CN109811085B

CN109811085B - 一种鉴定秋播大白菜珍绿6号种子纯度的引物及应用

Info

Publication number: CN109811085B
Application number: CN201910280784.0A
Authority: CN
Inventors: 张斌; 刘晓晖; 王超楠; 华德平; 黄志银; 李梅; 张红; 范伟强
Original assignee: Tianjin Kerun Agricultural Science & Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Kerun Agricultural Science & Technology Co ltd
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN109811085A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定珍绿6号秋播大白菜种子纯度的SSR标记引物，它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列。本发明进一步公开了利用SSR标记引物鉴定珍绿6号秋播大白菜杂交种纯度的方法。本发明提供的特异性引物及方法，可以在实验室3‑5小时完成珍绿6号大白菜杂交种纯度的纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于珍绿6号秋播大白菜种子的质量控制和该品种的进一步推广。

Description

一种鉴定秋播大白菜珍绿6号种子纯度的引物及应用

技术领域

本发明涉及大白菜珍绿6号杂交种种子纯度鉴定SSR分子标记的引物序列及应用，属于生物技术领域。

背景技术

大白菜（Brassica rapa L. ssp pekinensis）属于十字花科芸薹属，是我国最重要的蔬菜之一，长期以来在居民的菜篮子中占重要地位。种子纯度是确保优质大白菜品种能够高产稳产、保证品质的首要因素，传统的大白菜种子纯度鉴定方法一般采用田间直接鉴定的方式，通过在田间种植大白菜，待生长到一定的发育阶段，根据其生长特性判断种子纯度，具有周期长、受环境影响大，用工多等缺点，经常影响种子的正常销售。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种技术越来越多的应用于作物育种的全过程。筛选具有多态性的SSR分子标记，通过PCR扩增，在实验室内即可鉴定大白菜商品种的种子纯度，具有用时短、不受环境影响等优点，可广泛用于种子的纯度鉴定。

珍绿6号是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的中熟直筒叠抱型大白菜品种，株高约52 cm，球高约40 cm，外叶深绿色亮泽且多皱无茸毛，心叶黄色，球形周正美观。生育期70~80天，适收期较长，中心柱偏圆，耐贮性好，是一个推广面积较广的秋播大白菜品种。前期珍绿6号种子纯度的鉴定，采用直接在田间种植、观察性状的传统方式进行，周期长、易受环境影响，经常影响种子的正常销售，开发一种可以快速、稳定鉴定种子纯度的方法，有利于珍绿6号大白菜种子的销售及进一步的推广工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测珍绿6号大白菜杂交种种子纯度的SSR标记的引物序列及应用，为实现该目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测珍绿6号大白菜杂交种种子纯度的SSR标记的引物序列，其特征在于它为SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列：

ACG TTA AGT TCA GGA ACT ATG CAG AGG SEQ ID NO:1

AAC TCT TGA CGA TGG GTT CAG TTG G SEQ ID NO:2。

本发明进一步公开了采用所述的特异性引物检测检测珍绿6号大白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取珍绿6号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7µL。采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸 5 min。

（3）将上述PCR扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；

（4）统计上述银染的结果：同时含有父本和母本双亲材料条带的种子为杂交种，只含有母本或父本材料条带的种子为非杂交种的种子。所检测珍绿6号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

本发明更进一步公开了所述的检测方法在用于快速准确鉴定测珍绿6号大白菜种子纯度方面的应用。实验结果显示：本发明可以快速、准确地鉴定珍绿6号大白菜的种子纯度。

本发明主要解决了珍绿6号种子纯度传统鉴定方法用时长、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发珍绿6号父本与母本间具有多态性、重复性好、易区分的SSR分子标记。

本发明公开的鉴定珍绿6号大白菜种子纯度的SSR标记引物及应用与现有技术相比的有益效果在于：

通过本发明提供的特异性引物及方法，可以在实验室内3-5小时完成珍绿6号杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于珍绿6号商品种种子高效准确的质量控制及该品种的进一步推广。

附图说明

图1为利用SSR引物检测珍绿6号杂交种46个样品纯度的电泳图；M表示DNAMarker，P₁表示父本材料，P₂表示母本材料，其余为待测的杂交种材料。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料B50、母本材料W174可向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜研究室索取，珍绿6号杂交种有市售。

实施例1

一、纯度鉴定SSR引物的筛选

根据大白菜基因组重测序数据，设计若干对引物，对珍绿6号、父本、母本进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对A06-17，序列如下：

F: 5’-ACG TTA AGT TCA GGA ACT ATG CAG AGG-3’ (SEQ ID NO:1)

R: 5’-AAC TCT TGA CGA TGG GTT CAG TTG G-3’ (SEQ ID NO:2)

该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可扩增产生145 bp的特异性条带，在母本材料中能扩增产生122 bp的特异性条带，珍绿6号杂交种材料中可同时扩增出145 bp和122 bp的特异性条带。

二、珍绿6号种子纯度鉴定

1. 待测样品基因组DNA的提取：材料为父本、母本材料及来源于制种基地6户签约农户生产的珍绿6号杂交种。在田间播种上述材料，正常管理，待生长到一定阶段，利用CTAB法提取母本材料、父本材料及珍绿6号杂交种待测样品的基因组DNA，具体步骤如下：取幼嫩叶片0.2 g入1.5 mL离心管中，加50 μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400 μL，65℃水浴30 min；加入400 μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5 min。12000 rpm离心5 min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200 μL混匀，-20℃放置20 min；12000 rpm离心10 min；弃上清，加入150 μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000 rpm离心5 min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50 ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。

2. PCR扩增：以上述待测样品的基因组DNA为模板，以本发明提供的SSR引物为特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物。采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCRBuffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL。采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min。

3. 扩增结果的电泳分离与染色：利用8%的非变性聚丙型酰胺凝胶电泳对上述PCR产物进行电泳分离，利用银染显色，统计电泳条带的大小。

4. 结果分析与统计：待测样品PCR扩增产物的电泳条带同时含有父本材料145 bp扩增产物的条带和母本材料122 bp扩增产物的条带，为珍绿6号杂交种的种子；只含有父本或母本材料扩增产物的条带，为非杂交种的种子。经统计，来源于制种基地6户签约农户的珍绿6号杂交种的种子纯度如表1所示：

表1 珍绿6号6农户生产的种子纯度鉴定结果统计

其中1号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为100%，2号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为98.9%，3号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为98.9%，4号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为100%，5号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为100%，6号签约农户生产的珍绿6号的种子纯度为97.8%。

实施例2

田间传统鉴定方法比较试验：将制种基地6户签约农户生产的珍绿6号商品种待检测样品，每户随机取种约100粒，穴盘育苗单粒播种，一个批次播种约300株，待生长到5叶1心时期，定植到田间，密度控制在行距约40 cm，株距约 35 cm，大约50天左右，当结球率达到90%时，根据待检测样品的叶色、叶形、株高和包球等表现性状是否符合珍绿6号商品种的统一性和一致性，判断是否为珍绿6号商品种，统计种子的纯度；

结论：利用本发明鉴定珍绿6号大白菜种子纯度的结果，和通过传统的田间鉴定种子纯度的结果一致，同时该发明具有快速、不受环境影响等优点，说明本发明可以替代传统的田间鉴定方法，用于鉴定珍绿6号大白菜商品种的种子纯度。

熟悉本技术领域的技术人员应当理解，上述具体实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所做的等效的修饰以及改变，都应该涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科润农业科技股份有限公司

<120> 一种鉴定秋播大白菜珍绿6号种子纯度的引物及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttaagtt caggaactat gcagagg 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactcttgac gatgggttca gttgg 25

Claims

1.一种采用SSR标记引物检测珍绿6号秋播大白菜种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取珍绿6号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；所述SSR标记引物序列为：

ACG TTA AGT TCA GGA ACT ATG CAG AGG 和

AAC TCT TGA CGA TGG GTT CAG TTG G

采用的反应体系为：10 µL体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL；

采用的扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min；

（3）将上述PCR扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；待测样品PCR扩增产物的电泳条带同时含有父本材料145 bp扩增产物的条带和母本材料122 bp扩增产物的条带，为珍绿6号杂交种的种子；

（4）统计上述银染的结果：所检测珍绿6号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

2.权利要求1所述的检测方法在用于快速鉴定珍绿6号秋播大白菜种子纯度方面的应用。