CN105018481B - 河八王的一种dna指纹图谱及其获取方法与专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物，所述获取河八王DNA指纹图谱的专用引物，包括引物对SEQ NO：1和SEQ NO：2，引物对SEQ NO：3和SEQ NO：4，引物对SEQ NO：5和SEQ NO：6。采用本发明获取河八王DNA指纹图谱的专用引物获得的河八王DNA指纹图谱的多态性高、特异性好，重复性好；谱带在100bp‑400bp之间，分布集中、均匀，特异性高，便于鉴别；构建的河八王基因组DNA指纹图谱具有唯一性，能够有效而精确的鉴别不同的河八王种质资源，将在利用河八王种质进行甘蔗遗传改良中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。
背景技术
甘蔗是我国最主要的糖料作物，蔗糖产量占全国食糖总产量的90％以上，在数十年“高贵化”育种进程中，甘蔗遗传基础变得逐渐狭窄。因此，加大力度利用甘蔗野生资源拓宽甘蔗遗传基础被认为是甘蔗育种获突破的关键途径之一。河八王[Narengaporphyrocoma(Hance)Bor]是河八王属(Narenga Bor)的一个野生种，又名草鞋密，具有耐瘦、耐旱、粗生、早熟、分蘖力强等优良性状。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选择，但有些重要性状无法在早期检测出来，分子标记技术就可以利用幼苗进行DNA多态性检测，根据与目的基因相关的标记进行选择，能提高选择的准确度，缩短育种周期，提高育种效率和选择的可靠性，相当简便。
扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。AFLP目前广泛用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究，在更高分类水平和自然植物群体间基因漂移研究上特别有用。现有技术构建作物基因组DNA指纹图谱使用的方法主要是分子标记结合聚丙烯凝胶电泳检测法，存在着谱带数偏少，需要用到较多的引物的问题，为了有效利用河八王的丰富资源，需要建立河八王的AFLP分子标记技术体系。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。
对此，本发明所采用的技术方案为：
一种获取河八王DNA指纹图谱的专用引物，由引物对Narenga 1、引物对Narenga2、引物对Narenga 3组成；
所述Narenga 1是序列表的SEQ NO：1和SEQ NO：2组成的引物对；
所述Narenga 2是序列表的SEQ NO：3和SEQ NO：4组成的引物对；
所述Narenga 3是序列表的SEQ NO：5和SEQ NO：6组成的引物对。
Narenga 1：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO：1)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAT(SEQ NO：2)
Narenga 2：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO：3)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAG(SEQ NO：4)
Narenga 3：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CAAC(SEQ NO：5)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAC(SEQ NO：6)
本发明还提供了一种获取河八王DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：
步骤S1：提取河八王的基因组DNA；
步骤S2：采用内切酶EcoR I和Mse I对所述河八王的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
步骤S3：将所述酶切产物连接上接头引物，扩增得到连接产物；所述接头引物为SEQ NO：7和SEQ NO：8，SEQ NO：9和SEQ NO：10；具体为：
E-F：5'–CTCGTAGACTGCGTACC-3'(SEQ NO：7)和E-R:5'–AATTGGTACGCAGTC-3'(SEQNO：8)；M-F：5'–GACGATGAGTCCTGAG-3'(SEQ NO：9)和M-R:5'–TACTCAGGACTCAT-3'(SEQ NO：10)
步骤S4：预扩增反应，采用预扩增引物对所述连接产物进行预扩增反应，其中，所述预扩增引物为SEQ NO：11和SEQ NO：12；
E-P:5'–GACTGCGTACCAATTCA-3'(SEQ NO：11)
M-P:5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3'(SEQ NO：12)
步骤S5：选择性扩增反应，采用权利要求1所述的引物对Narenga 1、引物对Narenga 2和引物对Narenga 3进行选择性扩增，得到AFLP扩增产物；
步骤S6：对所述AFLP扩增产物进行毛细管电泳检测扩增产物，分离DNA标记，显示河八王的DNA指纹图谱。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中，所述预扩增反应程序为预变性94℃30s，56℃30s，72℃80s，循环30次。
作为本发明的进一步改进，所述预扩增反应体系为：10ng/μl的DNA 2μl，Pre-ampmix 1μl，2.5mM dNTPs 0.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl，ddH2O 18.5μl；
作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述选择性扩增反应程序为预变性94℃变形30s，65℃退火30s，72℃延伸80s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低0.7℃梯度进行14个循环；最后以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，循环23次。
作为本发明的进一步改进，所述选择性扩增反应体系为：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 0.5μl，正向引物(10mM)1μl，反向引物(10mM)1μl，TaqDNA polymease 0.5μl，ddH2O 17.5μl。
作为本发明的进一步改进，所述河八王的基因组DNA来自河八王的任何部位。
作为本发明的进一步改进，所述河八王的基因组DNA来自河八王的叶片。
本发明还提供了一种获取河八王DNA指纹图谱的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对Narenga 1、引物对Narenga 2和引物对Narenga 3三个引物对，即SEQ NO：1和SEQ NO：2引物对、SEQ NO：3和SEQ NO：4引物对和SEQ NO：5和SEQ NO：6引物对。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
第一，采用本发明技术方案的获取河八王DNA指纹图谱的专用引物所获得的河八王DNA指纹图谱的多态性高、特异性好，重复性好；谱带在100bp～400bp之间，分布集中、均匀，便于鉴别；
第二，构建的河八王基因组DNA指纹图谱具有唯一性，能够有效而精确的鉴别不同的河八王种质资源。
AFLP标记本身是检测性灵敏的技术，本发明结合使用了毛细管电泳技术，使得结果更灵敏、精确；进一步利用3对专用引物就已能获得104条谱带，可有效构建河八王基因组DNA指纹图谱。根据概率公式1/2n可知，带型全部相同的概率为4.93×10-32，置信概率达99.99％，具有唯一性。
附图说明
图1是本发明一种实施例的引物Narenga 1对河八王广西河1的毛细管电泳结果；
图2是本发明一种实施例的引物Narenga 2对河八王广西河1的毛细管电泳结果；
图3是本发明一种实施例的引物Narenga 3对河八王广西河1的毛细管电泳结果；
图4是本发明一种实施例的利用3对AFLP专用引物构建的河八王种质资源分子身份证，图中，黑框表示谱带存在，1-15分别代表15份河八王种质资源编号；E5/M3为引物对Narenga 1，E5/M2为引物对Narenga 2：E1/M1为引物对Narenga 3。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
材料：从广西不同生态地区采集河八王无性系15份，如表1所示。同时利用GPS仪器测量采集点的海拔和经纬度，供试材料保存于广西农业科学院甘蔗研究所种质资源圃内。
表1 15份河八王种质资源的名称及来源
| 材料编号 | 名称 | 产地 | 海拔 | 纬度N | 经度E | 生境 |
| 1 | 广西河1 | 广西 | / | / | / | 不详 |
| 2 | 广西河2 | 广西Guangxi | / | / | / | 不详 |
| 3 | 灵川1 | 广西桂林灵川县五里排 | 201 | 25.36 | 110.23 | 半山荒岭 |
| 4 | 灵川2 | 广西桂林灵川县五里排 | 197 | 25.25 | 110.20 | 半山荒岭 |
| 5 | 灵川3 | 广西桂林市灵川县横岭 | 197 | 25.60 | 109.11 | 半山荒岭 |
| 6 | 灵川4 | 广西桂林灵川县横岭 | 197 | 25.70 | 109.22 | 半山荒岭 |
| 7 | 灵川5 | 广西桂林灵川县 | 176 | 25.65 | 109.18 | 荒岭 |
| 8 | 三河1 | 广西柳州融水三河村 | 118 | 25.30 | 109.22 | 山脚荒地 |
| 9 | 三河2 | 广西柳州融水三河村 | 118 | 25.20 | 109.12 | 山脚 |
| 10 | 三河3 | 广西柳州融水三河村 | 117 | 25.20 | 109.12 | 山脚 |
| 11 | 三河4 | 广西柳州融水三河村 | 140 | 25.30 | 109.12 | 山顶 |
| 12 | 三河5 | 广西柳州融水三河村 | 101 | 25.30 | 109.13 | 采石场山脚下 |
| 13 | 永福1 | 广西桂林永福 | 302 | 24.59 | 109.40 | 半山上灌丛 |
| 14 | 融安1 | 广西柳州融安县浮石 | 188 | 25.7 | 109.22 | 山坡荒地 |
| 15 | 霍家村1 | 广西柳州融水霍家村 | 375 | 25.40 | 109.27 | 山顶上灌丛 |
操作流程：提取基因组DNA—AFLP扩增—毛细管电泳—统计分析—获得DNA指纹图谱。具体方法和过程如下：
步骤S1：河八王基因组DNA提取及纯度检测：
分别取植物材料生长良好的幼嫩叶片，采用SDS方法分别提取其基因组DNA作为模板，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，放置于4℃冰箱保存备用。
步骤S2：首先利用Eco R I和Mse I限制性内切酶在37℃水浴酶切DNA，得到酶切产物；
步骤S3：将所述酶切产物连接上接头，得到连接产物；所述接头引物为SEQ NO：7和SEQ NO：8，SEQ NO：9和SEQ NO：10；
E-F:5'–CTCGTAGACTGCGTACC-3'(SEQ NO：7)
E-R:5'–AATTGGTACGCAGTC-3'(SEQ NO：8)
M-F:5'–GACGATGAGTCCTGAG-3'(SEQ NO：9)
M-R:5'–TACTCAGGACTCAT-3'(SEQ NO：10)
步骤S4：预扩增反应，采用预扩增引物对所述连接产物进行预扩增反应，其中，所述预扩增引物为SEQ NO：11和SEQ NO：12；所述预扩增反应程序为预变性94℃30s，56℃30s，72℃80s，循环30次。所述预扩增反应体系为：10ng/μl的DNA 2μl，Pre-ampmix 1μl，2.5mMdNTPs 0.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl，ddH2O 18.5μl。
E-P:5'–GACTGCGTACCAATTCA-3'(SEQ NO：11)
M-P:5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3'(SEQ NO：12)
步骤S5：选择性扩增反应，采用25对引物对分别进行选择性扩增，得到AFLP扩增产物；所述选择性扩增反应程序为预变性94℃30s，65℃退火30s，72℃延伸80s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低0.7℃梯度进行14个循环；最后以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，循环23次。所述选择性扩增反应体系为：预扩增稀释样品2μl，10×PCRbuffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 0.5μl，正向引物(10mM)1μl，反向引物(10mM)1μl，Taq DNApolymease 0.5μl，ddH2O 17.5μl。
反应在德产EPCRppendorf Master Cycle Gradient上进行。
步骤S6：对所述AFLP扩增产物进行毛细管电泳检测扩增产物，采用ABI 3730 DNA自动测序仪进行扩增产物的谱带检测。
在25对引物对中，所述引物对Narenga 1、引物对Narenga 2、引物对Narenga 3这三对引物对，具有多态性和特异性好，谱带在100bp–400bp分布较集中且均匀；结果见表2～表4和图1～图4所示。
Narenga 1：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO：1)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAT(SEQ NO：2)
Narenga 2：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO：3)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAG(SEQ NO：4)
Narenga 3：
正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CAAC(SEQ NO：5)
反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAC(SEQ NO：6)
本着“不同引物中，同一个等位基因位点，多态性较丰富的引物结果入选”的原则，从3对专用引物中筛选出104条谱带，范围在104bp～398bp，构建出河八王DNA指纹图谱，图4为利用3对引物组合构建的15份河八王种质资源特异分子身份证，根据概率公式1/2n可知，带型全部相同的概率为4.93×10-32，置信概率达99.99％，具有唯一性。
通过这基因组DNA指纹图谱可以高效地鉴别供试的河八王种质资源。
表2 利用引物Narenga 1在15份河八王上用于DNA指纹图谱构建的AFLP条带数统计表
表3 利用引物Narenga 2在15份河八王上用于DNA指纹图谱构建的AFLP条带数统计表
表4 利用引物Narenga 3在15份河八王上用于DNA指纹图谱构建的AFLP条带数统计表
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种获取河八王DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：
步骤S1：提取河八王的基因组DNA；
步骤S2：采用内切酶EcoR I和Mse I对所述河八王的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；
步骤S3：将所述酶切产物连接上接头引物进行扩增，得到连接产物；所述接头引物为SEQ NO：7和SEQ NO：8，SEQ NO：9和SEQ NO：10；
步骤S4：预扩增反应，采用预扩增引物对所述连接产物进行预扩增反应，其中，所述预扩增引物为SEQ NO：11和SEQ NO：12；
步骤S5：选择性扩增反应，采用引物对Narenga 1、引物对Narenga 2和引物对Narenga3进行选择性扩增，得到AFLP扩增产物；
所述Narenga 1是序列表的SEQ NO：1和SEQ NO：2组成的引物对；
所述Narenga 2是序列表的SEQ NO：3和SEQ NO：4组成的引物对；
所述Narenga 3是序列表的SEQ NO：5和SEQ NO：6组成的引物对；
步骤S6：对所述AFLP扩增产物进行毛细管电泳检测扩增产物，分离DNA 标记，显示河八王的DNA指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤S4中，所述预扩增反应程序为预变性94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸80 s，循环30次。
3.根据权利要求2所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述预扩增反应体系为：10 ng/µl的DNA 2µl，Pre-ampmix 1 µl，2.5 mM dNTPs 0.5 µl，10 × PCRbuffer 2.5 µl，Taq DNA polymease 0.5 µl，ddH2O 18.5 µl；
4.根据权利要求1所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤S5中，所述选择性扩增反应程序为预变性94℃ 30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低 0.7 ℃梯度进行14个循环；最后以94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸80 s，循环23次。
5.根据权利要求4所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述选择性扩增反应体系为：预扩增稀释样品2 µl，10 × PCR buffer 2.5 µl，2.5 mM dNTPs 0.5 μl，正向引物10 mM 1 µl，反向引物10 mM 1 µl，Taq DNA polymease 0.5 µl，ddH2O 17.5 µl。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述河八王的基因组DNA来自河八王的任何部位。
7.根据权利要求6所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述河八王的基因组DNA来自河八王的叶片。
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Non-Patent Citations (2)
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| AFLP技术在甘蔗品种鉴定和亲缘关系研究上的应用;李鸣;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20031215;1-50页 * |
| 利用AFLP进行"甘蔗属复合体"系统演化和亲缘关系研究;蔡青;《作物学报》;20050531;第31卷(第5期);552页右侧第3段、552页右侧第4段、553页第1段 * |
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