CN102864242B - 一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域。方法包括：（1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选；（2）SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切；（3）待检豇豆材料的准备；（4）待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测；和（5）待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检等步骤。该方法具简单易行、快速灵敏、结果准确、成本低廉等特点，分子标记检测过程只需4～5小时，而成本仅为传统表型鉴定的二十分之一左右。本发明可在蔬菜育种、种子鉴定部门推广应用。

Description

一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法

技术领域

本发明属于作物育种生物技术领域，尤其属于利用分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法。

背景技术

长豇豆是我国重要的夏季豆类蔬菜，深受人民群众喜爱。然而豇豆主要种植于夏秋高温干旱季节，全国范围内尤其是北方地区豇豆生产中面临着干旱的巨大威胁。干旱胁迫会造成豇豆大量落花落荚和形成“鼠尾化”豆荚，产量损失巨大，品质下降严重。当前广大豇豆种植者对耐旱性强的优良长豇豆品种的渴求非常迫切（Agbicodo et al., 2009）。因此，改良栽培长豇豆的耐旱性是我国长豇豆育种上亟待解决的重大问题之一。

但是植物包括豇豆的耐旱性属于受多基因控制的复杂性状，其育种改良较为困难。尽管可以通过田间或温室进行苗期或成株期的耐旱鉴定，但是该方法需要大量土地和人力资源，而且耗时费力，对于大量基因型材料的筛选很不现实。目前，豇豆的育种手段仍以常规育种为主。分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，简称MAS）是现代分子生物学与传统遗传育种学相结合的技术。MAS借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而可以快速选择得到具有目的性状的后代(方宣钧等，2001)。通过追踪与耐旱基因关联的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种分离后代中特异性检测目的基因是否存在，而且可以在任一生育阶段的同时对多个性状基因进行筛选。MAS方法迅速、稳定、可靠，不受其它效应和环境因素的影响，可使育种家摆脱对表型性状鉴定的依赖，在早世代进行选择，从而大大提高育种效率。应用MAS，理论上只要回交3代就可以选择到理想的材料。因此，研究开发实用性强、成本低、准确性高的与豇豆耐旱基因关联的分子标记，就可以显著加快豇豆耐旱育种速度，提高选择的效率和准确性，极具应用价值。

    近年来，国内外研究机构已在豇豆上开发了大量的SNP、SSR等标记，有力促进了豇豆分子育种工作（Xu et al., 2010）。SNP (single nucleotide polymorphism) 即单核苷酸多态性，是指在某种生物不同个体DNA序列中存在的单个核苷酸变异。SNP是基因组中最丰富的遗传多态，同时SNP也是最易进行自动化、高通量检测的标记之一。SNP技术已经大量成功地用于遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位等研究。然而，由于SNP标记难于通过PCR检测，因此在育种实践中通常难于直接利用。当SNP的存在引起酶切位点改变时，通过在SNP位点两侧设计引物可将SNP转化为基于PCR的，使用较为方便的酶切扩增多态性序列标记（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）。利用CAPS引物扩增目标基因片段，经相应限制性内切酶酶切后可以揭示原SNP位点的DNA多态性。利用由SNP转化的CAPS标记，育种家已在番茄、辣椒等蔬菜作物上成功进行了应用（李红等，2007；王立浩等，2006）。

发明内容

    本发明目的是：针对豇豆常规育种方法中单纯依靠田间或温室进行苗期或成株期耐旱鉴定所存在的需要大量土地和人力资源及耗时费力等的缺陷，提供一种省时、省力、准确、快捷的分子标记辅助豇豆耐旱品种的选育方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，该方法按以下步骤进行：

    （1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选：用Qiagen公司的植物DNA小量提取试剂盒依说明书所述方法提取耐旱性程度各异的99份豇豆品系的DNA；利用豇豆 Kaspar SNP 基因型检测平台通过芯片杂交检测每份DNA上各1127个SNP位点的基因型，并按缺失信号率<20%，低丰度等位型即MAF值 < 0.1的标准去除低质量的SNP位点，最终保留422个SNP位点的基因型数据并被用于标记-性状关联分析；将上述422个SNP位点的基因型数据与同上所述99份豇豆品系历年温室耐旱性鉴定获得的茎杆绿色程度值Stg，按Tassel软件的MLM的混合线性模型进行关联分析，从中获得与Stg显著关联的P<0.001的SNP标记1_1286；上述温室耐旱性鉴定方法为：对发芽后正常生长20-24天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后对各份种质材料以其Stg即茎杆持绿色性为指标，按以下分级标准进行记载、统计：0级：茎杆正常，无失绿；1级：￡20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄； 

    （2）SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切：根据SNP标记1_1286所在DNA片段序列，利用Macvector软件设计跨SNP位点的PCR引物1_1286CAPS；利用该对引物分别对耐旱豇豆亲本“饭豆”和不耐旱豇豆亲本‘ZJ106’的DNA按如下方法进行PCR扩增：反应体积25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升, 活性为5单位/微升的Taq酶 0.2微升,模板DNA 10纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min,循环35次，最后72℃延伸10min；再将上述扩增产物按下述方法进行BfaI 酶切：酶切体系含PCR产物7微升，10×buffer 1微升，5单位/微升的BfaI 酶 0.2微升，加水至10微升，将酶切和非酶切PCR产物同时在1.5%琼脂糖胶上进行电泳分离，EB显色；其中“饭豆”的扩增产物能释放出180bp和353bp两条酶切片段，‘ZJ106’的扩增产物仅有533bp一条酶切片段；

所述引物的正向序列为：GGATAGTACACTCTGGAATAGG，反向序列为：CTGACTTGAACTACTTGAGGAA；

（3）待检豇豆材料的准备：以农艺性状好，耐旱性较弱的豇豆品种作为非耐旱轮回亲本，以耐旱性强，但农艺性状较差的豇豆品种作为耐旱供体亲本进行杂交，次年起回交2代或2代以上所得的种子作为待检材料，备用；

（4）待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测：用标记1_1286CAPS 对步骤（3）的待检豇豆材料群体，按步骤（2）同样的工艺条件进行PCR扩增，在扩增产物中凡经BfaI酶切后能够释放出180bp和353bp两条酶切片段的材料，即为含豇豆耐旱基因分子标记的检测阳性材料予以保留；凡释放533bp一条酶切片段的材料，即为检测阴性材料予以淘汰；

    （5）待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检；将步骤（4）检测含有耐旱性基因的分离后代材料，培育至成株期后按步骤（1）温室耐旱性指标茎杆持绿性Stg的鉴定方法进行复检，从中将Stg分级<3的列为较耐旱的材料予以保留,而将Stg分级>3列入不耐旱的材料予以淘汰。

    本发明的有益效果是：

    1. 苗期鉴定，减少工作量，节约成本：本发明获得了与控制豇豆持绿性耐旱基因连锁的SNP分子标记位点1_1286，并转为CAPS标记1_1286CAPS，可成功应用于耐旱基因的辅助转育检测；该方法具有检测方便、揭示多态性能力稳定、费用低廉等优点；用此标记可在苗期检测耐旱基因的存在与否从而预测该植株的耐旱性，能在早期淘汰大量的无用不耐旱分离后代，可以将后续移栽、管理、鉴定等的工作量压力减少到最低限度。常规育成豇豆品种需6-8年的周期，应用分子标记辅助选择育种，可以在同一时间内分析多个品种，并只需3-4个月的时间就可以明确分离后代中目标基因的存在与否，从而使新品种的选育能在3-4年内完成，大大节省了人力和物力。 

    2. 提高了选择的准确性：传统育种方法需要对杂交后代的耐旱性进行田间或温室逐个鉴定，由于耐旱表型高度复杂，易受环境的影响，表型鉴定常有一定的误差，利用分子标记进行实验室检测后可以避免环境对耐旱表型的影响，准确性得到了提高。本方法在苗期分子标记检测初筛的基础上，进而对中选材料的成株期进行茎杆持绿性Stg与农艺性状相结合的表型复检，进一步提高了选择的准确性。

    3. 本发明基于豇豆种质资源进行标记-性状关联分析方法，避免了利用传统双亲本分离群体如F₂、重组自交系等进行标记-性状的连锁分析需要通过多代培育构建遗传分离群体的缺点，加快了获得分子标记的速度；而且，关联分析在检测标记-性状相关性方面往往具有比连锁分析更高的分辨率，在分子标记辅助育种中的准确性可靠。

    4、本发明特点（优点或创新点）是：苗期采用分子标记选择，检测需DNA量少而方便快速，能在早期剔除大多数非目标株，大大减少了后续田间工作量。利用基于关联分析的分子标记方法可以对大量种质资源及其杂交、回交后代进行分析，较快地从大量目标株中选出育种亲本材料，缩短育种的世代和时间。所有具有与“饭豆” DNA上SNP位点1_1286完全相同碱基组成的耐旱豇豆品系都可以用引物1_1286CAPS 进行标记辅助选择。

 附图说明

图1  耐（R）与不耐旱（S）材料中引物1_1286CAPS 所揭示的DNA片段序列多态性的图片；其中，黑色方框标示多态碱基位置

图2  按0-5级标准划分的豇豆成株期耐旱性的示意图片

其中，0级：茎杆正常，无失绿；1级：￡20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全脱落。 

         具体实施方式                

本发明通过以下实施例并结合附图作进一步的详细说明，但应该理解本发明并不受以下内容所限止。

实施例所涉豇豆材料：饭豆、ZJ106、314及特早30均系常规品种，可在浙江浙农种业有限公司购买。

实施例1：（豇豆品系‘ZJ106’和“饭豆”杂交回交后代的分子标记辅助选择）

    （1）不耐旱主栽品种与耐旱资源的杂交和回交：挑选饱满的非耐旱轮回亲本（‘ZJ106’，农艺性状好，耐旱性较弱）和耐旱供体亲本（“饭豆”，耐旱性强，但农艺性状较差）播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为F₁；次年将F₁（5粒左右即可）和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为BC₁F₁；第三年将 BC₁F₁（30粒左右）和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后按株系收取种子，即为BC₂F₁，每株系收20粒左右种子；

    （2）苗期分子标记选择：将步骤（1）获得的600粒左右 BC₂F₁分离后代种子，分单株播种于大田；待种子发芽后第一对三出复叶平展时，每一单株挂牌后取叶片样本0.1克，液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取DNA；首先配制CTAB缓冲液：100 mL 1 mol·L^-1 Tris pH 7.5，140 mL 5 mol·L^-1 NaCl，20 mL 0.5 mol·L^-1 EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H₂O，20 g CTAB；DNA提取时取10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150 μL CTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150 μL CTAB缓冲液混匀；65℃水浴40min；加入300 μL 24:1氯仿/异戊醇，上下混匀5 min，使样品与氯仿充分混和；13000 r·min^-1离心5min；取上清液150 μL，加入在-20℃预冷的异丙醇200 μL中轻轻上下颠倒混匀；10000~12000 r·min^-1离心3~4 min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50~100 μL含RNase的ddH₂O溶解DNA；然后用1%的琼脂糖电泳检测；用本发明的CAPS标记进行PCR扩增，反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升的Taq酶 0.2微升， 模板DNA 10纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸10min，在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增；酶切体系取PCR产物7微升，10×buffer 1微升，5单位/微升的BfaI 酶 0.2微升，加水至10微升；将酶切和非酶切PCR产物同时在1.5%琼脂糖胶上进行电泳分离，EB显色，记录结果；在耐旱亲本和回交BC₂F₁代群体中，能酶切出180bp和353bp两条酶切片段的单株即具有与耐旱基因显著关联分子标记的单株予以保留；PCR扩增产物酶切后无180bp和353bp两条酶切片段释放的单株，则不具有与耐旱基因显著关联分子标记，予以淘汰；

    （3）成株期表型复选：对经步骤（2）分子标记筛选入选的植株进行正常水肥管理，对发芽后生长20天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后，按以下分级标准调查各植株茎杆绿色程度Stg以评价各单株的耐旱性：0级：茎杆正常，无失绿；1级：￡20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄； 

并结合各株农艺性状，从中选择耐旱性强且农艺性状优异的单株，自交获得 BC₃F₂，即为理论上农艺性状较优、耐旱性得到改善且基因型较为纯合的新品系；

（4）结果与分析：通过对7株经CAPS标记分析提示为含有耐旱基因的分离后代进行温室耐旱性指标茎杆持绿性（Stg）的鉴定，结果表明有6株Stg<3为耐旱，一株Stg>3为不耐旱，表明分子标记检测的准确率在85%以上；再通过耐旱表型复选和农艺性状筛选以弥补标记辅助选择的误差，最后获得了1个耐旱优良新品系，命名为“ZF1”。

实施例2：（豇豆品系‘特早30’和“314”杂交回交后代的分子标记辅助选择）

    耐旱豇豆品系“314”在标记1_1286CAPS的扩增片段上具有与“饭豆”完全一致的DNA序列，因此可以通过标记1_1286CAPS进行标记辅助选择。

   （1）不耐旱主栽品种与耐旱资源的杂交和回交：挑选饱满的非耐旱轮回亲本（‘特早30’，农艺性状好，耐旱性较弱）和耐旱供体亲本（“314”，耐旱性强，但农艺性状较差）播于大田；待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为F₁；次年将F₁（5粒左右即可）和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为BC₁F₁；第三年将 BC₁F₁(30粒左右)和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后按株系收取种子，即为BC₂F₁，每株系收20粒左右种子；

    （2）苗期分子标记选择：将步骤（1）获得的600粒左右 BC₂F₁分离后代种子，分单株播种于大田，待种子发芽后第一对三出复叶平展时，每一单株挂牌后取叶片样本0.1克，液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取DNA；首先配制CTAB缓冲液：100 mL 1 mol·L^-1 Tris pH 7.5，140 mL 5 mol·L^-1 NaCl，20 mL 0.5 mol·L^-1 EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H₂O，20 g CTAB；DNA提取时取10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150 μL CTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150 μL CTAB缓冲液混匀；65℃水浴40min，加入300 μL 24:1氯仿/异戊醇，上下混匀5 min，使样品与氯仿充分混和；13000 r·min^-1离心5min，取上清液150 μL，加入在-20℃预冷的异丙醇200 μL中，轻轻上下颠倒混匀； 10000~12000 r·min^-1离心3~4 min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50~100 μL含RNase的ddH₂O溶解DNA，然后用1%的琼脂糖电泳检测；用本发明的CAPS标记进行PCR扩增，反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升, 5单位/微升的Taq酶 0.2微升, 模板DNA 10纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸10min，在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增；扩增产物取7微升进行BfaI酶切，酶切体系含PCR产物7微升，10×buffer 1微升，5单位/微升的BfaI 酶 0.2微升，加水至10微升；将酶切和非酶切PCR产物同时在1.5%琼脂糖胶上进行电泳分离，EB显色，记录结果；在耐旱亲本和回交BC₂F₁代群体中能酶切出180bp和353bp两条酶切片段的单株，即具有与耐旱基因显著关联分子标记的予以保留；PCR扩增产物酶切后无180bp和353bp的两条酶切片段释放的单株，则不具有与耐旱基因显著关联分子标记，则予以淘汰；

    （3）成株期表型复选：对经步骤（3）分子标记筛选入选的植株进行正常水肥管理，对发芽后正常生长24天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后，按以下分级标准调查各植株茎杆绿色程度Stg以评价各单株的耐旱性：0级：茎杆正常，无失绿；1级：￡20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄； 并结合各株农艺性状，从中选择耐旱性强且农艺性状优异的单株，自交获得 BC₃F₂，即为理论上农艺性状较优、耐旱性得到改善且基因型较为纯合的新品系；

（4）结果与分析：通过对11株经CAPS标记分析提示为含有耐旱基因的分离后代进行温室耐旱性指标茎杆持绿性（Stg）的鉴定，结果表明有9株Stg<3为耐旱，2株Stg>3为不耐旱，表明分子标记检测的准确率在80%以上；再通过耐旱表型复选和农艺性状筛选以弥补标记辅助选择的误差，最后获得了1个耐旱优良新品系，命名为“T3-1”。

序列表

 

<110>浙江省农业科学院

<120>一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法

<160>22

 

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术有限公司合成，用作1_1286CAPS分子标记的上游引物

<400>1

GGATAGTACACTCTGGAATAGG  22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术有限公司合成，用作1_1286CAPS分子标记的下游引物

<400> 2

CTGACTTGAACTACTTGAGGAA  22

 

Claims (1)

1.一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，其特征在于按以下步骤进行：

    （1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选：用Qiagen公司的植物DNA小量提取试剂盒依说明书所述方法提取耐旱性程度各异的99份豇豆品系的DNA；利用豇豆 Kaspar SNP 基因型检测平台通过芯片杂交检测每份DNA上各1127个SNP位点的基因型，并按缺失信号率<20%，MAF值 < 0.1的标准去除低质量的SNP位点，最终保留422个SNP位点的基因型数据并被用于标记-性状关联分析；将上述422个SNP位点的基因型数据与同上所述99份豇豆品系历年温室耐旱性鉴定获得的茎杆绿色程度值Stg，按Tassel软件的MLM的混合线性模型进行关联分析，从中获得与Stg显著关联的P<0.001的SNP标记1_1286；上述温室耐旱性鉴定方法为：对发芽后正常生长20-24天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后对各份种质材料以其Stg即茎杆持绿色性为指标，按以下分级标准进行记载、统计：0级：茎杆正常，无失绿；1级：＜=20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄； 

    （2）SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切：根据SNP标记1_1286所在DNA片段序列，利用Macvector软件设计跨SNP位点的PCR引物1_1286CAPS；利用该对引物分别对耐旱豇豆亲本“饭豆”和不耐旱豇豆亲本“ZJ106”的DNA按如下方法进行PCR扩增：反应体积25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升, 活性为5单位/微升的Taq酶 0.2微升，模板DNA 10纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min,循环35次，最后72℃延伸10min；再将上述扩增产物按下述方法进行BfaI 酶切：酶切体系含PCR产物7微升，10×buffer 1微升，5单位/微升的BfaI 酶 0.2微升，加水至10微升，将酶切和非酶切PCR产物同时在1.5%琼脂糖胶上进行电泳分离，EB显色；其中“饭豆”的扩增产物能释放出180bp和353bp两条酶切片段，“ZJ106”的扩增产物仅有533bp一条酶切片段；

所述引物的正向序列为：GGATAGTACACTCTGGAATAGG，反向序列为：CTGACTTGAACTACTTGAGGAA；

（3）待检豇豆材料的准备：以农艺性状好，耐旱性较弱的豇豆品种作为非耐旱轮回亲本，以耐旱性强，但农艺性状较差的豇豆品种作为耐旱供体亲本进行杂交，次年起回交2代或2代以上所得的种子作为待检材料，备用；

（4）待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测：用PCR引物1_1286CAPS 对步骤（3）的待检豇豆材料群体，按步骤（2）同样的工艺条件进行PCR扩增，在扩增产物中凡经BfaI酶切后能够释放出180bp和353bp两条酶切片段的材料，即为含豇豆耐旱基因分子标记的检测阳性材料予以保留；凡释放533bp一条酶切片段的材料，即为检测阴性材料予以淘汰；

      （5）待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检；将步骤（4）检测含有耐旱性基因的分离后代材料，培育至成株期后按步骤（1）温室耐旱性指标茎杆持绿性Stg的鉴定方法进行复检，从中将Stg分级<3的列为较耐旱的材料予以保留,而将Stg分级>3列入不耐旱的材料予以淘汰。

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