CN114807421A

CN114807421A - 基于ssr标记构建芦笋分子身份证的方法

Info

Publication number: CN114807421A
Application number: CN202210538219.1A
Authority: CN
Inventors: 王兴军; 赵术珍; 纳维德·艾哈迈德; 厉广辉; 赵传志; 田锐铮; 侯蕾; 潘教文
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2022-07-29

Abstract

本发明公开了基于SSR标记构建芦笋分子身份证的方法，涉及植物品种鉴别领域。本发明提供了一种用于鉴别芦笋品种的分子标记组合，还提供了一种用于鉴别芦笋品种的引物组合。本发明还提供了一种芦笋品种分子身份证的构建方法，包括：采集不同品种的芦笋，利用上述的引物组合对不同品种的芦笋的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果构建所述芦笋分子身份证。本发明的方法能够快速的构建芦笋品种分子身份证或指纹图谱，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。

Description

基于SSR标记构建芦笋分子身份证的方法

技术领域

本发明涉及植物品种鉴别领域，特别是涉及基于SSR标记构建芦笋分子身份证的方法。

背景技术

芦笋(Asparagus officinalis L.)，又称石刁柏，为多年生草本植物，具有极高的营养、保健与药用价值。据联合国粮食及农业组织企业统计数据库统计，2014-2020年期间全球和我国芦笋种植面积及产量均呈逐年增长态势。2020年，我国芦笋的种植面积150万亩。芦笋产业发展存在一个限制性问题是种子混杂严重。因芦笋种子价格高，导致一些非F1杂交种、劣质种子、淘汰种子在市场上泛滥，仅靠种子外形很难辨别好坏。由于芦笋是多年生植物，播种后2-3年才能采笋，从产量上确定其好坏，因此，一旦种子质量差，严重影响笋农的利益。如何鉴别芦笋的真伪、品种纯度成为一个亟待解决的问题。分子标记可直接反映个体DNA水平上的差异，不受环境与季节的影响，过程简便且结果可靠，可有效弥补依据表型性状进行品种鉴定的不足。众多分子标记中SSR标记因其数量众多、分布广泛、共显性、重复性好、通用性高，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术。目前，芦笋全基因组测序已经完成，但未见利用SSR建立芦笋分子身份证的报道。以此方法构建芦笋品种的分子身份证，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供基于SSR标记构建芦笋分子身份证的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的方法能够快速的构建芦笋品种分子身份证或指纹图谱，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于鉴别芦笋品种的分子标记组合，所述分子标记包括Asp-SSR6C4、Asp-SSR2C6和Asp-SSR3C10，所述Asp-SSR6C4通过如SEQ ID NO：1-2所示引物对扩增得到，所述Asp-SSR2C6通过如SEQ ID NO：3-4所示引物对扩增得到，所述Asp-SSR3C10通过如SEQ ID NO：5-6所示引物对扩增得到。

本发明还提供一种用于鉴别芦笋品种的引物组合，包括3对引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-6所示。

本发明还提供一种用于鉴别芦笋品种的试剂盒，包含上述的引物组合。

本发明还提供一种芦笋品种分子身份证的构建方法，包括：采集不同品种的芦笋，利用上述的引物组合对不同品种的芦笋的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果构建所述芦笋分子身份证。

进一步地，所述芦笋的品种包括：UC157、格兰德、沃克卓越、沃克先锋、阿特拉斯、阿波罗、千禧、阿根特伊、紫色激情、冠军、硕丰、京绿1、京绿2、京绿3、京绿4、京科1、京科2、京科3、浙丰1、东芝1、东芝2、航育1、航育6和浙丰801。

进一步地，所述PCR扩增的体系为：2xNG PCRMaster Mix 10μL，正向引物0.2μg，反向引物0.2μg，DNA模板50-100ng，加入ddH₂O至总体积20μL。

进一步地，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s；50-56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

本发明还提供上述的分子标记组合、引物组合或试剂盒在获取芦笋分子身份证中的应用。

本发明还提供上述的分子标记组合、引物组合或试剂盒在鉴别芦笋品种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的3对SSR多态性引物，能够快速的构建芦笋品种分子身份证或指纹图谱，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。

本发明方法构建的芦笋品种的分子身份证，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Asp-SSR6C4、Asp-SSR2C6和Asp-SSR3C10分子标记在24个芦笋品种中的多态性扩增，其中图中的白色数字表示引物在24个品种中扩增的不同的等位基因。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1供试芦笋样品基因组DNA的提取

按天根生化科技(北京)有限公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)说明书中的记载提取供试样品基因组DNA，之后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。

该试剂盒的具体操作步骤如下：

①在液氮中研磨100mg新鲜或-20℃冷冻的样品材料(注：样品要快速、充分研磨为粉末)；

②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1wt％)，迅速颠倒混匀后，将离心管在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

③加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；注：若提取富含多糖或淀粉的植物组织，可在第③步前，用酚：氯仿(体积比1：1)进行等体积抽提；

④将所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀；

⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12000rpm离心30s，弃掉废液；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液；

⑦向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；

⑧重复步骤⑦；

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；

⑩将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50～200μL洗脱缓冲液TE(pH值在7.0～8.5之间)，室温放置2～5min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。

实施例2SSR引物设计

从FASTA文件(Asp.misa)中选择SSR重复序列，利用BactchPrimer 3v1.0软件(https：//wheat.pw.usda.gov/GG3/)根据每个SSR位点的侧翼区域(约600bp)设计引物。引物的不同参数为：最佳产物长度为150～300bp，寡核苷酸引物长度为18～23bp，退火温度为55℃～65℃，GC含量为35％～60％。

实施例3SSR引物PCR检测

利用上述引物进行PCR，步骤如下：

(1)采用实施例1所述的方法对24个品种拟叶进行基因组DNA的提取；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用实施例2中引物组进行普通PCR，制得PCR产物；

(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行凝胶电泳检测，观察条带特异性。

PCR的反应体系为20μL，组分如下：

2x NG PCRMaster Mix(Takara)10μL，正向引物0.2μg，反向引物0.2μg，DNA模板50-100ng，加入ddH₂O至总体积20μL。

PCR的反应程序为：

a.94℃预变性2min；

b.94℃变性30s；

c.50-56℃(根据引物序列确定)退火30s

d.72℃延伸30s

b-d 30个循环；

e.72℃延伸5min。

对PCR产物在8.0％(g/mL)聚丙烯酰胺凝胶上分离，电压160V，时间80min，电泳仪为六一仪器厂的DYY-6C型号，电泳槽为HT-SCZ04型号垂直电泳槽，电泳完后用银染法洗条带显色，最后在观片灯下用高清单反照相机拍照相并保存图片。

实施例4分子身份证构建方法

对120对SSR引物在24个芦笋品种中进行PCR扩增，发现25个SSRs具有多态性。其中仅3对SSR引物(表1)的17个多态性位点就可以对24个栽培品种进行区分鉴定。Asp-SSR-2-C6位于6号染色体上，为二核苷酸SSR标记，可以扩增到5个不同等位基因，其大小依次为255bp，246bp，240bp，233bp和227bp，能够区分12个品种，包括UC157，沃克先锋(Walkerpioneer)，阿波罗(Apollo)，千禧(Guelpin millennium)，阿根特伊(Argenteuil)，冠军(Champion)，硕丰(Shuofeng)，京绿2(Jinglv 2)，京科2(Jingke 2)，京科3(Jingke3)，浙丰1(Zhefeng 1)和航育1(Hangyu 1)(图1)。Asp-SSR3C10位于10号染色体上，为三核苷酸SSR标记，其引物共扩增出8个等位基因，其大小依次为180bp，172bp，164bp，157bp，149bp，142bp，132bp和125bp，可同时鉴定13个品种，包括UC157，格兰德(Grande)，沃克先锋，紫色激情(Purple passion)，冠军，京绿1(Jinglv 1)，京绿2，京绿3，京绿4，东芝1(Toshima 1)，东芝2(Toshima 2)，航育6和浙丰801(图1)。Asp-SSR6C4位于4号染色体上，为6核苷酸SSR标记，其引物对扩增产生4个等位基因，其大小依次为170bp，159bp，147bp和130bp，可同时鉴定10个品种，包括UC157，格兰德，沃克卓越(Walker nobility)，沃克先锋，阿特拉斯，紫色激情，硕丰，京绿1(Jinglv1)，京绿2和京科1(Jingke 1)(图1)。这3个引物同时使用可以对试验的24个栽培品种进行鉴别。在利用这3对引物构建芦笋的分子身份证时，将电泳图谱上清晰可见带型，根据扩增的目的基因从大到小依次编排第一位点、第二位点、第三位点等，再根据位点带的有无进行标记，无条带记为“0”，有条带记为“1”。最后按照引物Asp-SSR2C6、Asp-SSR3C10、Asp-SSR6C4固定排列顺序串联形成一组引物对应的转换数据(表2)，也就是该品种的分子身份证。

表1本发明鉴定的多态性SSR的多态信息含量、引物信息和重复序列

表2基于Asp-SSR2C6、Asp-SSR3C10和Asp-SSR6C4三个多态性SSR标记获得的17个等位位点，使用0(缺失)和1(存在)序列对24份芦笋材料进行了DNA分子身份证分析

注：每个SSR的编码代表：芦笋SSR标记、重复基序类型和染色体在基因组中的位置。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 山东省农业科学院

<120> 基于SSR标记构建芦笋分子身份证的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaacaatg tcacgaggac t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attatgatgg gaagacccta a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacattagg ggtttcttac a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagggaaaa tctaagggat a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaagatcaa ggtgaagaag a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaaggctcc atacaaatc 19

Claims

1.一种用于鉴别芦笋品种的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记包括Asp-SSR6C4、Asp-SSR2C6和Asp-SSR3C10，所述Asp-SSR6C4通过如SEQ ID NO：1-2所示引物对扩增得到，所述Asp-SSR2C6通过如SEQ ID NO：3-4所示引物对扩增得到，所述Asp-SSR3C10通过如SEQ ID NO：5-6所示引物对扩增得到。

2.一种用于鉴别芦笋的引物组合，其特征在于，包括3对引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-6所示。

3.一种用于鉴别芦笋品种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所示的引物组合。

4.一种芦笋品种分子身份证的构建方法，其特征在于，包括：采集不同品种的芦笋，利用权利要求2所述的引物组合对不同品种的芦笋的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果构建所述芦笋分子身份证。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述芦笋的品种包括：UC157、格兰德、沃克卓越、沃克先锋、阿特拉斯、阿波罗、千禧、阿根特伊、紫色激情、冠军、硕丰、京绿1、京绿2、京绿3、京绿4、京科1、京科2、京科3、浙丰1、东芝1、东芝2、航育1、航育6和浙丰801。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：2xNG PCRMaster Mix 10μL，正向引物0.2μg，反向引物0.2μg，DNA模板50-100ng，加入ddH₂O至总体积20μL。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s；50-56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

8.一种如权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在获取芦笋分子身份证中的应用。

9.一种如权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴别芦笋品种中的应用。