KR102066593B1 - 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 - Google Patents

참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'(Lilium lancifolium 'Orange Beauty') 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것으로, 참나리 신품종 오렌지 뷰티는 다른 참나리와 달리 꽃잎에 검은 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색을 띠는 특징을 가진 품종이다.

Description

참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 및 이를 판별하기 위한 분자마커{Orange Beauty, new cultivar of Lilium lancifolium and molecular marker for discriminating the same}
본 발명은 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것이다.
참나리(Lilium lancifolium)는 백합과 나리속에 속하는 여러해살이풀이다. 줄기의 높이는 1~2 m 정도이고 어린가지에는 흰색의 잔털이 나 있으며, 잎은 피침형으로 잎자루를 가지지 않고 어긋나있다. 꽃은 7~8월경에 피고, 주황색 계열의 바탕에 적갈색 반점이 중심쪽에 분포되어 있으며 꽃잎이 뒤로 말려있다. 꽃에는 짧은 잔털들이 있고 6개의 수술과 1개의 암술이 꽃 밖으로 길게 나와있다. 열매를 맺지 못하고 잎의 밑 부분에 있는 주아(珠芽)가 땅에 떨어져 발아한다. 한방에서 비늘줄기(bulb)를 약재로 쓰는데, 진해·강장 효과가 있고 백혈구 감소증에 효과가 있으며 진정 및 항알레르기 작용이 있다. 참나리는 우리나라에서 흔하게 볼 수 있으며, 일본, 중국, 사할린 등지에 분포한다. 생육환경은 크게 까다롭지 않아 관상용으로 재배하기도 하고 산과 들에서 흔히 자라지만, 기후가 습하고 한량하거나 반음지인 곳에서 더 잘 자란다.
한편, 최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능하게 되었다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 이용가치가 증가되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1563351호에는 '알로에 신품종 생장 및 이를 판별하기 위한 분자마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1801019호에는 '60s 리보좀 유전자 기반 잎마름병 저항성 백합 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 참나리의 자연교잡종을 유도하고 주아를 획득해 유성번식을 통해 계통 육성한 참나리가 일반 참나리와 달리 꽃잎에 검은색 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 형태적 특성을 가지고 있음을 확인하고, 이를 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'로 명명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18687P이며, 꽃잎에 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'(Lilium lancifolium 'Orange Beauty') 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18687P인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 기탁번호가 KCTC18687P인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'는 일반 참나리와 달리 꽃잎에 검은색 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 특징이 있으며, 본 발명에 사용된 프라이머 세트는 형태적 차이에 따른 품종 판별, 순도 검정 또는 품종보호에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 출원품종과 대조품종(참나리)의 꽃을 비교한 사진이다.
도 2는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 줄기 및 주아를 비교한 사진이다.
도 3은 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽록체 게놈 염기서열을 분석하여 InDel(A) 및 SNP(B) 다형성이 나타난 부위를 나타낸 모식도이다.
도 4는 분자마커를 이용한 참나리와 오렌지 뷰티의 PCR 결과로, A는 InDel(Insert/Deletion) 분자마커, B는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 분자마커를 의미한다. 각 마커별 레인 순서는 Li_i_01 및 Li_d_01과 같다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18687P이며, 꽃잎에 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'(Lilium lancifolium 'Orange Beauty') 식물체를 제공한다.
본 발명의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'는 표 1 내지 표 6, 도 1 및 도 2에 기재된 것과 같은 형태학적 특징을 가지며, 일반 참나리 식물체와 비교하여 꽃잎에 검은색 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 모두 녹색인 식물체이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'는 종자 번식이 가능한 울릉도 자생 참나리 주아를 채집하여 한택식물원(용인)의 내륙에서 자라는 참나리 포지 옆에 식재한 후, 식재한 울릉도 자생 참나리 개체에서 열매가 맺혀 채종하고 종자번식을 통해 발아하여 나온 개체를 육묘포지에 이식하고 재배 중이던 참나리 개체들 중에서 줄기 및 주아의 색이 녹색인 개체를 선발한 후 상기 줄기색이 녹색인 참나리 개체들 중에서 개화시 꽃잎에 검은 반점이 없는 꽃이 피는 개체를 선발하여, 상기 개체의 주아를 획득해 영양번식하여 계통 육성하였다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC18687P이며, 꽃잎에 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체의 '부분체'는 이에 한정하지 않으나, 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'의 화분, 주아, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 자손 식물체는 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'의 무성생식을 통해 유래된 자손 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18687P인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이서 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 InDel(Insert/Deletion) 변이지역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 SNP(single nucleotide polymorphism)에 기반한 dCAPS 마커용 프라이머 세트이다(표 7).
본 명세서에서, 용어 'dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)' 마커는 SNP 중 제한효소 자리에 위치한 SNP를 일컫는다. 본 발명의 dCAPS 마커는 엽록체 게놈 염기서열에 존재하는 참나리와 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 간의 특이적인 SNP 중 제한효소(AluI, PstI)자리에 위치한 SNP를 선정하여 후보 dCAPS 마커로 개발할 수 있다.
상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1, 3, 5, 7 및 9로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10으로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별용 프라이머 세트는 상기 5개의 프라이머 세트 중, 1개의 프라이머 세트, 2개의 프라이머 세트 조합, 3개의 프라이머 세트 조합, 4개의 프라이머 세트 조합 및 5개의 프라이머 세트의 조합이 가능하며, 상기 5개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별이 보다 정확하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18687P인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 참나리 신품종 오렌지 뷰티의 판별 방법은 구체적으로는, 참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 참나리 신품종 오렌지 뷰티의 또 다른 판별 방법은 구체적으로는, 참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 판별 방법에 있어서, 상기 제한효소는 AluI, PstI 제한효소일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물에는 AluI 제한효소, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물에는 PstI 제한효소를 처리하여 증폭 산물을 절단할 수 있다.
본 발명의 방법은 참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 참나리 신품종 오렌지 뷰티의 육성과정 및 수집
기존 내륙에서 번식하고 있는 참나리는 개화 후 수정이 이루어지고 있고, 열매가 맺히기는 하지만 거의 대부분이 쭉정이인 경우가 많아 종자 번식이 어려워 참나리 번식에는 주아를 이용한 영양번식법이 이용되고 있다. 그러나 울릉도에서 자생하는 참나리는 종자 번식이 가능하여, 신품종 육성을 위해 1986년 울릉도에서 참나리 주아를 채집하여 한택식물원(용인)의 내륙에서 자라는 참나리 포지 옆에 식재하였다.
2002년 상기 울릉도에서 채집하여 식재한 참나리 개체에서 열매가 맺혀 채종하여 바로 종자번식 하였으며, 2003년 발아하여 나온 개체를 육묘포지에 이식하여 재배 관리하였다. 2005년 육묘포지에서 재배 중이던 참나리 개체들 중에서 줄기 및 주아의 색이 녹색인 개체를 선발하여 따로 관리하였으며 2006년 상기 줄기색이 녹색인 참나리 개체들 중에서 개화시 꽃잎에 검은 반점이 없는 꽃이 피는 개체를 선발하였다. 선발한 품종은 검은 반점이 없는 꽃이 피고 열매는 맺히지만 종자로 번식이 안되는 개체로, 주아를 채집하고 지속적으로 영양번식하여 개체수를 늘렸다.
본 품종은 꽃잎에 검은 반점이 있고 줄기 및 주아의 색이 검은색 자주빛인 기존의 참나리 품종과는 달리, 꽃잎에 검은색 반점이 없고 줄기와 주아의 색이 녹색을 띠는 품종이다.
본 발명의 참나리 신품종을 '오렌지 뷰티'로 명명하고, 캘러스를 유기하여 2018년 06월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18687P로 기탁하였다.
실시예 2. 참나리 신품종 오렌지 뷰티의 형태적 변이 분석
상기 실시예 1에서 선별된 신품종 오렌지 뷰티와 대조품종인 참나리의 형태적인 특성을 실험 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 1 내지 표 6 및 도 1과 도 2에 나타내었다.
Figure 112019020353861-pat00001
Figure 112019020353861-pat00002
Figure 112019020353861-pat00003
Figure 112019020353861-pat00004
Figure 112019020353861-pat00005
Figure 112019020353861-pat00006
실시예 3. 참나리 신품종 오렌지 뷰티의 판별을 위한 분자마커 개발
3-1. DNA 추출
신품종 오렌지 뷰티와 참나리의 잎은 한택식물원 내 식물체로부터 채취하였으며, 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.
건조한 시료 0.2 g을 막사 사발에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하고 2 ㎖ 뷰트에 옮겨 담았다. 1.2 ㎖의 추출버퍼(1.4 M NaCl, 100 mM Tris(pH 8.0), 20 mM EDTA(pH 8.0), 2% CTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide), 0.2% β-mercaptoethanol)를 튜브에 첨가하고 5초간 볼텍싱하였다. 65℃ 항온기에서 30~60분 반응시키고(10분에 한번씩 섞어줌), 13,500xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 800 ㎕의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol(25:24:1)을 넣고 상온에서 20분간 인버팅(inverting) 한 후 13,500xg로 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 -20℃에 보관했던 아이소프로판올(isopropanol) 800 ㎕를 넣고 5분간 인버팅하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛만 남긴다. 200~250 ㎕의 TE 버퍼를 넣어 펠렛을 녹이고, 2.5 ㎕ RNase(10 mg/㎖)를 넣어 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 3M NaOAc 25 ㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 600 ㎕의 차가운(-20℃) 100% 에탄올을 튜브에 넣고 잘 섞은 후 -20℃에서 20분간 반응시킨다. 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 차가운(-20℃) 70% 에탄올 500 ㎕를 넣는다. 탭핑 또는 1~2초의 볼텍싱으로 펠렛을 튜브 벽에서 분리시고, 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음, DNA 펠렛을 적어도 1시간 이상 건조시켰다. 건조된 DNA를 20~30 ㎕의 TE 버퍼에 완전히 녹인다.
3-2. 염기서열 분석 및 엽록체 게놈 서열 조립
추출된 약 2 ㎍의 게놈 DNA는 랩지노믹스(www.labgenomics.co.kr)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 500 bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었다. 시퀀싱은 일루미나사의 MiSeq 플래폼을 이용하여 진행하였다.
차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage(엽록체 게놈 크기의 300~400X)에 해당하며, 엽록체 게놈은 이 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(한국등록특허 제1447593호)을 통해 완성하였다. 본 분석의 경우 4.9~5.4 Gbp에 해당하는 원시데이터를 이용하여 엽록체 게놈을 완성하였다.
완성한 엽록체 유전체의 크기는 신품종 오렌지 뷰티가 152,581 bp, 참나리가 152,571 bp였다.
완전한 엽록체 게놈을 조립한 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.
3-3. 염기서열 비교 분석을 통한 종내 InDel 및 SNP 변이지역 발굴
완성된 신품종 오렌지 뷰티 및 참나리의 엽록체 게놈의 염기서열을 MAFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) 프로그램을 통하여 비교 분석하였다. 엽록체 게놈 서열의 종간 변이지역은 21개의 삽입/결실(insertion/deletion, InDel) 및 25개의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)이 확인되었으며, 이 중 InDel 다형성이 나타난 3개 부위(도 3A)와 SNP 다형성이 나타난 2개 부위(도 3B)를 이용하여 식별 마커를 개발하였다.
InDel 및 SNP 변이지역 분석을 통하여 개발된 식별 마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 7). SNP 변이지역을 기반으로 한 2개의 마커는 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence) 마커로 개발하였으며, 각각 AluI, PstI 제한효소로 PCR 산물을 절단하였다(도 3 참고). 하기 표 7의 dCAPS 프라이머 서열에는 AluI, PstI 제한효소의 서열이 일부 나타나있지 않으나 각 마커의 PCR 산물에는 제한효소가 포함되어 있다.
신품종 오렌지 뷰티와 참나리 판별용 분자마커 및 프라이머 정보
마커명 종류 위치 프라이머 서열(5'→3') (서열번호) 산물크기(bp)
(참나리/오렌지뷰티)
Li_i_01 InDel ycf3 ~ ycf3 F: AGGTAACTATCTCGGTTTCATCTCA (1)
R: AGCACCGTAAAGATCAATTAGCA (2)		 242/249
Li_i_02 InDel ycf4 ~ petA F: AAATCCACGAATGCAGCAGA (3)
R: GATTGCCGGGTATTCCACCA (4)		 195/175
Li_i_03 InDel rps8 ~ rpl14 F: ATCCTTACCCATGGCGAACT (5)
R: AGCGAGGTATCTGGAATGGG (6)		 171/177
Li_d_01 dCAPS psaA F: CACTTGGATCTGGAACCTACAAGC (7)
R: CAAAAAGCATTAATGATGCAAA (8)		 389/365
Li_d_02 dCAPS psbL F: ATTCTCCTTCTTTCTCTCAACTGCA (9)
R: GAATATTTCACAGAGAGCCGAC (10)		 358/383
3-4. 중합효소연쇄반응( PCR )
PCR 반응은 총 볼륨을 25 ㎕로 하였고, 20 ng의 주형 DNA 2 ㎕, 각 10 mM의 dNTPs 0.5 ㎕, 각 10 pmole의 프라이머 1 ㎕, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 0.25 ㎕, 10X Taq 반응완충용액 2.5 ㎕, 멸균수를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 2.5% 아가로스 겔 전기영동에서 확인하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이 InDel 및 SNP 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 총 5개의 분자마커를 통해 본 발명의 신품종 오렌지 뷰티와 참나리가 판별되는 것으로 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC18687P 20180615
<110> HANTAEK BOTANICAL GARDEN FOUNDATION <120> Orange Beauty, new cultivar of Lilium lancifolium and molecular marker for discriminating the same <130> PN19013 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggtaactat ctcggtttca tctca 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agcaccgtaa agatcaatta gca 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaatccacga atgcagcaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gattgccggg tattccacca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atccttaccc atggcgaact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agcgaggtat ctggaatggg 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cacttggatc tggaacctac aagc 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caaaaagcat taatgatgca aa 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 attctccttc tttctctcaa ctgca 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaatatttca cagagagccg ac 22

Claims (6)

  1. 꽃잎에 반점이 없고 줄기 및 주아의 색이 녹색인 참나리 신품종 '오렌지 뷰티'(Lilium lancifolium 'Orange Beauty') 식물체로서,
    상기 식물체로부터 유기된 캘러스가 기탁번호 KCTC18687P로 기탁된 것인 식물체.
  2. 제1항의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 부분체.
  3. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 참나리로부터 제1항의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참나리로부터 제1항의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  5. 참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 참나리로부터 제1항의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별방법.
  6. 참나리 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
    상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는, 참나리로부터 제1항의 참나리 신품종 '오렌지 뷰티' 식물체의 판별방법.
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