CN104561364B - 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用 - Google Patents

一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104561364B
CN104561364B CN201510060627.0A CN201510060627A CN104561364B CN 104561364 B CN104561364 B CN 104561364B CN 201510060627 A CN201510060627 A CN 201510060627A CN 104561364 B CN104561364 B CN 104561364B
Authority
CN
China
Prior art keywords
saccharum
type
spsb
sugarcane
cane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510060627.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104561364A (zh
Inventor
刘洪博
刘新龙
范源洪
蔡青
陆鑫
毛钧
徐超华
李旭娟
苏火生
马丽
林秀琴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences filed Critical Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510060627.0A priority Critical patent/CN104561364B/zh
Publication of CN104561364A publication Critical patent/CN104561364A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104561364B publication Critical patent/CN104561364B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速检测甘蔗蔗糖磷酸合成酶B基因多态性方法，属于植物分子育种领域。该方法是以甘蔗大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗或甘蔗细茎野生种印割1号的基因组DNA为模板，设计1对引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶检测，将大小为287bp片段的<i>SPS</i>B基因型命名为C1型，将大小为331bp片段的<i>SPS</i>B基因型命名为C2型，依据片段大小的不同鉴定甘蔗<i>SPS</i>B基因的多态性。本发明为甘蔗糖分性状标记辅助选择提供了一种在DNA水平的鉴定方法，有利于甘蔗杂交后代中<i>SPS</i>B基因不同单倍型的跟踪和利用，对快速建立遗传优良的甘蔗种质具有重要意义。

Description

一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法及应用
技术领域
本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种检测甘蔗SPSB基因(JN584485)多态性的方法，及其在甘蔗糖分性状的标记辅助选择育种中快速建立遗传优良的甘蔗种质的应用。
背景技术
甘蔗属(Saccharum)包含热带种(Saccharum.officinarumL.)、中国种(SaccharumsinenseR.)、印度种(SaccharumbarberiJ.)、甘蔗大茎野生种(SaccharumrobustumB.)和甘蔗细茎野生种(SaccharumspontaneumL.)，是甘蔗杂交育种中常用的甘蔗资源，染色体复杂多变，多为异源多倍体植物，细胞核内含有多套染色体组。因此杂交后代的性状分离严重，一个杂交花穗的后代有成百上千后代类型，不能精确各单倍型在后代的传递方式。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是甘蔗蔗糖合成最关键的酶之一，鉴定和分离出不同多态性的SPS基因对甘蔗的定向杂交与提高甘蔗蔗糖分具有重要的意义。目前，我国甘蔗育种还基本上以传统的杂交为主，从不同的杂交组合中选出性状优良的，高产高糖的品种。但这一方式耗费时间长，育成一个品种至少需要6年以上的时间，而且在选配杂交组合时仅从表型性状来选择父母本，加上甘蔗开花条件的限制，育成一个新品种的难度很大，因此如何从分子水平来指导甘蔗的品种选育成为育种家们关注的焦点。
甘蔗是我国重要的糖料作物，提高单位面积内甘蔗产量是甘蔗育种家们一直追求的目标。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的关键酶之一，共有4个家族，它是甘蔗体内光合产物向蔗糖和淀粉分配的关键调控点，在该酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖生成六磷酸蔗糖，此产物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，与蔗糖的合成呈正相关，对甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析SPS基因遗传变异特别是多态位点与甘蔗糖分性状的关联程度，对培育具有优良性状的甘蔗新品种和提高育种速度具有重要的理论指导意义。
目前国内外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研究较多，主要从mRNA的角度来进行研究，但该基因的内含子区域并没有得到完整的克隆，其内含子区域的多态性分析也未见报道。虽然内含子不能决定基因的表达功能，但内含子的多态性可以区分不同倍性的SPS基因及其来源。
发明内容
本发明解决的问题在于利用甘蔗属不同种基因组DNA来筛查SPSB基因的多态性，寻找插入性片段作为PCR检测的位点，从而提供一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，并以此作为甘蔗多态性的标记，为不同SPSB基因型的甘蔗杂交育种提供一定的指导。
本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，设计一对引物SPSB2177P2扩增含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条带类型判断SPSB基因多态类型，
包括如下步骤：
步骤(1)，模板的制备：提取被测样本的基因组DNA；
步骤(2)，引物设计：所述的引物对SPSB2177P2为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
步骤(3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤(4)，基因型的判断；
步骤(5)，SPSB基因多态结果鉴定。
上述技术方案中，所述的模板为甘蔗属大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗和甘蔗细茎野生种印割1号的DNA。
上述技术方案中，所述的PCR扩增体系为：
上述技术方案中，所述的扩增程序为94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。
所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2.5％(w/v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μLLoadingbuffer混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR结果。具体结果如图1所示，甘蔗栽培种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗、印度种Nagori和大茎野生种51NG3同时含有C1和C2型，而甘蔗细茎野生种印割1号仅含有C1型，表现为C2缺失型。
上述技术方案中，所述的基因型的判断的具体方法为：根据步骤(3)电泳检测的结果，所设计的引物特异性好，仅能扩增出287bp和331bp的片段。当出现大小为287bp片段，为未插入性片段，则该SPSB基因型命名为C1型；当出现大小为331bp片段，为插入性片段，则该SPSB基因型命名为C2型。
上述技术方案中，所述的SPSB基因多态结果鉴定采用测序验证。C1型和C2型的测序图如图2和图3所示。
上述技术方案中，所述的C1型与C2型的差别在于C2型插入了一段44bp的序列，该序列如SEQIDNO.5所示。通过C1型和C2型测序序列的比对，证明C1和C2型两端序列完全一致，与甘蔗SPSB基因第一内含子序列完全相同，仅C2型序列多出一段插入性序列，如图4所示。
本发明的研究过程：
以甘蔗大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗和甘蔗细茎野生种印割1号的基因组DNA为模板，设计SPSB2177引物，引物上下游序列分别在甘蔗SPSB基因第一外显子和第二外显子上，PCR扩增甘蔗SPSB基因片段，经测序筛选出SPSB基因在第一内含子1692bp处有一插入片段，引物两端序列与SPSB基因CDS序列完全相同，针对这一插入性片段的两端设计引物SPSB2177P2，再以基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶检测，依据片段的大小分离多态性片段，将大小为287bp片段的SPSB基因型命名为C1型(未插入性片段)，将大小为331bp片段的SPSB基因型命名为C2型(插入性片段)，两段序列经琼脂糖凝胶回收、T载体连接和克隆测序，证明两段序列是SPS2177引物扩增的多态性片段序列。
所述的引物SPSB2177序列为：
上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’
下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’
SPSB2177：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸10min。
所述的引物SPSB2177P2序列为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
SPSB2177P2扩增程序：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。
经检测，甘蔗细茎野生种印割1号表现为C2缺失型
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明中所利用PCR方法是一种简单快速检测基因多态性的有效技术，尤其是在几十碱基差异以上的片段，都可从琼脂糖凝胶上检测出来，所涉及的引物特异性强，准确度高，同时克服了费用昂贵，操作繁琐和假阳性的缺点。
由于SPS基因功能涉及甘蔗蔗糖分性状，本发明提供的SPS基因多态性检测方法为甘蔗杂交后代不同基因型分离与甘蔗糖分性状关系的建立奠定了基础，以便用于甘蔗糖分性状标记的辅助选择，快速建立遗传资源优良的甘蔗高糖种质。
附图说明
图1为甘蔗属不同种SPSB基因多态性检测电泳图；
图2为C1型测序图；
图3为C2型测序图；
图4为C1与C2型序列比对图。
其中，图2和图3由于测序图较长，无法在连续表示，故分段截取后附上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明提供一种高效的甘蔗属SPSB基因C1和C2型基因多态性检测技术，包括以下步骤：
实施例1
(1)甘蔗属不同种SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测。
1、样本DNA的提取
本发明以甘蔗大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗和甘蔗细茎生种印割1号作为检测对象，以全式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DNA，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存。用紫外光光度计测定DNA样品的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。
2、引物设计
从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的部分内含子和外显子，引物设计的位点参照高粱SPSB基因组DNA序列。其引物SPSB2177序列如下：
上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’
下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’
3、PCR扩增
取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的TransTaqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表1所示。
表1
体系成分 体积(μL)
10×BufferⅠ(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
Taq HiFi聚合酶 0.5
上游引物(10μmol) 0.5
下游引物(10μmol) 0.5
GC enhance 2.5
DNA模板(40ng/μL) 1.5
ddH2O 15
总体积 25
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸10min。
扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，利用全式金公司的MarkerI作为参照，通过T-easy载体连接转化大肠杆菌DH5α后，挑取30个克隆进行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序(一般测序样品少了很难发现这一不同长度的多态性片段)，经序列比对分析，筛选出不同长度多态性片段。
(2)C1和C2型基因的分型引物设计和PCR检测
1、引物设计
由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此C1和C2基因型的引物设计在插入性片段的两侧进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩增，其设计的引物SPSB2177P2序列为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
C1型表现为287bp条带，C2型表现331bp条带，C2型插入的片段序列如SEQIDNO.5所示。
2、PCR检测
取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的EasyTaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表2所示。
表2
体系成分 体积(μL)
Buffer(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
EasyTaq DNA聚合酶 0.5
上游引物(10umol) 0.5
下游引物(10umol) 0.5
DNA模板(40ng/μL) 1.5
ddH2O 17.5
总体积 25
SPSB2177P2PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。配2.5％(w/v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μLloadingbuffer混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR结果。利用全式金公司生产的markerI作为对照，采用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相分析，根据条带大小判断各多态性条带，331bp的条带定位C2型，287bp的条带定位C1型，两个条带分别进行凝胶回收(试剂盒为北京全式金公司生产的EasypureQuickGelExtractionKit)后，经T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，将检测的阳性菌株送华大基因进行测序，结果显示所测序列是预判基因序列。
实施例2
(1)甘蔗属不同种SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测
1、样本DNA的提取
本发明以甘蔗大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila和中国种光泽竹蔗作为检测对象，以全式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DNA，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存。用紫外光光度计测定DNA样品的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。
2、引物设计
从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的部分内含子和外显子，引物设计的位点参照高粱SPSB基因组DNA序列。其引物SPSB2177序列如下：
上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’
下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’
3、PCR扩增
取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的TransTaqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表3所示。
表3
体系成分 体积(μL)
10×Buffer Ⅰ(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
Taq HiFi聚合酶 0.5
上游引物(10μmol) 0.5
下游引物(10μmol) 0.5
GC enhance 2.5
DNA模板(40ng/μL) 1.5
ddH2O 15
总体积 25
PCR反应程序为：94℃预变性4min；34个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸7min。
扩增产物经浓度为1.4％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，利用全式金公司生产的markerI作为对照，通过T-easy载体连接转化大肠杆菌DH5α，挑取30个克隆进行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序，经序列比对分析，筛选出不同长度多态性片段。
(2)C1和C2型基因的分型引物设计和PCR检测
1、引物设计
由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此C1和C2基因型的引物设计在插入性片段的两侧进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩增，其设计的引物SPSB2177P2序列为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
C1型表现为287bp条带，C2型表现331bp条带，C2型插入的片段序列如SEQIDNO.5所示。
2、PCR检测
取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的EasyTaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表4所示。
表4
体系成分 体积(μL)
Buffer(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
EasyTaq DNA聚合酶 0.5
上游引物(10umol) 0.5
下游引物(10umol) 0.5
DNA模板(40ng/μL) 1.5
ddH2O 17.5
总体积 25
SPSB2177P2PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。配2.5％(w/v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μLloadingbuffer混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR结果，条带大小选用全式金公司生产的markerI作为参照，利用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相分析，根据条带大小判断各多态性条带，331bp的条带定位C2型，287bp的条带定位C1型，两个条带分别进行凝胶回收后测序，结果显示所测序列是预判基因序列。
实施例3
(1)甘蔗细茎野生种印割1号SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测。
1、样本DNA的提取
本发明以甘蔗细茎生种印割1号作为检测对象，以全式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DNA，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存。用紫外光光度计测定DNA样品的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。
2、引物设计
从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的部分内含子和外显子，引物设计的位点参照高粱SPSB基因组DNA序列。其引物SPSB2177序列如下：
上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’
下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’
3、PCR扩增
取已稀释的DNA1μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的TransTaqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表5所示。
表5
体系成分 体积(μL)
10×Buffer Ⅰ(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
Taq HiFi聚合酶 0.5
上游引物(10μmol) 0.5
下游引物(10μmol) 0.5
GC enhance 2.5
DNA模板(40ng/μL) 1
ddH2O 15.5
总体积 25
PCR反应程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸8min。
扩增产物经浓度为1.3％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，通过T-easy载体连接转化大肠杆菌DH5α，挑取30个克隆进行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序，经序列比对分析。
(2)C1和C2型基因的分型引物设计和PCR检测
1、引物设计
由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此C1和C2基因型的引物设计在插入性片段的两侧进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩增，其设计的引物SPSB2177P2序列为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
C1型表现为287bp条带，C2型表现331bp条带，C2型插入的片段序列如SEQIDNO.5所示。
2、PCR检测
取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的EasyTaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系见表6所示。
表6
体系成分 体积(μL)
Buffer(含Mg2+) 2.5
dNTP(2.5mM) 2
EasyTaq DNA聚合酶 0.5
上游引物(10umol) 0.5
下游引物(10umol) 0.5
DNA模板(40ng/μL) 1.58 -->
ddH2O 17.5
总体积 25
SPSB2177P2PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。PCR产物在浓度为2.5％(w/v)的琼脂糖凝胶上140V电压电泳，电泳时间为30min，利用全式金公司生产的markerI作为对照，采用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相分析，根据条带大小判断各多态性条带，结果显示印割1号仅扩增出一条287bp的条带，即C1型，该条带经凝胶回收、T载体连接和转化大肠杆菌DH5α，然后送到华大公司测序，结果显示所测序列是预判的C1型基因序列。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
本发明所述的SPSB基因C1型序列和C2型序列如下，其余序列见表7。
C1型序列，SEQIDNO.6
TGACGACAATAAGGAGAAGAAGCTTTACATTGTGCTCATCAGGTCTACCCATTTGCACGTTGTTTCGTTCTATTCTTATGTAGCGCTAAAGTGCTAATAAAGAATATATATCTGGTAATGAAATGTCTCCAGCCTTAGTTTTCTTTGCTCTTTGCACATCCTAGGAGCAGAAAAAATGGCATTTCTCCCTTCAAATTTGTATAGTTTTTTAAGAAAATTCAAAAATTGTATAGTTAAATCTCCGGAGTTTCACTAGCTGTTCCTTTG
C2型序列，SEQIDNO.7
TGACGACAATAAGGAGAAGAAGCTTTACATTGTGCTCATCAGGTCTACCCATTTGCACGTTGTTTCGTTCTATTCTTATGTAGCGCTAAAGTGCTAATAAAGAATATATATCTGGTAATGAAATGTCTCCAGCCTTAGTTTTCTTTGCTCTTTGCACATCCTAGGAGCAGAAAAAATGGCACATCCTAGGAGCAGAAAAAATGTCTCCAGCCTTAGTTTCCATGTTTTCTCCCTTCAAATTTGTATAGTTTTTTAAGAAAATTCAAAAATTGTATAGTTAAATCTCCGGAGTTTCACTAGCTGTTCCTTTG
表7序列

Claims (8)

1.一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，设计一对引物SPSB2177P2扩增含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条带类型判断SPSB基因多态类型，
包括如下步骤：
步骤（1），模板的制备：提取被测样本的基因组DNA；
步骤（2），引物设计：所述的引物对SPSB2177P2为：
上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’
下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’
步骤（3），PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤（4），基因型的判断；
步骤（5），SPSB基因多态结果鉴定。
2.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的模板为甘蔗属大茎野生种51NG3、印度种Nagori、甘蔗品种ROC22、热带种Badila、中国种光泽竹蔗或甘蔗细茎野生种印割1号的DNA。
3.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为：
Buffer，含Mg2+，2.5μL
dNTP2.5mM2μL
EasyTaqDNA聚合酶0.5μL
上游引物10uM0.5μL
下游引物10uM0.5μL
DNA模板40ng/μL1.5μL
ddH2O17.5μL
总体积25μL。
4.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的扩增程序为94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。
5.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2.5%（w/v）琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μLloadingbuffer混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR结果。
6.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的基因型的判断的具体方法为：根据步骤（3）电泳检测的结果，当出现大小为287bp片段，为未插入性片段，则该SPSB基因型命名为C1型；当出现大小为331bp片段，为插入性片段，则该SPSB基因型命名为C2型。
7.根据权利要求6所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的C1型与C2型的差别在于C2型插入了一段44bp的序列，该序列如SEQIDNO.5所示。
8.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的SPSB基因多态结果鉴定采用测序验证。
CN201510060627.0A 2015-02-05 2015-02-05 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用 Expired - Fee Related CN104561364B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510060627.0A CN104561364B (zh) 2015-02-05 2015-02-05 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510060627.0A CN104561364B (zh) 2015-02-05 2015-02-05 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104561364A CN104561364A (zh) 2015-04-29
CN104561364B true CN104561364B (zh) 2016-04-13

Family

ID=53078438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510060627.0A Expired - Fee Related CN104561364B (zh) 2015-02-05 2015-02-05 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104561364B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110205329A (zh) * 2019-06-19 2019-09-06 福建农林大学 甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226446A (zh) * 2020-10-22 2021-01-15 云南省农业科学院甘蔗研究所 甘蔗spsb基因同等型1及其鉴定方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于蔗糖代谢基因多态性的甘蔗基因型遗传多样性;许莉萍等;《中国农业科学》;20110501;第44卷(第9期);1788-1797 *
甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达;黄东亮等;《南方农业学报》;20130415;第44卷(第4期);545-551 *
甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因中间缺失突变体的构建;宋喜梅等;《福建师范大学学报（自然科学版）》;20100131;第26卷(第1期);96-99 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110205329A (zh) * 2019-06-19 2019-09-06 福建农林大学 甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104561364A (zh) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103305510B (zh) 稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP及制备与应用
CN103194444B (zh) 西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记
Xie et al. Genetic maps of SSR and SRAP markers in diploid orchardgrass (Dactylis glomerata L.) using the pseudo-testcross strategy
CN103555717A (zh) 一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记及应用
CN104178573A (zh) 用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法
Qiu et al. Development of new PCR-based markers specific for chromosome arms of rye (Secale cereale L.)
CN103789419B (zh) 鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用
CN104561364B (zh) 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用
CN107630103A (zh) 一种鉴定水稻品种的caps分子标记方法及应用
CN108330208B (zh) 一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记
CN102304587A (zh) 一种快速鉴定水稻直立穗的方法
CN105255873A (zh) 黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用
CN104561365B (zh) 一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用
Ahmadikhah et al. Marker‐assisted backcrossing to develop an elite cytoplasmic male sterility line in rice
CN104774922A (zh) 小麦旗叶宽基因TaFLW1的分子标记WGRB125及其应用
CN104673790A (zh) 油茶良种长林18号的分子特异性标记引物及鉴定方法
CN102747163A (zh) 利用分子标记鉴定玉米互交种的方法
Xiujie et al. Comparison of five endogenous reference genes for specific PCR detection and quantification of rice
CN105713983B (zh) 一种与水稻江南晚穗瘟抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用
CN114410821A (zh) 鉴定苋菜叶色性状的InDel分子标记及其应用
CN109161605B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi1的SNP分子标记的开发和应用
CN105018481B (zh) 河八王的一种dna指纹图谱及其获取方法与专用引物
CN105018487A (zh) 玉米第3号染色体穗行数主效qtl的分子标记及其应用
CN106811508A (zh) 与谷子米粒颜色基因紧密连锁的分子标记SVmc3
CN103181361A (zh) 伊犁马育种方法及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160413

Termination date: 20210205