CN105018632A - InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用。大白菜InDel标记OR-1的检测引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明还涉及大白菜InDel标记OR-1的检测引物在桔红心大白菜品种选育中的应用。本发明首次公开了大白菜InDel标记OR-1及其引物，通过对黄心和桔红心大白菜自交系以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料的DNA进行PCR扩增，并利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现OR-1标记引物的扩增产物可明显区分黄心和桔红心大白菜，可用于桔红心大白菜新品种的选育。

Description

InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用
技术领域
本发明涉及大白菜InDel标记及其引物与应用，特别涉及InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
利用传统育种方法进行品种选育存在育种时间长、速度慢的缺点。并且，有时候由于表型不明显而使得表型鉴定难以进行。随着分子生物学的发展，为传统育种学注入了新的活力。特别是分子标记的出现使得育种工作中的选择由传统的表型选择转变为基因型选择，大大提高了选择的准确性和效率。基于PCR的分子标记如RAPD(random amplified polymorphicDNA)、SSR(Simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、InDel(insertion-deletion)等的出现，因其简便、快速和高效等特点，使分子标记的开发与利用已遍及各种作物。其中InDel标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。由于InDel标记为共显性标记，具有较好的稳定性及多态性丰富等优点已被广泛应用于多态性分析、基因的精细定位及图位克隆等。
大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis，AA基因组，2n＝20)起源于中国，是我国分布最广、种植面积最大的蔬菜作物，素有“国菜”之称。大白菜心叶颜色通常有白色、黄色和桔红色。其中桔红色是利用生物技术手段将大白菜与芜菁杂交而得到的一个新的种质资源。研究表明：桔红心大白菜的维生素C、类胡萝卜素及矿质元素含量均高于普通大白菜，并且含有普通大白菜中没有的番茄红素，营养价值远高于普通大白菜。但到目前为止，由于与桔红心性状紧密连锁标记的缺乏，桔红心大白菜品种的选育仍主要依靠传统育种方法，严重阻碍了其育种的进程。因此，开发与大白菜桔红心性状紧密连锁的分子标记，对于快速培育桔红心大白菜新品种将有重要的指导及实践意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用。
本发明技术方案如下：
大白菜InDel标记OR-1的检测引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述大白菜InDel标记OR-1的检测引物在桔红心大白菜品种选育中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
(1)提取待检测大白菜品种的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示被测样品仅有207bp一条条带时，则该被检测样品为黄心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示仅有232bp一条条带时，则该被检测样品为桔红心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示同时含有207bp和232bp条带时，则该被检测样品为黄心和桔红心杂合材料，表型上为黄心材料。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，提取待检测大白菜品种的基因组DNA采用改良的CTAB法提取。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，20μL的PCR反应体系如下：
20ng/μL模板DNA 2μL，含20mM MgCl2的10×PCR buffer 2μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，1U TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，凝胶电泳为质量百分比为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳。
有益效果
本发明首次公开了大白菜InDel标记OR-1及其引物，通过对黄心和桔红心大白菜自交系以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料的DNA进行PCR扩增，并利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现OR-1标记引物的扩增产物可明显区分黄心和桔红心大白菜，可用于桔红心大白菜新品种的选育。
附图说明
图1是大白菜InDel标记OR-1的核苷酸序列。图中划线标识区域为Indel标记OR-1；桔红心大白菜(14-490)与黄心大白菜(14-401)相比，有25bp的DNA插入；
图2是大白菜InDel标记OR-1的引物在黄心(14-401)和桔红心(14-490)大白菜以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料中的PCR扩增电泳图；
图中：泳道1：14-490(桔红心)，泳道2：14-401(黄心)，泳道3-13：14-490和14-401杂交F2代黄心群体，泳道14-21：14-490和14-401杂交F2代桔红心群体；
图3是大白菜InDel标记OR-1的引物在市场上销售的桔红心、黄心大白菜品种以及其它桔红心、黄心大白菜材料中的PCR扩增电泳图；
图中：泳道1-11(黄心)：分别是663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、寒秀、金典春王、凯春、日本夏阳，泳道12-23(桔红心)：分别是1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669、长研桔宝、申萌桔红心、神师桔红心。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
大白菜14-401、14-490、663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、1480以及14-401和14-490的杂交F2代购自山东鲁蔬种业有限责任公司；
大白菜14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669购自山东登海种业股份有限公司西由种子分公司；
大白菜品种寒秀和金典春王购自福州立信种苗有限公司，凯春购自韩国SAKATA公司，日本夏阳购自福州闽皇种业有限公司，长研桔宝购自济南元能生物科技有限公司，申萌桔红心购自山东齐鲁种业有限公司，神师桔红心购自山东青州市新世纪种苗有限公司。
实施例1.InDel标记引物的开发
以类胡萝卜素合成相关基因为候选基因，利用重测序技术对黄心(14-401)和桔红心(14-490)大白菜进行全基因组重测序。根据重测序结果对黄心和桔红心大白菜中的候选基因进行序列比对，对其中的1个InDel标记OR-1设计引物，该大白菜InDel标记OR-1的序列比对图如图1所示。图中划线标识区域为Indel标记OR-1。桔红心大白菜(14-490)与黄心大白菜(14-401)相比，有25bp的DNA插入。获得大白菜InDel标记OR-1的检测引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例2.InDel标记引物的应用
2.1植物材料与模板DNA的提取
选取大白菜F1代商品种寒秀、金典春王、凯春、日本夏阳、长研桔宝、申萌桔红心、神师桔红心和大白菜自交系14-401、14-490、663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669以及14-401和14-490的杂交F2代叶片为材料。
以改良的CTAB法提取总DNA，具体步骤如下：
1.取1-10g新鲜大白菜叶片，在液氮中快速研成粉；
2.将冻粉转入预冷的离心管中，加入等体积(w/v，g/ml)2×CTAB提取缓冲液，65℃保温20分钟；
3.加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
4.将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
5.将上层水相转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀，室温下放置30分钟；
6.12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
7.70％乙醇漂洗，12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
8.重复步骤7一次；
9.沉淀风干，加入100μl的TE缓冲液或超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
10.取2μl溶液利用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2PCR扩增
根据上述设计的大白菜InDel标记OR-1的检测引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列)，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成大白菜InDel标记OR-1的引物，溶解后稀释至10μM备用。
以上述提取的DNA为模板，分别以大白菜InDel标记的引物进行PCR扩增，制得PCR产物。
PCR反应体系(20μL)：
20ng/μL模板DNA 2μL，10×PCR buffer(含20mM的MgCl2)2μL，dNTPs(2.5mM)0.5μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，1U TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
2.3聚丙烯胺凝胶电泳分离与多态性检测
PCR产物经质量浓度为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，利用银染法显影检测。
PCR产物与上样缓冲液混匀后95℃预变性10min，取4μl点样，在Sequi-GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，在25℃、55W恒功率下电泳1h，通过银染法显影、拍照并记录结果。
图2是采用大白菜InDel标记OR-1的引物对14-490(桔红心自交系)、14-401(黄心自交系)以及14-490和14-401杂交F2群体材料的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图。
图3是采用大白菜InDel标记OR-1的引物对黄心材料(663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、寒秀、金典春王、凯春、日本夏阳)和桔红心材料(1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669、长研桔宝、申萌桔红心、神师桔红心)的PCR扩增产物进行质量浓度为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图。
由图2和图3可以看出，大白菜InDel标记OR-1的引物可对黄心和桔红心大白菜的DNA进行有效扩增，带型清晰，且在黄心和桔红心大白菜材料中具有良好的多态性，其中黄心材料扩增条带为207bp，桔红心材料扩增条带为232bp，能够很好的区分黄心和桔红心大白菜，可用于桔红心大白菜新品种选育。

Claims (7)

1.大白菜InDel标记OR-1的检测引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述大白菜InDel标记OR-1的检测引物在桔红心大白菜品种选育中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待检测大白菜品种的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示被测样品仅有207bp一条条带时，则该被检测样品为黄心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示仅有232bp一条条带时，则该被检测样品为桔红心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示同时含有207bp和232bp条带时，则该被检测样品为黄心和桔红心杂合材料，表型上为黄心材料。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，提取待检测大白菜品种的基因组DNA采用改良的CTAB法提取。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，20μL的PCR反应体系如下：
20ng/μL模板DNA 2μL，含20mM MgCl2的10×PCR buffer 2μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，1U TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，凝胶电泳为质量百分比为8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳。
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