CN107034292A

CN107034292A - 白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用

Info

Publication number: CN107034292A
Application number: CN201710388910.5A
Authority: CN
Inventors: 冯辉; 王楠; 刘志勇; 章云; 李承彧; 冀瑞琴; 王玉刚; 黄胜楠
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-08-11
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107034292B

Abstract

本发明公开了白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用。本发明提供了indel片段在检测或辅助检测待测白菜的持绿表型中的应用；或indel片段在检测或辅助检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用；所述indel片段为如下1)或2)或3)：1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。该indel分子标记在白菜持绿性状鉴别上具有较重要的使用价值，可有效运用于白菜分子辅助选择育种。

Description

白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用。

背景技术

持绿性是指植株衰老后，叶片仍保持绿色而不变黄的性状，对于以叶片为产品器官的白菜具有特殊重要的意义。

持绿在自然界中普遍存在，在作物中具体表现为，在干旱、高温等环境条件下，作物在籽粒灌浆期或生育晚期，其叶片能够保持较长时间的绿色并且能够进行光合作用；在一些模式植物中，持绿主要表现为叶片光合功能丧失，叶片中的叶绿素不降解或者降解过程受阻，植物的叶片、果皮、果荚、种皮等部位表现持绿。持绿突变体是研究叶绿素代谢、植物衰老进程、植物应对激素响应、植物抗逆性(抗旱,盐胁迫,耐高温等)等一系列生理代谢过程的理想材料(田风霞等,2010)。对农作物中的功能性持绿突变体进行研究，有助于发现和鉴定一些抗性(抗旱,抗高温和抗病等)新品种，可以丰富作物抗逆基因资源，对于作物遗传育种和品种改良具有重要意义。研究模式植物中非功能性持绿突变体的持绿机理，可以发现参与叶绿素分解代谢过程的新酶及相关酶的催化特性，同时有助于揭示叶绿素降解新途径。

目前，有研究获得具有持绿性的白菜育种材料，由于该材料的持绿性状在生育后期植株衰老时才表现，开发与该持绿性状紧密连锁的分子标记，对于实现在苗期进行鉴定选择有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供indel片段的应用。

本发明提供了indel片段在检测或辅助检测待测白菜的持绿表型中的应用；

或indel片段在检测或辅助检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段,若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中不是均含有indel片段，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

上述方法中，所述检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)用扩增所述indel片段的引物对扩增，电泳检测扩增产物，若PCR扩增产物仅含有465-475bp(实施例为471bp)的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，若不是仅含有465-475bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段。

上述方法中，所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所述的单链DNA分子组成。

本发明第3个目的是提供一种选育持绿表型白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中均含有indel片段的白菜，得到持绿表型白菜；

本发明第4个目的是提供本发明提供了一种选育非持绿表型白菜的方法。

本发明提供的一种选育非持绿表型白菜的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段的白菜，得到非持绿表型白菜。

本分目的5个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；

本发明第6个目的是提供检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质的用途。

本发明提供了检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质在检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用。

上述应用中，所述检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质为所述扩增所述indel片段的引物对或含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。

本发明第7个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的产品。

本发明提供的产品，为检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质。

上述产品中，所述物质为引物对或含有引物对的试剂或含有引物对的试剂盒；

所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所述的单链DNA分子组成。

本发明第8个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述物质对所述待测白菜的基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若PCR扩增产物仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若PCR扩增产物不是仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜。

上述中，所述待测白菜为持绿表型亲本或非持绿表型亲本或者二者杂交后代。

含持绿基因Brnye1的白菜自交系‘13A516’于2017年4月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为CGMCC NO.13795，分类命名为Brassica campestrisspp.pekinensis.

本发明的实验证明，本发明发现了位于编码白菜不黄化蛋白基因Brnye1/Bra019346的外显子区内存在的1个与白菜持绿性连锁的Indel标记，通过对该共显性PCR特异性引物的扩增，可得到变异位点的序列信息，鉴定材料持绿与否以及纯合与否，可用于持绿性育种材料的辅助选择。该indel分子标记在白菜持绿性状鉴别上具有较重要的使用价值，可有效运用于白菜分子辅助选择育种。目前由于持绿性状在白菜生育后期才有明显表现，表型观察判断费工费时，该indel分子标记及其检测方法替代生育末期以表型观察判断的方法，使得筛选可以在苗期和室内进行，可用于大规模筛选育种材料，加快育种进程。

附图说明

图1为持绿基因Brnye1初步定位结果。

图2为持绿基因Brnye1/Bra019346在持绿性和非持绿性材料中基因表达结果。

图3为持绿性材料和非持绿性材料PCR扩增序列比对及Indel标记；

其中，Bra019346为大白菜数据库参考基因序列；13A516为持绿亲本基因序列；13A510为非持绿亲本基因序列。

图4为IndelGFL在亲本及F₂代个体上的扩增结果；

其中，P₁:非持绿亲本自交系13A510

P₂:持绿亲本自交系13A516

M：为D2000DNA Maker，共有6条条带，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，扩增产物对应的条带为431bp，471bp。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、白菜持绿性基因Brnye1及其indel标记的获得

一、分离群体的构建及遗传分析

以含持绿基因Brnye1的白菜自交系‘13A516’为母本，非持绿白菜自交系‘13A510’(日本武藏野公司品种华冠)为父本杂交得到F₁，即为正交，再配制反交组合，即‘13A510’×‘13A516’，植株全部种植于沈阳农业大学遗传育种温室基地。正反交所得F₁代植株表型全部为非持绿。表明其持绿性状受隐性核基因控制。选择正交得到的5株F₁植株自交构建F₂代作图群体，并分别与父母本进行回交，经调查F2代及回交群体表型，发现73株F₁×‘13A510’后代均表现为非持绿性状，而F₁×‘13A516’后代中，47株表现为非持绿，42株表现为持绿，分离比例符合孟德尔1:1分离比率(χ2＝0.18<χ2_0.05＝3.84)。播种正交F1代自交后的F₂代作图群体数为14870株，在播种的全部F₂群体中，非持绿8964株，3058表现为持绿，符合孟德尔3:1分离比(χ2＝1.13<χ2_0.05＝3.84)。由此，得出结论：持绿突变性状是由一对隐性核基因控制。采用BSA-seq技术，即BSA分池结合测序(sequencing)进行定位。在F₂代作图群体中选择持绿与非持绿典型极端表型的植株各25株，建立持绿与非持绿混池。剩余1000株表现典型的母本持绿表型的植株用于连锁分析。

二、DNA的提取及极端混池的构建

1、DNA的提取

a.称取0.2g白菜持绿与非持绿材料的幼嫩叶片加入灭菌处理的2.0ml离心管中，放入液氮速冻，同时用研磨棒研磨叶片至粉末；

b.立即向上述粉末中加入700ul CTAB裂解液(30g/L CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，)以及14uLβ-巯基乙醇，充分摇匀，放入65℃水浴锅中一小时，期间每隔20分钟，反转摇匀一次；

c.取出离心管，冷却至室温后再加入与CTAB等体积的700ul体积比为24:1的氯仿：异戊醇，充分颠倒摇晃3分钟，约300下；

d.常温离心(21-24℃)，12000rpm，5分钟；

e.事先先把无水乙醇放到-20℃冰箱里；

f.吸取450ul上清液入新的1.5ml已灭菌的离心管，加入2倍体积预先-20℃冷冻的无水乙醇，充分混匀，于-20℃静置0.5-1小时或-80℃静置8-10分钟；

g.常温离心，12000rpm离心10分钟；

h.弃上清液，加入1ml 70％乙醇(700ul无水乙醇+300ul灭菌超纯水)；

i.常温离心，12000rpm离心1分钟；

j.弃上清，室温放置至完全晾干；

k.加入50ul，1倍TE溶解或用100ul灭菌超纯水溶解，短暂离心收集。

2.DNA浓度的检测

(1).称取0.2g琼脂糖，量取2ml 10×TBE(硼酸缓冲液)，18ml蒸馏水，于三角瓶中混匀。

(2).用封口膜封口，于微波炉中加热30秒，充分溶解。

(3).在充分溶解并降温至50℃后的混合液中加入1ul 1mg/ml的EB。

(4).将混合液倒入胶盒中，插好梳子，赶走气泡，静置室温凝结。

(5).取1ul 10×Loading Buffer指示剂，与9ul DNA样混合，将混合液点入琼脂糖凝胶胶孔中。

(6).120V电压电泳20分钟，带的走向是负极向正极。

(7).取1ul DNA原液用酶标仪(Thermo，Germany)测定浓度及OD260/OD280，OD260/OD280比值小于1.8或大于2.0的进行重新纯化，将纯化后的DNA稀释到50ng/μL，-20℃保存备用。

3.混池的构建

选择F₂代中具有持绿极端表型的25份DNA，各等量吸取1μL于已灭菌的新1.5离心管中，吸打混匀，短暂离心收集，构建持绿混池；等量吸取1μL非持绿极端表型的25份DNA构建非持绿混池。

三、Brnye1基因的初步定位

采用BSA分池结合测序(BSA-seq)的方法，对持绿、非持绿亲本以及如前所述的两极端混池进行测序，所得reads经质控比对后，经SNP-index进行划窗分析，将Brnye1基因初步定位与白菜第3号染色体23M-26Mb范围内(如图1所示)。

四、分子标记的获得

根据BSA-seq初步定位及精细定位结果，定位区间内，Brnye1候选基因Bra019346功能注释信息为拟南芥叶绿体不黄化基因AtNYE1，AtNYE1是拟南芥持绿性状的决定基因；此外，Brnye1候选基因Bra019346在持绿材料与非持绿材料中的基因表达水平存在显著差异(如图2所示)，以上结果表明，Brnye1基因为白菜持绿性状的决定基因。

利用持绿与非持绿亲本材料在定位区间的重测序信息，结合Brassica_Database(http://brassicadb.org)参考基因序列对该区间进行比对，发现定位区间内3号染色体一处indel与持绿性状连锁。比较非持绿材料中该位点序列，在持绿材料中该位点有40bp的序列插入(如图3所示)。由此获得与持绿性状完全符合的indel片段，该片段的核苷酸序列为序列1(40bp的序列GAGAAATAGCTGCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA)。

自Brassica_Database(http://brassicadb.org)下载序列，利用Primer5.0软件，针对上述indel位点设计与白菜持绿基因Brnye1连锁的indel分子标记IndelGFL，IndelGFLF：5’-AGCCTTCAACACCTGACAAT-3’(上游引物序列2)。

IndelGFLR：5’-TCCACCAACGCTCCCA-3’(下游引物序列3)。该分子标记的扩增产物的为431bp(序列4)或471bp(序列5)，二者仅差序列1所示的40bp片段。

上述引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

分子标记扩增产物仅为471bp，基因型记做B基因型(2条同源染色体均含有indel片段)，表型为持绿；

分子标记的扩增产物仅为431bp，基因型记做A基因型(同源染色体均不含有indel片段)，表型为非持绿；

分子标记扩增产物为431bp和471bp，基因型记做H基因型(1条同源染色体含有indel片段，且另一条不含有indel片段)，表型为非持绿。

五、分子标记鉴定白菜是否持绿表型的方法

为了验证分子标记的可靠性，对父本13A510，母本13A516及二者杂交得到F1代的自交后代F₂代150株(已经鉴定出是否为持绿株系)个体进行了检测，检查IndelGFL分子标记的两种基因型(A代表母本带型，持绿基因纯合型，B代表父本非持绿基因纯合型，H代表杂合基因型)在150个F₂群体中的分布情况。

1、基因组DNA的提取

提取待测样本：父本、母本及F₂代150株的基因组DNA。

2、PCR扩增

以上述各株基因组DNA为模板，用上述四获得的分子标记IndelGFL中的IndelGFLF和IndelGFLR进行PCR扩增，扩增条件和体系如下：

a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为：25ng基因组DNA；0.5μmolIndelGFLF 0.5μL；0.5μmol IndelGFLR 0.5μL；2.5mM dNTP 0.8μL；10×PCR Buffer1μL；Taq DNA polymerase 0.5U；ddH2O补至10μL，吸打混匀，离心；

b.扩增程序：预变性95℃/5min；95℃/30s；56℃/30s；72℃/1min；35个循环后；72℃延伸5min；最后4℃保存。

3、电泳检测扩增产物

将10uL上述PCR扩增产物与5uL的溴酚兰变性Buffer(980ml/L formamide，3.72g/L EDTA，2.5g/L bromphenol blue，2.5g/L xylene cyanol)混匀，95℃变性5min，7uL上样量点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，电泳结束后，进行银染。经银染后读带判断。其中，银染包括：①固定，1L蒸馏水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸混合液中固定7min；②染色，1L蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛混合液中染色10min；③漂洗，用1L蒸馏水漂洗3-4秒；④显影，最后于1L蒸馏水+15g氢氧化钠+2ml甲醛中显影10min。

部分电泳结果如图4所示。

统计结果如表1所示，可以看出，

35份待测样本PCR扩增产物大小为471bp,为B基因型，2条同源染色体均含有indel片段，其中32份为持绿表型，3份为非持绿表型，鉴定表型准确率为91％；

85份待测样本PCR扩增产物大小为431bp,为A基因型，2条同源染色体均不含有indel片段，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％；

30份待测样本PCR扩增产物大小为431bp和471bp,为H基因型，1条同源染色体含有indel片段，另一条同源染色体不含有indel片段，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％。

上述结果表明，该IndelGFL分子标记或其对应的indel片段可用于辅助检测待测白菜是否为持绿株系，检测方法如下：

检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段(序列1),若两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，则待测白菜为候选为持绿白菜，若两条同源染色体的基因组中不是均含有indel片段，则待测白菜为或候选为非持绿白菜。

检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段(序列1)的方法为用IndelGFL分子标记扩增待测白菜的基因组DNA，若PCR扩增产物仅含有471bp的产物(序列5)，则待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，若PCR扩增产物不是仅含有471bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段。

表1为IndelGFL在F2群体中的鉴定和验证

实施例2、白菜持绿性基因Brnye1的indel片段在辅助选择中的应用

1、基因组DNA的提取

按照实施例1的五的1方法提取部分F2代单株基因组DNA。

2、PCR扩增

按照实施例1的五的2方法用Indel标记中的IndelGFLF和IndelGFLR对基因组DNA进行PCR扩增。

3、电泳检测扩增产物

按照实施例1的五的3方法对上述PCR扩增产物进行电泳检测。

若PCR扩增产物中仅含有471bp的扩增产物，则两条同源染色体均含有indel片段，则待测样本为或候选为持绿白菜，若PCR扩增产物中不仅含有471bp的扩增产物，则两条同源染色体不是均含有indel片段，则待测样本为或候选为非持绿白菜；

结果如表2所示，

表2

上述结果表明，该Indel标记可有效运用于白菜分子辅助选择育种。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120>白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gagaaatagc tgcttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agccttcaac acctgacaat 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tccaccaacg ctccca 16

<210> 4

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

agccttcaac acctgacaat taacattttg taatgaaacc aagaaacaaa taaataatta 60

ttttattttt tacttacaac aggtagttct ttggaaaaga tgtagtatcg taactttggg 120

aagagatcta agaggaaatg gccaccgcta atgtggcagt ggacgtgaag agacatgtcc 180

cctttcactt tcttccattc tgctaccact tcatctctgt atagcctatt tgcccatcct 240

tccaactata atataacata aatctataca catcagcctc tatattttct aaaaccgttc 300

ttcagtggca ctcagaaacg tatagacgca tacatacctg agagttgtta atagagtgag 360

aaatagctaa ggttagttta gctgtaatgt cactgtgagt gagagtatac gttcttggga 420

gcgttggtgg a 431

<210> 5

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

agccttcaac acctgacaat taacattttg taatgaaacc aagaaacaaa taaataatta 60

ttttattttt tacttacaac aggtagttct ttggaaaaga tgtagtatcg taactttggg 120

aagagatcta agaggaaatg gccaccgcta atgtggcagt ggacgtgaag agacatgtcc 180

cctttcactt tcttccattc tgctaccact tcatctctgt atagcctatt tgcccatcct 240

tccaactata atataacata aatctataca catcagcctc tatattttct aaaaccgttc 300

ttcagtggca ctcagaaacg tatagacgca tacatacctg agagttgtta atagagtgag 360

agagaaatag ctgcttcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaatagctaa ggttagttta 420

gctgtaatgt cactgtgagt gagagtatac gttcttggga gcgttggtgg a 471

Claims

1.indel片段在检测或辅助检测待测白菜的持绿表型中的应用；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

2.一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法，包括如下步骤：检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段,若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中不是均含有indel片段，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)用扩增所述indel片段的引物对扩增，电泳检测扩增产物，若PCR扩增产物仅含有465-475bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，若不是仅含有465-475bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段；

或所述扩增所述indel片段的引物对具体由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所述的单链DNA分子组成。

4.一种选育持绿表型白菜的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中均含有indel片段的白菜，得到持绿表型白菜；

或一种选育非持绿表型白菜的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段的白菜，得到非持绿表型白菜。

5.一种DNA片段，为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

6.检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质在检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用。

7.一种检测待测白菜是否为持绿白菜的产品，为检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述物质为引物对或含有引物对的试剂或含有引物对的试剂盒；

9.一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法，包括如下步骤：用权利要求8中所述物质对所述待测白菜的基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若PCR扩增产物仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若PCR扩增产物不是仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜。

10.根据权利要求1或6所述的应用或权利要求2-4或9所述的方法或权利要求7或8所述产品，其特征在于：所述待测白菜为持绿表型亲本或非持绿表型亲本或者二者杂交后代。