CN107201404B - 一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用 - Google Patents

一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用，该技术方案基于芦笋Y染色体上雌性抑制基因SOFF的CDS序列，开发了4个该基因的功能性STS分子标记。在此基础上，针对4个STS分子标记的自身特点设计了相应的引物和通用的PCR扩增条件，并进一步明确了指向雄性植株的特征条带碱基长度。实验验证发现，本发明提供的4种分子标记均位于芦笋雌性抑制基因SOFF的编码区，在分子遗传上与雌、雄性别表型共分离，鉴别准确率达到100％，可广泛用于芦笋雌雄性别鉴定以及全雄或全雌品种分子标记辅助选择。此外，实验发现该方法亦可用于兴安天门冬(A.dauricus)、长花天门冬(A.longiflorus)、A.maritumus等天门冬属雌雄异株植物的性别鉴定。

Description

一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法 及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子遗传学技术领域，进一步涉及基于分子标记的植物性别鉴别技术，具体涉及一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用。
背景技术
天门冬属(Asparagus)植物约300种，除美洲外，全世界温带至热带地区都有分布；我国有24种和一些外来栽培种，广布于全国各地，除供观赏外，部分种具有食用或药用价值，因此属于农业种植或园艺栽培的植物范畴。其中，芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生草本植物，其幼茎质嫩味美，营养丰富，风味独特，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，畅销全球，经济价值高，被誉为“蔬菜之王”。
由于天门冬属雌雄异株植物的雌株与雄株之间区别明显，对营养的需求和培养条件也存在一定的差异，因此作为经济作物栽培时可能需要对单一性别的植株进行规模化种植，在这种情况下对天门冬属雌雄异株植物性别的鉴定就显得尤为重要。以芦笋为例，它雌、雄异株，雄株因不结果实消耗养分少，产量比同期生长条件相同的雌株高出25％以上，且寿命长，抗性强，因此，由全部雄株组成的全雄品种目前占全球芦笋种子市场主导地位(陈光宇，2005；Riccardi et al.,2011)。与此同时，芦笋雌性植株高大，嫩茎较雄株粗壮，品质更优；芦笋是虫媒授粉，近年来随着我国南方芦笋设施避雨栽培和防虫网的广泛应用，大棚芦笋基本上可做到不结果实，额外消耗养分少，可充分发挥雌株优势，产量更高，品质佳，为此，申请者提出了“全雌栽培”和“全雌育种”概念和设想。芦笋除了花、果实等繁殖器官外，芦笋雄株和雌株在外部形态上没有显著区别，且它从播种到开花大约需要2年时间，故早期难以直接区分雌、雄株。若利用与芦笋性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记进行辅助选择，在苗期就能够快速准确区分雌、雄株，将雄株挑选出来集中进行全雄种植，余下雌株集中起来进行全雌种植，同时也有助于芦笋父母本选择、杂交制种，以及两性株全雄育种。
前人研究表明，芦笋属于XY型性别决定，其性别是由性染色体上一对等位基因控制，决定雄性的基因相对于决定雌性的基因为显性，雄性为Mm，雌性为mm(Bracale et al.,1991)。寻找和定位与芦笋性别决定基因连锁的遗传标记，国内外先后有许多研究报道，包括形态标记和生化标记(Maestri et al.,1991)和DNA分子标记(Jiang andSink,1997；Jiang et al.,1997；Reamon-Büttner etal.,1998；Reamon-Büttner and Jung,2000；Jamsari et al.,2004；Nakayama et al.，2006；Gebler et al.，2007；Kazuna et al，2011；Shiobara et al，2011；Ii et al.，2012)。最近Kanno等(2014)将芦笋一个雄性特异RAPD标记T35R54-1600成功转化为一个STS标记MSSTS710，能够鉴定8个芦笋品种雌、雄性别。国内李书粉等(2014)通过AFLP扩增筛选获得与芦笋雄性连锁的AFLP和SCAR标记。Patricia等(2014)利用雄性连锁标记Asp1-T7和EST-SSR背景选择标记成功从西班牙本土‘Morado de Huétor’两性株后代群体中筛选到四倍体超雄株。显然，前人开发的这些DNA分子标记都不在性别决定基因内部，均不是与性别表型共分离的功能性标记，检测结果存在一定假阳性和误差，且受试验群体限制，不具有通用性。因此，很必要开发与芦笋性别表型共分离的功能性DNA分子标记。除了芦笋，天门属其他雌雄异株植株尚未见性别鉴定DNA分子标记开发研究报道。
2010年12月份江西省农科院发起主持由中国、美国、意大利、荷兰等国家参与的芦笋基因组计划国际合作项目《芦笋基因组测序分析》，历时6年研究，成功完成世界上首张芦笋全基因组框架图谱，研究结果即将正式公布，相关数据已释放，可在NCBI参考基因组数据库中查询(Accessions：PRJNA317340、PRJNA259909、PRJNA326431)，这为芦笋遗传学研究、尤其是分子水平上的品种改良奠定了坚实的基础。在此基础上，如果能在DNA层面确定一种区分芦笋雌株、雄株的基因片段，则有可能实现对芦笋性别的精准鉴定。然而，在庞大的基因组中获取决定个体性别的分子标记本身就很困难，再加之某些分子标记虽然与个体性别有关，但往往不独立的决定个体性别、而是与其他基因或环境条件协同发挥作用，因此能与性别特征具有稳定对应关系的分子标记在现有技术中仍未获得。此外，在芦笋性别的分子水平鉴定中，除了分子标记自身的性能之外，引物设计、PCR扩增条件、扩增结果的稳定性及检测精度等都影响着鉴别方法的应用效果。另一方面，如果能以芦笋DNA为基础，根据天门冬属植物基因同源性较高的特点开发一种鉴别雌、雄植株的通用性分子标记及相应的鉴别方法，则有望扩展该方法的适用范围。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，以解决现有技术中天门冬属雌雄异株植物性别鉴定不准确的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是解决现有技术中除了芦笋外，其他天门冬属雌雄异株植物无性别分子生物学鉴别方法的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中芦笋的性别鉴定不准确。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中基于分子标记的芦笋性别鉴别方法，因分子标记与个体性别之间不具有精准对应关系从而导致检测准确性较低。
本发明要解决的又一技术问题是当采用本发明所披露的分子标记执行芦笋性别鉴定时，缺乏一种高效的PCR引物及PCR扩增条件。
本发明要解决的又一技术问题是当明确使用上述分子标记、PCR引物及PCR扩增条件的基础上，如何建立一套实际操作方法，从而实现对芦笋雌株、雄株快捷、准确的鉴定。
本发明要解决的又一技术问题是如何利用本发明所提供的芦笋雌、雄株鉴别方法在农业种植中实现单一性别芦笋的规模化栽培。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，包括以下步骤：
1)取待测的天门冬属雌雄异株植物材料，提取单株总DNA；
2)以其为模板、利用分子标记的引物执行PCR扩增；
3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；
4)观察电泳结果中是否存在上述分子标记的特征条带。
作为优选，所述天门冬属雌雄异株植物是芦笋、兴安天门冬、长花天门冬、A.maritumus。
作为优选，所述分子标记位于芦笋雌性抑制基因SOFF的编码区。
作为优选，所述分子标记Soff1的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为516bp的条带，序列如SEQ ID NO9。
作为优选，所述分子标记Soff2的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为777bp的条带，序列如SEQ ID NO10。
作为优选，所述分子标记Soff4的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为542bp的条带，序列如SEQ ID NO11。
作为优选，所述分子标记Soff5的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为530bp的条带，序列如SEQ ID NO12。
作为优选，步骤2)所述PCR扩增，满足以下条件：
每25μL的PCR反应体系包括：10×buffer 2.5μL，浓度为25mmol/L的MgC12溶液2.5μL，浓度为1mmol/L的dNTPs溶液2.5μL，浓度为5pmol/L的引物2μL，浓度为1.25～20ng/μL的模板DNA 2μL，浓度为1U/μL的Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O余量；
PCR扩增反应程序为：
A)94℃预变性30s；
B)94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s；
C)72℃延伸5min；
其中步骤B)执行32个循环后在执行步骤C)。
作为优选，步骤3)具体包括以下操作：取步骤2)所得的扩增产物在2％(g/mL)琼脂糖凝胶中以200V电压电泳30min，而后利用凝胶成像系统观察、拍照。
同时本发明提供了应用上述方法进行芦笋单一性别栽培的方法，其特征在于包括以下步骤：选择优良雌雄混合型品种进行播种育苗；按单株提取步骤1所选取幼苗的DNA；任意选取上述之一标记引物对DNA样品进行PCR扩增；对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测；根据PCR扩增目的条带有无判断单株雌、雄性别，PCR扩增出目的条带表明该单株为雄性，无目的条带扩增则为雌性，在苗期快速辨别雌、雄株；结合苗期田间农艺性状，将雄株挑选出来集中进行全雄栽培，余下雌株集中起来进行全雌栽培。
在以上技术方案中，所述分子标记是雄性植株的特征条带，也就是说如果电泳结果中存在特征条带则表明该植株为雄株，如果不存在该条带则表明该植株为雌株。
本发明提供了一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用，该技术方案首先基于芦笋的全基因组框架结合比较基因组学和功能基因组学方法，在芦笋Y染色体上着丝粒区域鉴定出一个862Kb大小的的非重组区域，它决定着芦笋雌、雄性别分化，在分子水平上，芦笋性别决定基因(M)其实是一个非重组的多基因区域；从这个非重组区域分离验证出1个雌性抑制基因SOFF(SUPPRESSOR OF FEMALE FUNCTION)，具有SOFF的表现为雄性，否则为雌性，雄性个体SOFF功能缺失，结果造成芦笋性别表型由雄性到雌雄兼性转化；天门冬属植物基因组比较分析结果表明，SOFF自从天门冬属中雌雄异株起源之初就存在活性Y染色体之上，具有DNA序列保守性。本发明就是基于芦笋SOFF基因CDS序列，开发了4个芦笋雌性抑制基因SOFF的功能性STS分子标记，用于芦笋雌、雄性别鉴别与应用。
在此基础上，本发明针对四个STS分子标记的自身特点设计了相应的引物和通用的PCR扩增条件，并进一步明确了指向雄性植株的特征条带的碱基长度。实验验证发现，本发明提供的4种DNA分子标记均位于芦笋雌性抑制基因SOFF的编码区，在分子遗传上与雌、雄性别表型共分离，雌、雄性别鉴别效率达到100％；且均是基于PCR稳定扩增，能够快捷鉴别芦笋植株的雌、雄性别，同时具有操作简便的技术优势。
进一步实验发现，由于与兴安天门冬、长花天门冬、A.maritumus等天门冬属雌雄异株植物具有高度的基因同源性，本发明所提供的STS分子标记及相应的检测方法在上述植物的性别鉴定中均表现的出了高度的准确性，由此可以明确该方法在多种天门冬属雌雄异株植物性别鉴定中的有效性。基于以上所提供的性别鉴定方法，本发明进一步在农业种植层面开发了单一性别植株的规模化栽培方法，从而为该方法在农业生产中的应用提供了新的思路。本发明可广泛应用于芦笋全雄或全雌栽培、杂交父母本雌、雄性别早期快速鉴别，以及两性株后代超雄株筛选，具有突出的准确性和稳定性。
附图说明
图1为具体实施方式中分子标记Soff1对芦笋种质资源雌、雄DNA池扩增结果；
图2为具体实施方式中分子标记Soff2对芦笋种质资源雌、雄DNA池扩增结果；
图3为具体实施方式中分子标记Soff4对芦笋种质资源雌、雄DNA池扩增结果；
图4为具体实施方式中分子标记Soff5对芦笋种质资源雌、雄DNA池扩增结果；
图5为具体实施方式中分子标记Soff1对种间杂交F2群体扩增结果；
图6为具体实施方式中分子标记Soff2对种间杂交F2群体扩增结果；
图7为具体实施方式中分子标记Soff4对种间杂交F2群体扩增结果；
图8为具体实施方式中分子标记Soff5对种间杂交F2群体扩增结果；
图9为具体实施方式中分子标记Soff1对雌雄混合品系JX1513幼苗期单株扩增结果；
图10为具体实施方式中分子标记Soff2对雌雄混合品系JX1513幼苗期单株扩增结果；
图11为具体实施方式中分子标记Soff4对雌雄混合品系JX1513幼苗期单株扩增结果以及分子标记Soff5对雌雄混合品系JX1513幼苗期单株扩增结果；其中图11上半部分为Soff4的实验结果，图11下半部分为Soff5的实验结果。
在图1-4中，M：DL2000Marker；1-20依次为附表2中芦笋种质资源的雄性DNA池，1'-20'依次为附表2中芦笋种质资源的雌性DNA池；
在图5-8中，M：DL2000Marker；1、2、3、4依次为父本兴安天门冬(XA)、母本台南选3号(TN3)、F1-1(♂)、F1-2(♀)，5-46为F2子代，使用EB替代物ExGelRed核酸染料染色，因冬季气温低染料结合核酸速度慢、不均匀，核酸迁移速率不一致，但对判断雌、雄性别无影响。
在图9-11中，M：DL2000Marker；泳道1-44依次为雌雄混合品系JX1513幼苗期单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式与技术方案进行清楚，完整地描述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1引物设计
基于芦笋SOFF基因CDS序列，利用NCBI/Primer-BLAST与Primer Premier5.0软件相结合，设计开发4种能够鉴别芦笋雌、雄性别的功能性STS分子标记，分别命名为Soff1、Soff2、Soff4、Soff5，并明确各分子标记正反向引物序列，及所对应的特征条带。具体如表1所示。
表1芦笋雌性抑制基因SOFF的STS分子标记特征
Figure BDA0001322493320000071
实施例2STS分子标记在天门冬属植物种质资源雌、雄DNA池间多态性分析
(1)试验材料
选取表2中20个天门冬属植物种质资源作为供试材料，其中，V1-1、V1-2为芦笋花药培养的双单倍体植株，性别决定位点都是纯合的；V2-V14为芦笋二倍体栽培品种；V15-V17为芦笋四倍体栽培品种；V15-V17为天门冬属芦笋近缘野生种，雌、雄异株种质资源代表。
表2供试的天门冬属雌雄异株植物种质资源
Figure BDA0001322493320000072
Figure BDA0001322493320000081
(2)雌、雄DNA池构建
V2-17按品种随机选择5株雄株和5株雄株，分别采取其拟叶，按照雌、雄品种性别等量混合，提取DNA，作为品种(种)雌性和雄性DNA池；同理，V18-V20按种随机选择5株雄株和5株雄株，分别采取其拟叶，按照雌、雄性别等量混合，提取DNA，作为芦笋近缘种雌性和雄性DNA池；V1-1、V1-2分别取样，作为雌、雄双单倍体DNA池。所有拟叶样品使用高通量组织研磨器研磨成粉末，采用CTAB法提取植物基因组。
(3)PCR扩增体系
25mL的PCR反应体系为：10×扩增缓冲液2.5μL；MgC12(25mmol·L-1)2.5μL；dNTPs(1mmol·L-1)2.5μL；引物(5pmol·L-1)2μL，模板DNA(1.25-20ng·μL-1)2μL；Taq DNA聚合酶(1U·μL-1)1μL；加入ddH2O补齐到25μL。
(4)PCR扩增反应程序
预变性94℃30s，94℃30s，56℃30s，72℃40s，32个循环，最后延伸72℃5min。
(5)2％琼脂糖凝胶电泳
扩增产物在2％琼脂糖凝胶中，0.5％TBE，200V电泳30min，海格生物核酸染料ExGelRed染色，凝胶成像系统观察、拍照。
(6)扩增结果与分析
经琼脂糖凝胶电泳，标记Soff1在芦笋雄性DNA池中扩增出长度516bp条带，标记Soff2在芦笋雄性DNA池中扩增出长度777bp条带，标记Soff4在芦笋雄性DNA池中扩增出长度542bp条带，标记Soff5在芦笋雄性DNA池中扩增出长度530bp条带，而在芦笋雌性DNA池中均无相对应目标条带扩增。结果表明，分子标记Soff1、Soff2、Soff4、Soff5在芦笋栽培品种及近缘野生种雌、雄DNA池中均具有遗传多态性，Soff1、Soff2、Soff4、Soff5是与雄性表型紧密连锁的，可以用来鉴定芦笋及近缘雌雄野生种的性别。
实施例3STS分子标记与芦笋雌、雄性别表型遗传连锁分析
(1)试验材料
以芦笋栽培品种台南选3号(TN3)一雌株作为母本，兴安天门冬(XA)一雄株作为父本，种间杂交获得杂种F1，杂种F1-1(♂)、F1-2(♀)姊妹交获得F2群体，共331株，作为STS分子标记与芦笋雌、雄性别表型遗传连锁分析的遗传群体。
(2)DNA提取
按单株采取1-2g上述F2群体，以及母本台南选3号(TN3)、父本兴安天门冬(XA)、F1-1(♂)、F1-2(♀)幼嫩拟叶，使用高通量组织研磨器研磨成粉末，采用CTAB法提取植物基因组DNA。
(3)PCR扩增体系
25mL的PCR反应体系为：10×扩增缓冲液2.5μL；MgC12(25mmol·L-1)2.5μL；dNTPs(1mmol·L-1)2.5μL；引物(5pmol·L-1)2μL，模板DNA(1.25-20ng·μL-1)2μL；Taq DNA聚合酶(1U·μL-1)1μL；加入ddH2O补齐到25μL。
(4)PCR扩增反应程序
预变性94℃30s，94℃30s，56℃30s，72℃40s，32个循环，最后延伸72℃5min。
(5)2％琼脂糖凝胶电泳
扩增产物在2％琼脂糖凝胶中，0.5％TBE，200V电泳30min，海格生物核酸染料ExGelRed染色，凝胶成像系统观察、拍照。
(6)结果与分析
经琼脂糖凝胶电泳，标记Soff1在父本兴安天门冬及雄性F1中扩增出长度516bp条带，标记Soff2在父本兴安天门冬及雄性F1中扩增出长度777bp条带，标记Soff4在父本兴安天门冬及雄性F1中扩增出长度542bp条带，标记Soff5在父本兴安天门冬及雄性F1中扩增出长度530bp条带，而在母本栽培种台南选3号及雌性F1中均无目标条带扩增。结果表明，分子标记Soff1、Soff2、Soff4、Soff5可以用来鉴定F2群体性别。芦笋栽培品种TN3与兴安天门冬种间杂交F2群体331个体进行检测，结果表现雄性带型共180株，雌性151株，与实际性别表型进行遗传连锁分析，遗传距离为0，表现为遗传共分离，雌雄鉴别率达到100％。
实施例3：芦笋苗期Soff1雌、雄性别快速鉴定
(1)试验材料
江西省农科院选育的雌雄混合品系JX1513。
(2)播种育苗
按照芦笋育苗规程浸种、催芽、播种，待幼苗出土1个月后，两根主茎，按单株取1-2g幼嫩拟叶。
(3)DNA提取、PCR扩增体系、PCR扩增反应程序、琼脂糖凝胶电泳等，参照实施例2或3方法进行。选择STS标记Soff1对幼苗群体200株幼苗进行PCR扩增。
(4)雌、雄检测结果
经琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增目的条带有无判断单株雌、雄性别，PCR扩增出目的条带表明该单株为雄性，无目的条带扩增则为雌性，在苗期快速辨别雌、雄株。结果共获得具有Soff1扩增条带雄性植株128株，余下判断为雌株72株。
实施例4：芦笋苗期Soff2雌、雄性别快速鉴定
(1)试验材料
江西省农科院选育的雌雄混合品系JX1513。
(2)播种育苗
按照芦笋育苗规程浸种、催芽、播种，待幼苗出土1个月后，两根主茎，按单株取1-2g幼嫩拟叶。
(3)DNA提取、PCR扩增体系、PCR扩增反应程序、琼脂糖凝胶电泳等，参照实施例2或3方法进行。选择标记Soff2对实例3中同一批200株幼苗单株进行PCR扩增。
(4)雌、雄检测结果
经琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增目的条带有无判断单株雌、雄性别，PCR扩增出目的条带表明该单株为雄性，无目的条带扩增则为雌性，在苗期快速辨别雌、雄株。结果共获得具有Soff2扩增条带雄性植株128株，余下判断为雌株72株。
实施例5：芦笋苗期Soff4雌、雄性别快速鉴定
(1)试验材料
江西省农科院选育的雌雄混合品系JX1513。
(2)播种育苗
按照芦笋育苗规程浸种、催芽、播种，待幼苗出土1个月后，两根主茎，按单株取1-2g幼嫩拟叶。
(3)DNA提取、PCR扩增体系、PCR扩增反应程序、琼脂糖凝胶电泳等，参照实施例2或3方法进行。选择标记Soff4对实例3中同一批200株幼苗单株进行PCR扩增。
(4)雌、雄检测结果
经琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增目的条带有无判断单株雌、雄性别，PCR扩增出目的条带表明该单株为雄性，无目的条带扩增则为雌性，在苗期快速辨别雌、雄株。结果共获得具有Soff4扩增条带雄性植株128株，余下判断为雌株72株。
实施例6：芦笋苗期Soff5雌、雄性别快速鉴定
(1)试验材料
江西省农科院选育的雌雄混合品系JX1513。
(2)播种育苗
按照芦笋育苗规程浸种、催芽、播种，待幼苗出土1个月后，两根主茎，按单株取1-2g幼嫩拟叶。
(3)DNA提取、PCR扩增体系、PCR扩增反应程序、琼脂糖凝胶电泳等，参照实施例2或3方法进行。选择标记Soff5对实例3中同一批200株幼苗单株进行PCR扩增。
(4)雌、雄检测结果
经琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增目的条带有无判断单株雌、雄性别，PCR扩增出目的条带表明该单株为雄性，无目的条带扩增则为雌性，在苗期快速辨别雌、雄株。结果共获得具有Soff2扩增条带雄性植株128株，余下判断为雌株72株。
实施例7：全雌栽培与全雄栽培
结合苗期田间农艺性状，将上述分子标记检测为雄性的128株优良单株挑选出来集中进行全雄栽培，72株雌株集中起来进行全雌栽培。
田间定植24个月后，春季盛花期，按照雌、雄花器官对单株雌、雄性别进行鉴定，全雄栽培栽培群体全部是由雄株组成，全雌栽培栽培群体全部是由雌株组成，雌、雄性别鉴定准确率达100％，实现了全雌栽培与全雄栽培。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省农业科学院
<120>一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用
<160> 12
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>1
AAACACAGGGCGCTACTGAA 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TGTGCGAGTATCCTCCTTGC 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
GCGGGCGTAATTTTCCAGTG 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GACTTGGGCACAGAAGCAAC 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>5
TATCAGGTCGGGGGTAAGCA 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TGACTTGGGCACAGAAGCAA 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
AAGGGTATTATCAGGTCG 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
CCAAGTTGAGTTCAGGGT 18
<210> 9
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
AAACACAGGG CGCTACTGAA CTTCCTCATC CGATGTCAAG 40
TGTCGATCCA TGACATCATA CGAGCCCTGA GGAAGAACCT 80
GCACGATTTC AGAGCCTGCT ATCAAGATCT TGACACCTTT 120
TGGATGAAGA ATGATGATGA GTTCCTAAAA ATCATGATTT 160
ACGATGGGGC TTTCATGATT GAAATCATGA TAGCGACCGT 200
TGAACCATAT GAGCGCACAC CTTCTAGCTA TCATGCCAAG 240
GACCCAATAT TCAAGAAGCC ATACTTGGTC GAAGATCTTC 280
GTGTAGATAT GCTCAGGTTG GATAATCAAA TTCCAATGAA 320
GGTCCTGGAG ATATTGTCTA AATTCTGCAA GAACAAGGTA 360
AGGAATGTTA ATGAAATCTA AATCTTCATA CCTTGAAATG 400
TCCCAGCTGT AACTCCAGAA GAACTTGCAC AAAATTTTCA 440
TACCTCGTAA TGCAAGATTA ACCTAACAGT CAACGTTGTA 480
TGAAATGATA CATTATGCAA GGAGGATACT CGCACA 516
<210> 10
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
GCGGGCGTAATTTTCCAGTGCAGTGAAACGCTGTCATTGA 40
CAGATATATGCTTCACCAAAGGTGTCCTTTGCCTACCTGC 80
AGTCGACGTTGACGAAGCATTTGAAGTTGTTATGCGGAAT 120
CTCATTGCCTATGAGCAAGCACATGGCGAAGGTCAAGAGG 160
TAACATCCTATGTGTTTTTTATGGATGGCATTGTAAACAA 200
TGACAAAGATATTGCCTTGCTTCGAGAGAAGGGTATTATC 240
AGGTCGGGGGTAAGCAGTGATAAGAGGATAGCCGATCTTT 280
TTAATGGACTGACAAAAGGTATAGTTGCAAAAGTTGTCGA 320
CAATGTTGATGTTGATGTAACCAAGGACATCAATGAGTAT 360
TGCAATAGAAGATGGAACAGGTGGCAAGCCAACTTTAAGC 400
AGAGATACTTTGCGAATCCATGGGTAACTTGCTCACTCAT 440
TGTAGGAGCTCTAGTATTAGGTCTCACCATCACTCAAACA 480
ATCTATGGCATCCTTTCTTATAATAAGTGTAGTTAATGTA 520
ACTCTCATACTCGAAAATGTATGGATGATTCCAGTCTTGA 560
TCCCAGTCTTTTGTCATGGCTGTGTGGCTGTAAGCATTGT 600
AATTTGAGACAATGACAAGGATGAATAGGCTAATATCAAC 640
TGAAAAAGCTTCATATTTTTTTTGGTTTTTGCTCAAGATT 680
GAATAAAAATGGCTTTAAAAAGGTAATGTGTAACAATGTC 720
TCAGATTTTATTCTTTCCACACCCTGAACTCAACTTGGTT 760
GCTTCTGTGCCCAAGTC 777
<210> 11
<211> 542
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
TATCAGGTCGGGGGTAAGCAGTGATAAGAGGATAGCCGAT 40
CTTTTTAATGGACTGACAAAAGGTATAGTTGCAAAAGTTG 80
TCGACAATGTTGATGTTGATGTAACCAAGGACATCAATGA 120
GTATTGCAATAGAAGATGGAACAGGTGGCAAGCCAACTTT 160
AAGCAGAGATACTTTGCGAATCCATGGGTAACTTGCTCAC 200
TCATTGTAGGAGCTCTAGTATTAGGTCTCACCATCACTCA 240
AACAATCTATGGCATCCTTTCTTATAATAAGTGTAGTTAA 280
TGTAACTCTCATACTCGAAAATGTATGGATGATTCCAGTC 320
TTGATCCCAGTCTTTTGTCATGGCTGTGTGGCTGTAAGCA 360
TTGTAATTTGAGACAATGACAAGGATGAATAGGCTAATAT 400
CAACTGAAAAAGCTTCATATTTTTTTTGGTTTTTGCTCAA 440
GATTGAATAAAAATGGCTTTAAAAAGGTAATGTGTAACAA 480
TGTCTCAGATTTTATTCTTTCCACACCCTGAACTCAACTT 520
GGTTGCTTCTGTGCCCAAGTCA 542
<210> 12
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
AAGGGTATTA TCAGGTCGGG GGTAAGCAGT GATAAGAGGA 40
TAGCCGATCT TTTTAATGGA CTGACAAAAG GTATAGTTGC 80
AAAAGTTGTC GACAATGTTG ATGTTGATGT AACCAAGGAC 120
ATCAATGAGT ATTGCAATAG AAGATGGAAC AGGTGGCAAG 160
CCAACTTTAA GCAGAGATAC TTTGCGAATC CATGGGTAAC 200
TTGCTCACTC ATTGTAGGAG CTCTAGTATT AGGTCTCACC 240
ATCACTCAAA CAATCTATGG CATCCTTTCT TATAATAAGT 280
GTAGTTAATG TAACTCTCAT ACTCGAAAAT GTATGGATGA 320
TTCCAGTCTT GATCCCAGTC TTTTGTCATG GCTGTGTGGC 360
TGTAAGCATT GTAATTTGAG ACAATGACAA GGATGAATAG 400
GCTAATATCA ACTGAAAAAG CTTCATATTT TTTTTGGTTT 440
TTGCTCAAGA TTGAATAAAA ATGGCTTTAA AAAGGTAATG 480
TGTAACAATG TCTCAGATTT TATTCTTTCC ACACCCTGAA 520
CTCAACTTGG 530

Claims (4)

1.一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取待测的天门冬属雌雄异株植物材料，提取单株总DNA；
2)以其为模板、利用分子标记的引物执行PCR扩增；
3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；
4)观察电泳结果中是否存在上述分子标记的特征条带；
其中，所述天门冬属雌雄异株植物是芦笋、兴安天门冬、长花天门冬或A.maritumus；
所述分子标记位于芦笋雌性抑制基因SOFF基因的编码区；
其中，所述分子标记的引物其核苷酸序列选自以下四组之一：
第一组：
正向引物F：5’-AAACACAGGGCGCTACTGAA-3’；
反向引物R：5’-TGTGCGAGTATCCTCCTTGC-3’；
此时所述特征条带的核苷酸序列如Seq ID No.9所示；
第二组：
正向引物F：5’-GCGGGCGTAATTTTCCAGTG-3’；
反向引物R：5’-GACTTGGGCACAGAAGCAAC-3’；
此时所述特征条带核苷酸序列如Seq ID No.10所示；
第三组：
正向引物F：5’-TATCAGGTCGGGGGTAAGCA-3’；
反向引物R：5’-TGACTTGGGCACAGAAGCAA-3’；
此时所述特征条带核苷酸序列如Seq ID No.11所示；
第四组：
正向引物F：5’-AAGGGTATTATCAGGTCG-3’；
反向引物R：5’-CCAAGTTGAGTTCAGGGT-3’；
此时所述特征条带核苷酸序列如Seq ID No.12所示。
2.根据权利要求1所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于步骤2)所述PCR扩增，满足以下条件：
每25μL的PCR反应体系包括：10×buffer 2.5μL，浓度为25mmol/L的MgC12溶液2.5μL，浓度为1mmol/L的dNTPs溶液2.5μL，浓度为5pmol/L的引物2μL，浓度为1.25～20ng/μL的模板DNA 2μL，浓度为1U/μL的Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O余量；
PCR扩增反应程序为：
A)94℃预变性30s；
B)94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s；
C)72℃延伸5min；
其中步骤B)执行32个循环后在执行步骤C)。
3.根据权利要求1所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于步骤3)具体包括以下操作：取步骤2)所得的扩增产物在2％g/mL琼脂糖凝胶中以200V电压电泳30min，而后利用凝胶成像系统观察、拍照。
4.应用权利要求1所述方法进行芦笋单一性别栽培的方法，其特征在于包括以下步骤：种植芦笋，至得到若干幼苗；利用权利要求1所述方法从若干幼苗中选取单一性别的芦笋幼苗，即得到若干目的幼苗；仅选取所述若干目的幼苗进行全雄或全雌栽培。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107505303B (zh) * 2017-10-09 2019-02-26 华中农业大学 一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法
CN108165652B (zh) * 2018-02-12 2020-04-07 杭州师范大学 用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记tgmi001
CN109655519B (zh) * 2019-01-30 2020-10-23 杭州电子科技大学 一种雌雄异株植物的性别鉴定方法
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CN114350776B (zh) * 2021-11-24 2023-08-29 山东省农业科学院 石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法
CN114717354B (zh) * 2022-04-13 2023-08-11 河南师范大学 一种芦笋超雄株鉴定用分子标记组合、引物组、试剂盒、鉴定方法及应用
CN116287172B (zh) * 2023-02-23 2023-11-07 深圳市仙湖植物园(深圳市园林研究中心) 一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法
CN116965328A (zh) * 2023-08-29 2023-10-31 河北省农林科学院经济作物研究所 一种芦笋与长花天门冬种间杂交后代的获得方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101436229A (zh) * 2008-10-23 2009-05-20 江汉大学 基于issr分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法及其应用
CN102864242B (zh) * 2012-10-11 2013-11-06 浙江省农业科学院 一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法
EP3135103B1 (en) * 2013-06-14 2019-09-04 Keygene N.V. Directed strategies for improving phenotypic traits
CN103468791B (zh) * 2013-07-10 2015-05-13 浙江省农业科学院 分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的pcr引物组
CN103555845B (zh) * 2013-11-01 2015-04-15 河南师范大学 一种鉴别葎草性别的分子生物学方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The asparagus genome sheds light on the origin and evolution of a young Y chromosome;Alex Harkess et al.;《NATURE COMMUNICATIONS》;20171102;第8卷;第1-42页 *

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