另外，对于48种粳稻(japonica)培育品种，将作为亲本的密阳23号及Namil(SA)-FLO2，以及作为突变原品种的Namil作为比较品种，按照与实施例2相同的条件进行分析。其结果如图8所示，可以确认具有粉质胚乳性状的Namil(SA)-FLO2显示为B型，其余47种全部显示为A型。从这些结果中可知，根据本发明的SNP和用于其的dCAPs引物可以有效鉴别粉质性状。
2.验证四引物ARMS引物组的效果
Namil(SA)-FLO2密阳23号杂交后代F2个体中，从在先研究中所述5号染色体相关位点为异质形态的个体收获种子进行培育来获得后代分离群组。在收获后评价种子的胚乳性状并将其播种，并从植物中提取DNA用于基因型评价。此外，为了在具有相似遗传背景的群组中确认筛选效果，从韩国国家食品科学技术院购买了48种韩国国产粳稻品种的DNA(与实施例3-1相同)。
对于38个密阳23号和Namil(SA)-FLO2的杂交后代F2:4植物，将作为亲本的密阳23号及Namil(SA)-FLO2，以及作为用于突变的原品种的Namil作为比较品种，按照与实施例2相同的条件进行分析。其结果如图9所示，显示正常胚乳的个体的结果为密阳23号型(307bp+635bp)或杂合子(307bp+368bp+635bp)，具有粉质胚乳性状的个体均显示FLO2型(368bp+635bp)片段。
此外，对于48种粳稻(japonica)培育品种，将作为亲本的密阳23号及Namil(SA)-FLO2，以及作为用于突变的原品种的Namil作为比较品种，按照与实施例2相同的条件进行分析。其结果如图10所示，仅从显示粉质胚乳性状的Namil(SA)-FLO2观察到368bp+635bp片段。由此可知，根据本发明的SNP和用于其的四引物ARMS引物可以有效鉴别粉质胚乳性状。
以上对于本发明的说明仅作为示例，本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将其修改为其他特定形式。因此，上述实施例在所有方面仅作为说明，并非用于限制本发明。
Figure IDA0002515512980000011
Figure IDA0002515512980000021
Figure IDA0002515512980000031
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Claims (15)

1.cyOsPPDK(胞质型丙酮酸磷酸双激酶)基因，其特征在于，确定稻的SEQ ID No.2所示的粉质胚乳性状。
2.重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的基因。
3.转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的基因或权利要求2所述的重组载体。
4.稻，其特征在于，包含权利要求1所述的基因。
5.基于权利要求1所述的基因的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其特征在于，包含能够检测存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的试剂。
6.根据权利要求5所述的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其特征在于，
存在于所述稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的SNP标志物的碱基是A或T。
7.根据权利要求5所述的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其特征在于，
能够检测所述单核苷酸多态性的试剂是与多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10个至300个连续的核酸序列。
8.根据权利要求5所述的用于鉴别粉质胚乳性状的组合物，其特征在于，
能够检测所述单核苷酸多态性的试剂是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ IDNo.4所示的反向引物组成的引物组；或者由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ IDNo.6所示的外部反向引物、SEQ ID No.7所示的内部正向引物以及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
9.基于权利要求1所述的基因的用于鉴别粉质胚乳性状的试剂盒，其特征在于，
包含权利要求5至权利要求8中任一项所述的组合物。
10.基于权利要求1所述的基因的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，
包括确认存在于稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的步骤。
11.根据权利要求10所述的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，
存在于所述稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的单核苷酸多态性(SNP)标志物的碱基是A或T。
12.根据权利要求10所述的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，
所述粉质胚乳性状的鉴别方法还包括：步骤(a)，将从样品分离的基因组DNA作为模板，与和多核苷酸或其互补多核苷酸特异性杂交的探针；或者能够对其进行扩增的引物发生反应，其中，所述多核苷酸包含稻参考基因组(IRGSP 1.0)第5号染色体的19,722,254bp对应位置的碱基的10至300个连续的核酸序列；以及步骤(b)，确认所述反应物。
13.根据权利要求12所述的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，
所述引物是由SEQ ID No.3所示的正向引物及SEQ ID No.4所示的反向引物组成的引物组；或者由SEQ ID No.5所示的外部正向引物、SEQ ID No.6所示的外部反向引物、SEQ IDNo.7所示的内部正向引物以及SEQ ID No.8所示的内部反向引物组成的引物组。
14.根据权利要求12所述的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，还包括用限制性酶处理所述步骤(b)的反应物的步骤。
15.根据权利要求14的粉质胚乳性状的鉴别方法，其特征在于，所述限制性酶是HinfI。
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