CN109811086B

CN109811086B - 一种检测津夏3号大白菜种子纯度的引物及应用

Info

Publication number: CN109811086B
Application number: CN201910280796.3A
Authority: CN
Inventors: 华德平; 王超楠; 黄志银; 张红; 范伟强; 李梅; 张斌; 刘晓晖
Original assignee: Tianjin Kerun Agricultural Science & Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Kerun Agricultural Science & Technology Co ltd
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN109811086A

Abstract

本发明公开了一种用于检测津夏3号夏播大白菜杂交种纯度的InDel标记特异性引物，它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列。本发明进一步公开了利用InDel标记引物鉴定津夏3号大白菜杂交种种子纯度的方法。本发明提供的特异性引物及方法，可以在实验室3‑5小时完成津夏3号大白菜杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于夏播大白菜品种津夏3号的进一步推广和种子的质量控制。

Description

一种检测津夏3号大白菜种子纯度的引物及应用

技术领域

本发明涉及大白菜津夏3号夏播杂交种种子纯度鉴定的InDel分子标记引物序列及应用，属于生物技术领域。

背景技术

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）属于十字花科芸薹属作物，多年来一直是我国播种面积和产量最大的蔬菜之一。随着人们生活水平的提高，以及饮食习惯的改变，对大白菜品质的要求越来越高，同时要求大白菜能够全年供应。优良的品种是保证大白菜品质的关键，保证优良品种的种子纯度在大白菜生产中至关重要。

传统的大白菜种子纯度的鉴定方法一般采用田间直接栽培，在特定发育时期，通过性状的特异性、一致性等特点，判断种子纯度，具有周期长、用工多、易受环境影响等缺点。有些大白菜品种需根据包球后的特征判断种子纯度，经常造成种子纯度鉴定时间与种子销售旺季相冲突，导致不必要的损失。随着分子生物学技术的发展，特别是分子标记辅助育种越来越多地应用于育种实践，利用InDel（Insertion and Deletion）分子标记技术鉴定种子纯度成为一种趋势。InDel分子标记技术通过直接检测不同样品间基因组DNA序列上的差异，判断种子的纯度，可以在实验室3-5小时内完成，具有用时短、重复性高、不受环境影响等优点。

津夏3号是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的耐热结球大白菜一代杂交种，在35℃的高温下也能正常结球，适宜夏季进行反季节栽培，生长周期45~50天，该品种生长速度快，球形整齐美观，株高35 cm左右，球顶叠抱，球高27 cm左右，单株1~1.5kg，株型半直立，抗霜霉病、软腐病和病毒病。该品种之前一直采用田间种植，在包球之后，根据生长性状判断种子的纯度，种子纯度鉴定时间经常与销售周期相矛盾，急需开发一种快速、便捷的鉴定方法用于该品种的种子纯度鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测津夏3号夏播大白菜杂交种种子纯度的引物序列及应用，为实现该目的，本发明采用以下技术方案：

一对用于检测津夏3号夏播大白菜杂交种纯度的特异性引物，其特征在于它为SEQID NO:1-2所示的核苷酸序列：

CAG CTT TAC CTT GAA ACA TTT CCT CAA GTA G SEQ ID NO:1

GAG ATC TAA CTT TGC ATT GTT GTG CTT TGG SEQ ID NO:2。

本发明进一步公开了采用所述的特异性引物检测津夏3号夏播大白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取津夏3号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以特异性引物为标记引物进行PCR扩增；采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7µL。采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸 5 min。

（3）将上述PCR扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；

（4）统计上述银染的结果：同时含有父本和母本双亲材料条带的种子为杂交种，只含有母本或父本材料条带的种子为非杂交种的种子。所检测津夏3号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

本发明更进一步公开了所述的检测方法在用于快速准确鉴定津夏3号夏播大白菜种子纯度方面的应用。实验结果显示：本方法可快速、准确地鉴定津夏3号夏播大白菜的种子纯度。

本发明主要解决了津夏3号夏播大白菜种子纯度的传统田间鉴定方法，用时长、用工多、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发津夏3号父本与母本材料间具有明显多态性、稳定性好的InDel分子标记。

本发明公开的用于检测津夏3号夏播大白菜杂交种纯度的特

异性引物及应用与现有技术相比的有益效果在于：

通过本发明提供的特异性引物及方法，在实验室内3-5小时可完成大白菜津夏3号杂交种的纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于津夏3号种子高效准确的质量控制。

附图说明

图1为利用InDel引物检测津夏3号夏播杂交种46个样品纯度的电泳图；M表示DNAMarker，P₁表示父本材料，P₂表示母本材料，其余为待测的杂交种材料，其中三角所在位置表示该材料为非杂交种的种子，其余都为杂交种材料。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料K130、母本材料K80可以向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜研究室索取，津夏3号杂交种有市售。

实施例1

一、纯度鉴定InDel标记引物的筛选

根据大白菜基因组重测序数据，设计多对引物，对津夏3号、父本、母本进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对A04-16，序列如下：

F: 5’- CAG CTT TAC CTT GAA ACA TTT CCT CAA GTA G-3’ (SEQ ID NO:1)

R: 5’-GAG ATC TAA CTT TGC ATT GTT GTG CTT TGG-3’ (SEQ ID NO:2)

该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可产生155 bp的特异性条带，在母本材料中能够产生188 bp的特异性条带，在津夏3号中可同时扩增出188 bp和155 bp的特异性条带。

二、津夏3号夏播种子纯度鉴定

1. 待测样品基因组DNA的提取：材料为父本、母本材料及来源于制种基地5户签约农户生产的津夏3号杂交种。在田间正常播种上述材料，正常管理，取母本材料、父本材料及津夏3号杂交种待测样品新鲜的叶片并编号，利用CTAB法提取的基因组DNA，具体步骤如下：取幼嫩叶片0.2 g入1.5 mL离心管中，加50 μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400 μL，65℃水浴30 min；加入400 μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5 min。12000 rpm离心5 min；取上清200 μL，加入预冷的异丙醇200 μL混匀，-20℃放置20 min；12000 rpm离心10 min；弃上清，加入150 μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000 rpm离心5 min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100 μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50 ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。

2.PCR扩增：以上述待测样品的基因组DNA为模板，以本发明提供的InDel标记引物为特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物。采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCRBuffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL。采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min。

3.扩增结果的电泳分离与染色：利用8%的非变性聚丙型酰胺凝胶电泳对上述PCR产物进行电泳分离，利用银染显色，统计电泳条带的大小。

4. 结果分析与统计：待测样品PCR扩增产物的电泳条带同时含有父本155 bp和母本材料188 bp扩增产物的条带，为津夏3号杂交种的种子；只含有父本或母本材料扩增产物的条带，为非杂交种的种子，如图1所示。津夏3号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

经统计，来源于制种基地5户签约农户的津夏3号杂交种的种子纯度如表1所示：表1 津夏3号夏播杂交种制种基地5户农户的种子纯度鉴定结果

其中签约农户1生产的津夏3号种子纯度为96.7%，签约农户2生产的津夏3号种子纯度为100%，签约农户3生产的津夏3号种子纯度为98.9%，签约农户4生产的津夏3号种子纯度为97.8%，签约农户5生产的津夏3号种子纯度为100%。

实施例2

传统的田间鉴定方法比较试验：将制种基地5户签约农户生产的津夏3号商品种待检测样品，每户随机取种，穴盘育苗单粒播种，待生长到5叶1心时期，定制到田间，密度控制在行距约40 cm，株距约 35 cm，大约35天后，当结球率达到90%时，根据待检测样品的叶色、叶形、株高和包球等表现性状是否符合津夏3号商品种的统一性和一致性，判断是否为津夏3号商品种，统计种子的纯度；

结论：通过InDel分子标记鉴定结果与传统的田间鉴定结果比较，发现利用本发明提供的InDel分子标记对津夏3号杂交种纯度的鉴定结果与田间传统鉴定方法的结果一致，同时该发明具有快速、准确、不受环境影响等优点，可以用于鉴定津夏3号大白菜商品种的种子纯度。

熟悉本技术领域的技术人员应当理解，上述具体实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所做的等效的修饰以及改变，都应该涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科润农业科技股份有限公司

<120> 一种检测津夏3号大白菜种子纯度的引物及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagctttacc ttgaaacatt tcctcaagta g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagatctaac tttgcattgt tgtgctttgg 30

Claims

1.一种采用特异性引物检测津夏3号夏播大白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取津夏3号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以特异性引物为标记引物进行PCR扩增；所述特异性引物的序列为：

CAG CTT TAC CTT GAA ACA TTT CCT CAA GTA G 和

GAG ATC TAA CTT TGC ATT GTT GTG CTT TGG

采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL；采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min；

（3）将上述PCR扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；待测样品PCR扩增产物的电泳条带同时含有父本155 bp和母本材料188 bp扩增产物的条带，为津夏3号杂交种的种子；

（4）统计上述银染的结果：所检测津夏3号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

2.权利要求1所述的检测方法在用于快速准确鉴定津夏3号夏播大白菜种子纯度方面的应用。