CN114350776B - 石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法，主要涉及农业生物工程领域。包括Asp‑YS1引物和Asp‑YS2引物，用以在生物样本中对雄性石刁柏实现筛选。本发明的有益效果在于：它解决现有分子标记对芦笋性别鉴定不准确的问题，提高芦笋育种的效率以及进行精准育种。

Description

石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法

技术领域

本发明涉及农业生物工程领域，具体是石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法。

背景技术

石刁柏(Asparagus officinalis L.)，通常称芦笋，为多年生草本植物，其幼茎营养丰富，风味独特，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，经济价值高，被誉为“蔬菜之王”。石刁柏为天门冬亚属植物。天门冬属(Asparagus)植物归属单子叶植物纲天门冬目，天门冬科。天门冬属又分为天门冬亚属(subgenus of Asparagus)、Myrsiphyllum和原始天门冬(Protasparagus)3个亚属。Myrsiphyllum和原始天门冬(Protasparagus)植物为两性花，而天门冬亚属为单性花，且为雌雄异株。芦笋雌株和雄株之间区别明显。雄株因不结果实消耗养分少，产量比同期生长条件相同的雌株高出25％以上，且寿命长，抗性强，因此，由全部雄株组成的全雄品种目前在全球芦笋种子市场中占主导地位。然而，芦笋从播种到开花需要2-3年，在开花前，很难区分雌株和雄株，这严重阻碍了全雄品种选育的进程。因此，开发与芦笋性别决定基因紧密连锁的分子标记将有助于在苗期快速准确区分雌株和雄株，为亲本选择，杂交制种以及全雄品种选育提供了有力的技术支撑。

目前对于石刁柏性别连锁的基因克隆及分子标记的研究多集中在一些与该基因连锁的遗传标记，包括形态标记、生化标记(范双喜和宋学峰，1995)和DNA分子标记(Reamon-Büttner and Jung，2000)的研究。Bracale等(1991)根据Mdh在芦笋雌雄性别间的差异，利用连锁分析对M位点进行定位，其遗传距离为20cM，距离M位点太远，在实际育种过程中不能应用。Jiang等(1997)报道了在芦笋雌雄株混合品种中，利用“双假测交”的方法，在芦笋性染色体L5中开发了1个Mdh标记、4个RFLP标记和14个RAPDs标记。Jiang和Sink(1997)开发了一个芦笋性别决定基因M连锁的RAPD标记，并转化成了SCAR标记。Spada等(1998)利用AFLP标记进一步加密了性染色体L5上的标记类型，分别包含18个AFLP、13个RFLP、2个RAPD和Mdh标记。Nakayama等(2006)利用开发的Asp1-T7标记(Jamsari et al.,2004)转化成了扩增更加稳定的Asp-T7sp标记。Gebler等(2007)筛选了一条与雌性基因m连锁的约700bp的条带，以此来鉴定芦笋的雄性纯合株，但其可靠性有待进一步验证。Ii等(2012a)开发了一个雄性特异的STS片段标记MSSTS710，可以在芦笋中进行性别鉴定。但是，在芦笋育种实践过程中，利用前人开发的DNA分子标记进行辅助鉴定时，发现受试验材料的限制，其分子标记通用性差(周劲松等,2007；2012)。其中通用性好，可用来鉴别芦笋的分子标记只有显性标记Asp1-T7sp和MSSTS710。周劲松等(2017)利用SOFF基因的CDS序列开发了4个STS分子标记(CN107201404A，一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴定方法及其应用)。我们利用该专利中的4个STS分子标记在24个芦笋品种的雌株和雄株进行检测，发现这些标记在所检测品种中通用性不高。Mitoma等(2018)利用芦笋性别决定基因AspTDF1开发的AspMSD可以用于紫芦笋的雌雄育种过程。可见，在芦笋育种实践中，目前尚缺乏通用性好，稳定性高的鉴定雌雄性别的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供石刁柏雄性特异的引物及生物性别鉴定方法，它解决现有分子标记对芦笋性别鉴定不准确的问题，提高芦笋育种的效率以及进行精准育种。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

石刁柏雄性特异的引物，包括Asp-YS1引物和Asp-YS2引物：

Asp-YS1引物：Asp-YS1-F(5’-CCTATCTAATACATCATAACACG-3’)，Asp-YS1-R(5’-CCGAGATCAAGTTGTATATAATC3’-)；

Asp-YS2引物：Asp-YS2-F(5’-TTTCACTAGAAGATTACATTGTG3’-)，Asp-YS2-R(5’-GTTTTCCATTCTGGTATGTGTAA3’-)；

所述Asp-YS1引物和Asp-YS2引物通过PCR扩增，用以在生物样本中对雄性石刁柏实现筛选。

所述Asp-YS1引物的扩增序列为：

CCTATCTAATACATCATAACACGTTGCTGTTGAATCCACATATTCTCTGAGAAACAACAGTACTTGATATACTAACTTAGCACATTTAAAACACCTGTAGTTGTTTTCTCCACTCCCTTCCCGTAGTAGGAAGAACAAAAAACACCATTTCTCAAACTATAAGCTCCATAATTTACCAAGCCATGTGAATTCAATCATAATTAGTATCACTATCATCTGAAATAATGTAATTTGAAAAGAGACACGAAACGGAACATCTATAACACCAAAACCCATTTTTATATGTAATCAAGAGTTGGTTCTGGTGCCCCATCTTGCCAATGCAAAGGGAAGCCTTCAAGCTTTTTTTCATGAGTGGCATTGAAACAAAACCCACGTAGCAAGAAATGAACTGGTAAACAAGGTTCTCAGAATATTTTGACTTGGACCAGGCGCAACTAAGTCAAGTTACATGGGAGCTTAAAATCGATTATATACAACTTGATCTCGG；

所述Asp-YS2引物的扩增序列为：

TTTCACTAGAAGATTACATTGTGAGGAAGATAGTGGAAAGGCACCATGGAAAGTGTTTGATTTGGGTACTCGGTAGGGTGCGGATTTTGGTGCTTCCAAATGCCTCGCATATTGAGAATCCTCAGCAACTATTCACGCCAAGCTTATGTTAGTCTTGTGACCTCATTGACTGGTCATAtttcagtattttttttttaattctcgtTTGGAATGCTTGTTTAAAGAATTTTGCTTTGATGGTAATGTAGATTTTTATTTCAATTATATCATGTTTTACACATACCAGAATGGAAAAC。

石刁柏的生物性别鉴定方法，包括以下步骤：

获取石刁柏的目标生物样本，并提取目标生物样本的基因组DNA；

使用如权利要求1所述的引物，通过PCR扩增获得PCR产物；

对PCR产物进行凝胶电泳检测，获得电泳条带，有扩增条带鉴定为雄性，无扩增条带鉴定为雌性。

进一步的，所述PCR扩增设计的反应体系为：

进一步的，所述PCR扩增设计的反应过程为：

1)98℃预变性2min；

2)循环扩增：a)98℃变性30s；

b)56℃退火30s

c)72℃延伸30s

重复a—c 30个循环；

3)72℃延伸5min。

进一步的，所述对PCR产物进行凝胶电泳检测包括，对PCR产物在1.0％(g/ml)琼脂糖凝胶中以120v电压继续电泳30min，而后利用凝胶成像系统拍照。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明获得了2个针对石刁柏雄性特异的STS标记，从而能够提供针对芦笋雌株和雄株性别鉴定的分子生物学鉴定方法，以解决现有分子标记对芦笋性别鉴定不准确的问题，提高芦笋育种的效率以及进行精准育种。

(2)本发明针对2个分子标记的自身特点设计了相应的引物和通用的扩增条件,并进一步明确了指向雄性植株的特征条带的碱基长度。本发明提供的分子标记在雄株中稳定扩增，其分子遗传上与雌、雄性别表型共分离,能够有效鉴别芦笋植株的雌、雄性别,同时具有操作简便的技术优势。

(3)基于以上所提供的性别鉴定方法,本发明可广泛应用于芦笋全雄育种、杂交后代雌、雄性别早期快速鉴定,具有突出的准确性和稳定性。

附图说明

图1是本发明实施例3中根据序列比对获得的16对雄性特异引物在De Paoli品种雌株和雄株中的扩增.XX为De Paoli雌株，XY为De Paoli雄株，YY为全雄株。

图2是本发明实施例4 Asp-YS1和Asp-YS2以及对照引物Asp1-T7sp在22个品种中的扩增.F为雌株，M为雄株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：供试芦笋样品基因组DNA的提取

对De Paoli品种的雌株和雄株幼嫩叶片进行基因组DNA的提取，方法如下：

按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)说明书中的记载提取供试样品基因组DNA，具体步骤如下：

①在液氮中研磨100mg新鲜或20℃冷冻的样品材料(注：样品要快速、充分研磨为粉末)；

②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1wt％)，迅速颠倒混匀后，将离心管在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

③加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；

注：若提取富含多糖或淀粉的植物组织，可在第③步前，用酚:氯仿(体积比1:1)进行等体积抽提；

④将所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀；

⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12,000rpm离心30s，弃掉废液；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，弃掉废液；

⑦向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液；

⑧重复步骤⑦；

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；

⑩将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50～200μL洗脱缓冲液TE(pH值在7.0～8.5之间)，室温放置2～5min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液，得到样本的基因组DNA；

最后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。

实施例2：雄性特异序列查找和引物设计

从NCBI数据库中下载包含X染色体的全基因组序列以及Y染色体序列，用Perlscripts对Y染色体序列加工后与包含X染色体的全基因组序列进行序列比对(blastn)，利用the scripts软件获得比对后Y-特异的序列，利用Premier 5软件对这些序列设计引物进行单株性别鉴定。

确定本方法中与芦笋性别决定相关的STS标记引物如下：

Asp-YS1引物：Asp-YS1-F(5’-CCTATCTAATACATCATAACACG-3’)Asp-YS1-R(5’-CCGAGATCAAGTTGTATATAATC3’-),

Asp-YS2引物：Asp-YS2-F(5’-TTTCACTAGAAGATTACATTGTG3’-)Asp-YS2-R(5’-GTTTTCCATTCTGGTATGTGTAA3’-)

上述引物的扩增序列如下：

>Asp-YS1

CCTATCTAATACATCATAACACGTTGCTGTTGAATCCACATATTCTCTGAGAAACAACAGTACTTGATATACTAACTTAGCACATTTAAAACACCTGTAGTTGTTTTCTCCACTCCCTTCCCGTAGTAGGAAGAACAAAAAACACCATTTCTCAAACTATAAGCTCCATAATTTACCAAGCCATGTGAATTCAATCATAATTAGTATCACTATCATCTGAAATAATGTAATTTGAAAAGAGACACGAAACGGAACATCTATAACACCAAAACCCATTTTTATATGTAATCAAGAGTTGGTTCTGGTGCCCCATCTTGCCAATGCAAAGGGAAGCCTTCAAGCTTTTTTTCATGAGTGGCATTGAAACAAAACCCACGTAGCAAGAAATGAACTGGTAAACAAGGTTCTCAGAATATTTTGACTTGGACCAGGCGCAACTAAGTCAAGTTACATGGGAGCTTAAAATCGATTATATACAACTTGATCTCGG

>Asp-YS2

TTTCACTAGAAGATTACATTGTGAGGAAGATAGTGGAAAGGCACCATGGAAAGTGTTTGATTTGGGTACTCGGTAGGGTGCGGATTTTGGTGCTTCCAAATGCCTCGCATATTGAGAATCCTCAGCAACTATTCACGCCAAGCTTATGTTAGTCTTGTGACCTCATTGACTGGTCATAtttcagtattttttttttaattctcgtTTGGAATGCTTGTTTAAAGAATTTTGCTTTGATGGTAATGTAGATTTTTATTTCAATTATATCATGTTTTACACATACCAGAATGGAAAAC

实施例3：雄性特异序列PCR检测

利用上述引物进行PCR，步骤如下：

(1)以步骤(1)制得的目标DNA基因组为模板，利用步骤2中的引物组进行普通PCR，制得PCR产物；

具体的，PCR的反应体系为20μL，体系组分如下：

PCR的反应过程如下：

1)98℃预变性2min；

2)循环扩增：a)98℃变性30s；

b)56℃退火30s

c)72℃延伸30s

重复a--c30个循环；

3)72℃延伸5min。

(2)对步骤(1)制得的PCR产物进行凝胶电泳检测，观察条带特异性。

对PCR产物在1.0％(g/ml)琼脂糖凝胶中以120v电压继续电泳30min，而后利用凝胶成像系统观察、拍照。

结果分析：由于查找的序列为Y染色体特异序列，那么在雄株(XY)中有扩增条带，而在雌株(XX)中无扩增条带。从结果可以看出，在这16对引物中，只有Asp-YS1和Asp-YS2与雌雄株性别一致，并且3个重复稳定。

实施例4：对比例，用于鉴定雄性特异的Asp1-T7sp标记与本发明中的Asp-YS1和Asp-YS2鉴定结果

为验证本发明的创造性，用实验室保存的22个芦笋品种雌株和雄株DNA为模板进行验证，Asp-YS1准确率为95.5％，Asp-YS2准确率为90.9％。而前人报道通用性较好的标记Asp1-T7sp准确率为27.3％，因此，本发明建立的Asp-YS1和Asp-YS2在鉴定芦笋品种雌雄株性别中通用性更好。

Claims (4)

1.石刁柏的生物性别鉴定方法，其特征在于，使用Asp-YS1引物和Asp-YS2引物对石刁柏的生物性别鉴定；包括以下步骤：

获取石刁柏的目标生物样本，并提取目标生物样本的基因组DNA；

使用上述引物，通过PCR扩增获得PCR产物；对PCR产物进行凝胶电泳检测，获得电泳条带，在490 bp或296 bp处，有扩增条带鉴定为雄性，无扩增条带鉴定为雌性；

Asp-YS1引物和Asp-YS2引物：

Asp-YS1引物：Asp-YS1-F 5’-CCTATCTAATACATCATAACACG-3’ ，

Asp-YS1-R 5’-CCGAGATCAAGTTGTATATAATC-3’；

Asp-YS2引物：Asp-YS2-F 5’-TTTCACTAGAAGATTACATTGTG-3’，

Asp-YS2-R 5’-GTTTTCCATTCTGGTATGTGTAA-3’；

所述Asp-YS1引物的扩增序列为：

CCTATCTAATACATCATAACACGTTGCTGTTGAATCCACATATTCTCTGAGAAACAACAGTACTTGATATACTAACTTAGCACATTTAAAACACCTGTAGTTGTTTTCTCCACTCCCTTCCCGTAGTAGGAAGAACAAAAAACACCATTTCTCAAACTATAAGCTCCATAATTTACCAAGCCATGTGAATTCAATCATAATTAGTATCACTATCATCTGAAATAATGTAATTTGAAAAGAGACACGAAACGGAACATCTATAACACCAAAACCCATTTTTATATGTAATCAAGAGTTGGTTCTGGTGCCCCATCTTGCCAATGCAAAGGGAAGCCTTCAAGCTTTTTTTCATGAGTGGCATTGAAACAAAACCCACGTAGCAAGAAATGAACTGGTAAACAAGGTTCTCAGAATATTTTGACTTGGACCAGGCGCAACTAAGTCAAGTTACATGGGAGCTTAAAATCGATTATATACAACTTGATCTCGG；

所述Asp-YS2引物的扩增序列为：

TTTCACTAGAAGATTACATTGTGAGGAAGATAGTGGAAAGGCACCATGGAAAGTGTTTGATTTGGGTACTCGGTAGGGTGCGGATTTTGGTGCTTCCAAATGCCTCGCATATTGAGAATCCTCAGCAACTATTCACGCCAAGCTTATGTTAGTCTTGTGACCTCATTGACTGGTCATAtttcagtattttttttttaattctcgtTTGGAATGCTTGTTTAAAGAATTTTGCTTTGATGGTAATGTAGATTTTTATTTCAATTATATCATGTTTTACACATACCAGAATGGAAAAC；

使用Asp-YS1引物和Asp-YS2引物，能够对以下21个品种的芦笋性别鉴定，品种为：DePaoli、New Dynasty、冠军、京绿 3号、京绿 1号、169、农家种、Grande、Atlas、WB-210、EarlyCalifornia、Space 3、Space 4、Space 5、Space 6、Farmer 2、UC157、Apollo、Farmer 3、Jersey Giant和NJ978。

2.根据权利要求1所述石刁柏的生物性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：

Tks Gflex^TM DNA polymerase1.5 U；

2×Gflex PCR Buffer 10 μL；

正向引物 0.2 μg；

反向引物 0.2 μg；

DNA模板 50-100 ng；

加入ddH₂O至总体积 20 μL；

其中，在2×Gflex PCR Buffer中，含有2 mM的镁离子，400μM的dNTP。

3.根据权利要求1所述石刁柏的生物性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应过程为：

1)98℃预变性2min；

2)循环扩增：a)98℃变性30s；

b)56℃退火30s

c)72℃延伸30s

重复a—c 30个循环；

3)72℃延伸5min。

4.根据权利要求1所述石刁柏的生物性别鉴定方法，其特征在于，所述对PCR产物进行凝胶电泳检测包括，对PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中以120v电压继续电泳30min，而后利用凝胶成像系统拍照。